1 引言
近年來，隨著抗生素的大量使用，其在環境介質中的殘留已引起人們廣泛關注.雖然所檢出的抗生素殘留濃度水平未達到致死濃度，不足以抑制或者殺死微生物，但由于這些物質大多數仍具有較強的生物反應活性和富集放大效應，當達到最低抑菌濃度水平時，可能會促進耐藥菌的發展和傳播，已有研究表明，長期施用含有四環素的豬糞是環境中具有抗藥性致病菌的重要來源，同時，也是促進其生成的主要推力.更為重要的是，耐藥菌所攜帶的耐藥基因可以長期存在于土壤和水生細菌，甚至可能會傳遞至致病性更強的細菌，對人類健康造成極大威脅，因此，環境中抗生素的環境后效應以及生態效應成為近年環境領域的研究熱點之一.紅霉素(Erythromycin，ERY)是一類大環內酯類廣譜抗生素，具有強大的微生物抑制作用.人們已在污水、水源水和飲用水中檢測到ng · L-1~μg · L-1濃度的紅霉素污染.同時，殘留在自然水體中的抗生素有75%沉積在水底沉積物中，可形成水體底泥的抗生素蓄積性污染，進而對底泥微生態造成影響，甚至誘導生物群體對紅霉素產生耐藥性.耐藥菌的存在不僅可加劇殘留抗生素的環境影響，更為重要的是能大大降低抗生素藥物生物抑制的有效性.目前，針對紅霉素耐藥性方面的研究大多側重于研究某單一菌種的耐藥行為以及紅霉素對土著微生物群落結構的影響，鮮有關于耐紅霉素菌群多樣性的研究，而關于耐藥菌群的研究也大多集中在磺胺類和四環素類.等抗生素.作為一種環境殘留率較高且廣泛使用的抗生素，研究環境中紅霉素耐受菌群的結構特點，不僅有助于人們正確評價紅霉素的生態風險，而且可為紅霉素藥物污染的防治提供理論依據.
2 材料與方法
2.1 主要試劑及儀器
紅霉素購自廣州華奇盛生物科技公司.配置100 μg · mL-1脫水紅霉素母液(用3 mol · L-1 H2SO4調節紅霉素溶液的pH值到3.0，在室溫下攪拌4 h)，4 ℃避光保存.
營養肉湯培養基：10 g蛋白胨，5 g牛肉膏，5 g NaCl，1 L蒸餾水，調pH為7.0，固體培養基加20%的瓊脂粉.
其他生化試劑包括：細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)，購自天根生化科技(北京)有限公司;Taq DNA聚合酶連接酶(BioReadyTaq Mix)，購自杭州博日科技有限公司;UNIQ-10柱式膠回收試劑盒，T-載體PCR產物克隆試劑盒，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司.相關引物合成，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成.
主要儀器：紫外分光光度計(島津UV-2550)，PCR儀(Bio-Rad S 1000TM Thermal Cycler);電泳儀(Bio-Rad PowerPac Basic);小型臺式離心機(LabogeneScanSpeed mini).
2.2 樣品采集
底泥樣品采自長期受低濃度紅霉素污染的模擬水生生態系統，該系統的構建參考美國環保署的標準方法.向室內靜水養殖箱(80 cm×60 cm×40 cm)內加入約20 kg的沉積物和60 L水，植入水蘊草和斑馬魚.實驗期間室內溫度控制在(30±2)℃，pH值控制在7.0±0.2、溶氧> 4 mg · L-1.系統穩定后，每天向系統內加入2.5 μg · L-1脫水紅霉素溶液，持續運行1年時間，采集底泥樣品進行分析.
2.3 實驗方法
2.3.1 可培養耐紅霉素細菌的培養和計數
分別取3份1.5 g新鮮底泥分別加入含有150 mL無菌水的三角瓶中，搖床振蕩3 h，制備成菌懸液，然后分別吸取適量，進行混合.采用平板菌落計數法，取適量混合均勻的菌懸液進行梯度稀釋后，分別涂布在制備好的紅霉素終濃度為16 μg · mL-1的營養肉湯固體培養基上，每一濃度均設置3個重復，30 ℃培養48 h，進行抗性細菌計數.
2.3.2 可培養耐紅霉素菌的分離與鑒定
選取2.3.1節中稀釋度適當的平板挑取單菌落，分別在30 ℃，150 r · min-1進行液體培養24 h，再稀釋至適當濃度進行涂布，重復3~4次，直至平板上只生長單一菌落.
提取純菌的細菌基因組DNA，利用細菌通用引物27F和1492R進行PCR擴增，PCR產物的純化及測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成.
2.3.3 樣品總DNA的提取
將2.3.1節中的菌懸液取適量加入到已滅菌的含有16 μg · mL-1紅霉素的營養肉湯培養基中，150 r · min-1，30 ℃過夜培養后提取基因組DNA，得到的DNA樣品為底泥中耐紅霉素微生物的總DNA.
2.3.4 PCR擴增
PCR擴增引物：27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)及1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′).
PCR反應體系(25 μL)：DNA模板1 μL，ddH2O 10.5 μL，引物27F和1492R各0.5 μL，Taq酶12.5 μL.
PCR程序：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存.
將PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳檢驗后進行切膠回收，用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒純化進行純化.
2.3.5 克隆文庫的構建
利用細菌通用引物27F及1492R對樣品DNA進行PCR擴增.將純化后的PCR產物用pUCm-T載體進行目的基因連接，然后將其轉入大腸桿菌DH5α感受態中，37 ℃振蕩培養1 h;完后將其涂在含有IPTG和X-gal的氨芐青霉素培養基平板上，37 ℃恒溫培養過夜后挑取白色的陽性克隆子，再用相同的方法進行培養;利用PstI 單酶切進行陽性克隆驗證.驗證后的陽性克隆子測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成.測序結果通過CD-hit軟件基于序列相似度進行聚類分析，劃分操作分類單元(Operational Taxonomic Unit，OTU);使用Estimate軟件繪制微生物稀有性曲線.利用稀有性曲線和文庫覆蓋率C評價文庫，文庫覆蓋率C計算公式為
式中，N代表陽性克隆子總數，n1代表僅含單個克隆子的數量.
所有測序結果在GenBank數據庫進行Blast比對后下載同源性序列，系統發育樹的繪制借助MEGA5.0軟件完成.
3 結果與討論
3.1 可培養耐紅霉素細菌的計數與分離鑒定
根據抗菌藥物敏感性實驗執行標準，紅霉素的最低抑菌濃度(MIC)為8 μg · mL-1，本研究選擇略高于其MIC值的抗生素濃度，即紅霉素的終濃度為16 μg · mL-1.利用平板菌落計數法對抗性細菌的計數結果為9.86×108 CFU · g-1.將平板上形態各異的耐藥菌株進行反復純化分離后，得到了3株獨立的菌株，其各自的形態如表 1中所示.
表1 可培養耐紅霉素菌菌落形態
分別將3株菌株的16S rDNA序列在NCBI核酸數據庫中進行BLAST同源性比對，確定與其最接近的種系群體.結合各菌株形態學特征及16S rDNA 序列分析，初步鑒定為賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp.)、土壤芽孢桿菌(Solibacillus silvestris)以及蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，各自在GenBank中的登錄號分為KP694229、KP694230、KP694231，且上述3種可培養菌均屬于芽孢桿菌綱.需要注意的是，蠟樣芽孢桿菌在自然界分布廣泛，是一種食源性致病菌，容易引起食物中毒，對紅霉素極度敏感，對青霉素耐藥.然而，本文的耐藥實驗發現，從底泥中分離出的蠟樣芽孢桿菌GD2C對紅霉素已表現出一定的耐藥性，這可能是菌株分離自長期受低濃度紅霉素污染的環境，這意味著低濃度紅霉素的誘導作用可使蠟樣芽孢桿菌具備一定的耐藥性.
3.2 16S rDNA克隆文庫的分析
隨機挑取83個陽性克隆子進行測序(序列長均為1500 bp左右)，將測序結果在NCBI的核酸數據庫中進行Blast比對，將序列比對結果相似度大于等于97%的定義為一個操作單元(Operational Taxonomic Unit，OTU)，共得到6個OTU，其中有2個OTU類型代表單克隆，最多的OTU類型包括36個克隆子.隨后以文庫覆蓋率C及稀有性曲線來評價所構建的文庫，發現該文庫覆蓋率為97.6%，且稀有性曲線趨于平緩，這意味著所構建的克隆文庫庫容較大，所挑取的克隆子數量能夠較為完整的反映樣品中微生物的多樣性.上述兩項分析表明該克隆文庫所含83個克隆子能夠較全面地反映底泥中耐紅霉素細菌種群結構的多樣性.
圖1 底泥中耐紅霉素細菌16S rDNA克隆文庫的稀缺性曲線
樣品中16S rDNA克隆文庫結果如表 2所示，其中4個OTU的克隆子序列與NCBI核酸數據庫中已知細菌的16S rDNA序列相似度在97%以上，2個OTU的相似度低于97%.由比對結果可知，長期受低濃度紅霉素污染的底泥中，耐紅霉素的細菌類群可分為三大類群，即：未獲培養細菌(Uncultured bacterium)、芽孢桿菌綱細菌(Bacilli)和梭菌綱細菌(Clostridia)，各涉及到2個OTU(54個克隆子)、3個OTU(28個克隆子)和1個OTU(1個克隆子).底泥樣品中耐紅霉素微生物中的優勢菌群為某種未獲培養的細菌，在文庫中占43.37%，其次是蘇云金芽孢桿菌，占文庫的24.10%.
表2 底泥中耐紅霉素細菌16S rDNA克隆文庫結果
蘇云金芽孢桿菌是一種有益桿菌，多用做殺蟲劑，目前對于其耐藥性的報道較少，但從文庫結果來看，蘇云金芽孢桿菌已對紅霉素產生了一定的耐藥性;另外，紅霉素原本對梭狀芽孢桿菌有較強的抑制作用，在本研究中也表現出了一定的耐藥性，這可能也是因為環境中殘留的低濃度紅霉素對其誘導，使其對紅霉素產生了一定的抗性，這也進一步說明了環境中殘留抗生素存在潛在影響.由克隆文庫結果可以看出，在已知菌屬中，芽孢桿菌屬所占比例最大，這與上述所篩選分離出的可培養的耐藥菌均為芽孢桿菌屬細菌的結果是互相吻合的.
另外，構建的16S rDNA文庫中有25.3%(21個克隆子)的細菌與GenBank中已知細菌的16S rDNA序列同源性低于97%，而在序列同源性研究中，一般認為細菌16S rDNA序列同源性低于97%即屬于不同的種，這說明底泥中蘊藏著許多未知的耐藥細菌，有待于進一步深入研究.
3.3 底泥樣品16S rDNA系統發育分析
分子系統發育分析，特別是對細菌16S rDNA基因的同源性進行分析有助于了解微生物群落結構的多樣性.將表 1和表 2中的3株單菌和6個OTU的堿基序列及其相應的同源性序列進行聚類分析后，以嗜熱鏈球菌Streptococcus thermophilus(NR042778)為外類群，繪制出底泥中耐紅霉素細菌系統發育樹，見圖 2.
由圖 2可見，土壤芽孢桿菌GD2B的堿基序列與OTU4的堿基序列之間相似度較高，且與OTU1存在較好的親緣關系.因而將OTU1和OTU4的序列進一步在RDP數據庫中進行比對，發現其最大相似菌株Uncultured bacterium clone(DQ337010)和Uncultured bacterium clone(AB506332)可以進一步劃分到某未分類的動性球菌屬(Unclassified Planococcaceae)，而土壤芽孢桿菌和動性球菌屬均屬于動球菌科(Planococcaceae)，所以OTU1、GD2B以及OTU4在系統發育樹中聚集到一起.蠟樣芽孢桿菌GD2C與OTU5的最大相似菌株蘇云金芽孢桿菌存在較好的親緣關系，這是由于蘇云金芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌均屬于蠟樣桿菌屬，兩者之間具有高度的同源性.
圖2 底泥中耐紅霉素細菌系統發育樹
紅霉素作為第一代大環內酯類抗生素，自1952年應用于臨床以來，一直被人們長時間大劑量使用，使得多種原本敏感的微生物對其產生了抗性(李喆宇等，2013)，比如肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌等.而本研究發現的芽孢桿菌，相關報道尚不多見.于雅瓊等(2007)發現，分離自土壤、飼料和肥料的芽孢桿菌對大環內酯類抗生素表現出一定的敏感性.本研究顯示，經過為期1年的低濃度紅霉素脅迫，芽孢桿菌對紅霉素已表現出一定的耐藥性，3株可培養的紅霉素耐藥菌及紅霉素耐藥菌克隆文庫中有33.73%均屬于芽孢桿菌.這可能是由于：①不同劑量使用大環內酯類藥物，在機體內存在誘導出耐藥株的可能性(劉禧杰，2008);②微生物細胞可以通過基因的水平轉移或者可移動遺傳因子獲得抵抗力(李晶，2013)，通過抗性基因的水平轉移獲得耐受紅霉素基因，從而獲得對紅霉素的抵抗力.當細菌具有抗生素抗性后，可能會對細菌代謝產生特定的改變(如抗重金屬污染等特性)，甚至可使細菌在某些環境中更具有生存優勢;而存在于基因轉移單位的抗性基因，則可以自我復制，從而一直存在于微生物群落里(楊穎，2010)，這必將引發巨大的潛在危害，并威脅到環境及人類健康.具體參見污水寶商城資料或http://www.dongaorq.cn更多相關技術文檔。
4 結論
1)用傳統方法從底泥中篩選出的3株芽孢桿菌綱耐紅霉素菌株，結合各菌株形態學特征及16S rDNA序列分析，初步鑒定為賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillus sp.)、土壤芽孢桿菌(Solibacillus silvestris)以及蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus).其中原本對紅霉素極度敏感的蠟樣芽孢桿菌，由于低濃度紅霉素的馴化，對紅霉素產生了一定的耐藥性.
2)長期受低濃度紅霉素污染的底泥中，耐紅霉素的細菌類群分三大類群，即：未獲培養的細菌、芽孢桿菌綱和梭狀芽孢桿菌綱.其中未獲培養的細菌在整個文庫中比例最大，可培養的耐藥菌的優勢類群為芽孢桿菌綱.結合系統發育樹的分析，發現所占比例最大的某未獲培養的細菌為某種未分類的動性球菌(43.37%)，可初步劃分到芽孢桿菌綱(Bacilli)，尚需更多地分類鑒定.在16S rDNA克隆文庫中，有25.3%的細菌與GenBank中已知細菌的序列同源性低于97%，這說明底泥中蘊藏著許多未知的耐藥細菌，有待于進一步深入研究.
3)通過對16S rDNA文庫研究發現，對紅霉素具有一定耐藥性的細菌既有致病菌(例如蠟樣芽孢桿菌)，也有有益菌(例如蘇云金桿菌).隨著各種抗生素使用量的增加，一方面，使得原本對抗生素有一定敏感度的致病菌表現出了一定的耐藥性，對疾病的防治加大了難度;另一方面，也使得環境中某些有益菌獲得了一定的耐藥性，使其可以更好的生存.在抗生素污染問題越來越嚴重的今天，有益的芽孢桿菌的應用研究，可能是解決抗生素問題的一個有效方案.
