在當今環境污染中，水體污染已嚴重威脅著社會發展與人類健康，成為亟待解決的主要污染問題之一[1, 2]. 一直以來，金屬污染因其危害大、 治理難等特點成為工業廢水治理過程中的一大難題[3, 4]. 隨著冶金、 電鍍及核技術等的迅猛發展，水體重金屬污染中鈷元素污染也隨之而來. 當鈷離子濃度較高時會對植物產生毒害作用，危害人類健康. 目前的方法對于廢水中Co2+的去除比較困難，普遍采用的物理-化學處理方法效果不佳[5]. 因此，治理工業廢水中難處理、 高危害的金屬污染問題成為凈化廢水的重中之重.
傳統治理重金屬工業廢水的方法一般如化學沉淀、 溶劑萃取、 離子交換及膜分離等[6]. 這些技術由于金屬去除不完全、 昂貴的設備及大量的試劑和能量需求等原因而難以應用[5, 7]. 一種以具有替代不可再生資源潛力的微藻凈化為首的生物學方法，可克服傳統物理-化學方法缺陷成為金屬廢水污染凈化或恢復的研究熱點[8, 9]. 利用微藻處理工業廢水的同時，還可以固定CO2，生產生物燃料，這對緩解化石燃料短缺與改善水體環境都有重要意義[10]. 然而，前人研究表明通過傳統的液體懸浮培養藻類凈化富含金屬廢水，藻細胞生長受到抑制，生物產率較低[11]. 因此，尋求開發高效的微藻培養方式處理廢水具有重要意義.
相比于傳統液體懸浮培養，微藻的生物膜貼壁培養是一種新型培養模式. 不同的是，生物膜貼壁培養是根據光稀釋與固定化的原理，將藻細胞與培養基相分離，并固定在一定生物膜材料上，極少量的培養基液體通過附著多孔材料的背面或內部滴入以使藻細胞處于半干濕潤狀態，并在一定光照強度與CO2濃度下進行生長的培養方式(圖 1)，其在培養過程中的取樣和培養后的培養液回收均比傳統液體懸浮培養更為經濟、 簡便[12]. 前期對包括葡萄藻在內的多種藻類的生物膜貼壁培養進行了深入研究，其中葡萄藻可見光光能利用率最高可達14.9%，培養過程每生產1kg生物量所需培養基NaNO3僅為27.5g，生物產率和烴產率等也都優于傳統培養方式[13]. 貼壁培養因為藻細胞與培養基相分離，利用廢水進行微藻的生物膜貼壁培養，藻細胞培養完成后無需離心，具有一定優勢. 在生產生物燃料的同時耦合處理環境廢水，為工業廢水處理凈化提出新的嘗試.
圖 1 葡萄藻生物膜培養裝置示意
眾多微藻中，葡萄藻因能產生大量的烴類而聞名. 從生物能源替代化石能源的角度，烴類燃料比脂肪酸甲酯更接近于傳統化石燃料[14]. 而且葡萄藻生成的烴類燃燒后產熱值高且對大氣CO2含量無凈增加，是一種非常有潛力的可再生能源[15, 16]. Sawayama 等[17]用經過二次處理的生活污水(second treated sewage,STS)培養葡萄藻，發現生活污水中的氮和磷含量大大減少，而同時有毒重金屬元素砷、 鉻、 鎘等的濃度也大為降低. 本研究利用廢水培養葡萄藻可以凈化環境、 降低培養成本，以期為葡萄藻生物燃料生產奠定基礎.
本文結合貼壁培養反應裝置的特殊性及前人的實驗研究，主要考察了電鍍廠排放的含鈷工業廢水對葡萄藻貼壁培養生長及烴積累情況的影響，以期凈化工業水環境，在生產生物燃料的同時降低葡萄藻貼壁培養工藝成本.
1 材料與方法1.1 藻種來源與培養
藻株： A品系葡萄藻(Botryococcus braunii SAG 807-1，A race)購買于德國哥廷根大學.
葡萄藻種子液培養： 將培養至對數期葡萄藻接種于含Chu 13培養基的玻璃柱800 mL(高80 cm×直徑5 cm)中[13]，使其初始培養濃度約0.1 g·L-1，溫度(25±1) ℃，連續光照強度(100±10) μmol·(m2·s)-1，通入含有1%(體積分數)CO2的壓縮空氣(0.1 MPa)，氣體流速為1 mL·s-1，培養液的pH值約為7.5.
1.2 葡萄藻貼壁培養及生物量測定
葡萄藻的貼壁培養反應裝置如圖 2所示，一長0.4 m，寬0.2 m，厚3 mm的玻璃板置于0.5 m×0.3 m×0.05 m的玻璃腔中，玻璃板的一面附有濾紙，并接受正上方的光照. 將葡萄藻藻種接種到醋酸纖維素膜上，貼于附著在玻璃板的濾紙上，將附有藻種的玻璃板放入玻璃腔室內，為保障玻璃腔室內的穩定環境，用保鮮膜封住玻璃腔的一面. 二氧化碳混合氣通過玻璃腔的小孔進入培養室，培養基通過循環泵滴加(培養基循環使用). 為了培養液更好均勻地滲入藻細胞內，將玻璃培養腔放置一定傾斜角度，熒光燈置于培養腔正上方提供光源. 貼壁培養條件與種子液培養條件相同.
圖 2 葡萄藻貼壁培養實驗裝置
葡萄藻生物量測定： 將孔徑0.45 μm，面積0.001 m2的醋酸纖維膜煮沸3次后，在105℃ 烘箱中烘至恒重(W1)，將待測藻樣(DW)用蒸餾水沖洗完全入干凈燒杯中，并倒入抽濾裝置內抽濾至已稱重的膜上，將附有藻的膜放入105℃ 烘箱中烘至恒重(W2)，用分析天平稱量藻樣的重量(g·m-2)：
(1)
1.3 葡萄藻烴類的提取與分析
將葡萄藻溶液于2500 r·min-1離心8 min，洗滌離心3次后收集藻體，然后進行冷凍干燥. 稱取一定質量的干燥藻粉，加入正己烷超聲15 min，1500 r·min-1離心10 min后，收集正己烷提取液，提取過程重復3~4次，直到提取液無色，合并正己烷提取液，25℃ 水浴下旋轉蒸發掉正己烷，室溫下用氮氣吹干所剩殘余，稱其重量即為“粗烴”質量，計算后得到粗烴含量. 本研究中涉及到的“烴”如無特殊說明均指“粗烴”.
粗烴經硅膠柱(硅膠粒度200～300目，層析柱尺寸10 mm×100 mm，正己烷為流動相)純化，收集黃色條帶出來之前的所有樣品，25℃ 旋轉蒸發掉正己烷，氮氣吹干所剩殘余，稱重得到“純烴”質量，計算后得到純烴含量[18, 19]. 然后硅膠柱分別用氯仿和甲醇進行洗脫，分別收集洗脫后的樣品，旋轉蒸發、 氮氣吹干，稱重，即得非極性脂肪酸和極性脂肪酸含量[20].
GC/GC-MS 分析[21, 22]： 氣相色譜為安捷倫7890A，檢測器為 FID 檢測器，所得到的純烴溶于色譜純的正己烷中，色譜柱為Agilent HP-5-二苯基聚硅氧烷共聚物色譜柱(30 m×0.25 id)，進樣口溫度240℃，檢測器溫度250℃; 初始溫度130℃ (5 min)，然后以8℃·min-1 的速度升到200℃ (2 min)，再以5℃·min-1的速度升到280℃ (20 min). 質譜條件： 電子能量70 eV，質荷比m/z范圍40～600，結果鑒定對比已報道譜圖.
1.4 葡萄藻貼壁培養基中N濃度與Co2+濃度的測定
葡萄藻貼壁培養液中氮含量的測定方法參照Collos等[23]的實驗研究. 準確量取2 mL培養液，10000 r·min-1下離心5 min，收集上清液在220 nm下分光光度計測定，氮的濃度參照以下公式：
(2)
式中,c是氮濃度(mmol·L-1).
葡萄藻貼壁培養液中鈷濃度的測定參照Wang等[24]的離子色譜法.
1.5 工業廢水應用于葡萄藻的貼壁培養
將葡萄藻種子液培養14 d后，在溫度(25±1) ℃，連續光照強度(100±10) μmol·(m2·s)-1，1% (體積分數)CO2條件下接種于二次工業廢水中(由青島黃島廢水處理廠提供)，培養8 d后，研究葡萄藻貼壁培養生長及烴類積累情況.
1.6 統計分析和數學計算
本實驗中，多組數據間差異顯著性分析利用 SPSS 11.0(SPSS Inc.,Chicago,Illinois,USA)的方差分析(ANOVA)程序完成，當 P<0.05 時表示差異顯著. 實驗中，曲線作圖及擬合用 Sigmaplot 8.0(SPSS Inc.,Chicago,Illinois,USA)完成.
2 結果與討論
2.1 工業廢水貼壁培養葡萄藻
本研究首先將青島黃島廢水處理廠提供的二次工業廢水與正常Chu 13培養基在相同條件下貼壁培養，其中工業廢水各主要參數指標見表 1. 相比于正常Chu13培養基，工業廢水培養基(表 1)中Co2+濃度為0.86 mg·L-1，明顯高于正常Chu 13培養基中Co2+濃度(約為0.09 mg·L-1).
表 1 工業廢水各主要參數指標
實驗研究工業廢水與正常培養基下貼壁培養葡萄藻生長與烴積累情況. 由圖 3(a)與3(b)可知，葡萄藻在工業廢水及正常Chu 13培養基下長勢相當，培養8 d后工業廢水貼壁培養葡萄藻生長狀況略優于正常培養基下培養，分別約為6.0 g·(m2·d)-1與5.6 g·(m2·d)-1. 對于烴類積累而言[圖 3(c)]，葡萄藻在工業廢水中烴含量高于正常Chu 13培養基中的含量，分別約是60.2%和51.2%; 而相應的工業廢水貼壁培養葡萄藻烴產率為3.6 g·(m2·d)-1，高于正常Chu 13培養基中的2.9 g·(m2·d)-1.
圖 3 工業廢水對葡萄藻貼壁培養生長與烴積累的影響
同時，還觀察了葡萄藻在工業廢水與正常Chu 13培養基貼壁培養8 d的細胞顯微圖(圖 4). 從圖 4的光學顯微照片可看出，葡萄藻在正常Chu 13培養基中貼壁培養藻細胞較為鮮綠[圖 4(a)]. 整個藻體細胞串狀集落生，類似成串葡萄，由形態不規則且長短各異的繩索狀透明膠質部分(折射紹絲)連接而成外型不規則或略近球形的復合集落. 相比較而言，葡萄藻在工業廢水中培養，藻細胞中脫落在培養基中“杯鞘”較正常Chu 13培養基中的多; 而且培養基中分散的透明顆粒狀堆積物也較正常培養基中多，這些或許是分泌烴類的產物.
圖 4 葡萄藻在工業廢水與正常培養基貼壁培養下藻細胞顯微圖
葡萄藻在工業廢水中貼壁培養生長與烴類的積累情況優于正常Chu 13培養基，這或許因為工業廢水中氮等營養鹽濃度優于正常Chu 13培養基. 值得注意的是，本研究工業廢水中Co2+濃度相比較正常Chu 13培養基約高10倍，這是否是促進葡萄藻生長和烴積累的關鍵因素，具體原因需要設計實驗研究.
2.2 Co2+濃度對葡萄藻貼壁培養生長影響
為了進一步驗證Co2+濃度對葡萄藻貼壁培養生長的影響，在上述實驗基礎上于正常Chu 13培養基中分別設計了不同鈷濃度0.09(正常)、 0.18、 0.45、 0.90、 4.50、 45.00 mg·L-1對葡萄藻貼壁生長的影響(圖 5). 由圖 5可知，在相同條件下Co2+濃度從0.09 mg·L-1至4.50 mg·L-1均能支持葡萄藻貼壁培養較好的生長. 從圖 5(b)可看出，在葡萄藻貼壁培養8 d內，Co2+濃度為0.09、 0.18、 0.45、 0.90 mg·L-1下生物產率相差不大，分別是6.9、 6.6、 6.5和 6.6 g·(m2·d)-1. 當Co2+濃度為4.50 mg·L-1時，葡萄藻貼壁培養前4 d內生物產率與正常培養相差不大，培養8 d后生物產率略微下降，約為5.5 g·(m2·d)-1; 當Co2+濃度為45.00 mg·L-1時，葡萄藻貼壁培養生長明顯受到抑制，培養8 d后生物產率僅為0.98 g·(m2·d)-1. 由此可知，4.50 mg·L-1鈷濃度對葡萄藻貼壁生長影響不大. 在此基礎上，為進一步研究Co2+對葡萄藻貼壁培養烴合成的影響，實驗選取Co2+濃度0.09 mg·L-1(正常)與4.50 mg·L-1(鈷富余)為研究對象，研究烴積累情況及培養基中Co2+濃度變化情況.
圖 5 Co2+濃度對葡萄藻貼壁生長的影響
2.3 Co2+濃度對葡萄藻貼壁培養烴積累影響
在相同條件下，本實驗研究了Chu 13培養基中鈷富余(4.50 mg·L-1)與正常培養(0.09 mg·L-1)下烴積累的情況(圖 6).從圖 6可看出，隨著培養時間的延長無論是Co2+富余還是正常下烴的含量都增加，但烴含量在Co2+富余下相對較高.培養8 d后，葡萄藻貼壁培養在Co2+富余與正常濃度下烴含量分別是52.9%、43.2%.因為Co2+富余下生物產率低于正常的，因而其對應的烴產率與正常Co2+濃度相當，分別約是2.8 g·(m2·d)-1、 2.9 g·(m2·d)-1 [圖 6(b)].
圖 6 Co2+對葡萄藻貼壁培養烴含量、 烴產率的影響
一般地，A品系葡萄藻所產烴類為C25-C31奇數二烯和三烯類化合物. 本實驗中A品系葡萄藻在Co2+富余與正常濃度下貼壁培養所合成烴構架如圖 7所示. 從中可知，Co2+富余下C31含量約為24.9%，高于Co2+含量正常下的15.3%; C27的含量低于正常Co2+濃度下的量，分別約為13.9%與18.0%; 而C29下的含量在兩種Co2+濃度下相當. 總體來說，其它類型的烴類含量正常Co2+濃度下略高于Co2+富余下的量. Dennis等[25]認為一定的高Co2+濃度可以提高鈷-卟啉復合酶的活性，進而促進脂肪醛到烴類的轉換. 因此，4.50 mg·L-1 Co2+促進了葡萄藻長鏈烴等的合成.
圖 7 Co2+對葡萄藻貼壁培養烴構架的影響
2.4 葡萄藻貼壁方式下培養基中Co2+與N濃度變化情況
本研究葡萄藻貼壁培養在Chu 13培養基中Co2+富余(4.50 mg·L-1)與正常情況下(0.09 mg·L-1)培養基中N、 Co2+的消耗情況(圖 8). 由圖 8(a)可知，葡萄藻在Co2+富余下培養，Co2+濃度在前2 d急劇下降，而在隨后的6 d中Co2+濃度減少趨于平緩，培養8 d后最終Co2+濃度約為0.71mg·L-1. 這說明葡萄藻在Co2+富余濃度下的貼壁培養基中約85%的Co2+被去除. 結合生物產率計算，葡萄藻貼壁培養Co2+的結合能力為1473.9 μmol·g-1，遠高于Carrilho等[26]的報道微藻P. littoralis的結合力560 μmol·g-1.
圖 8 葡萄藻貼壁培養下培養基中Co2+、 N含量的變化情況
從圖 8(b)可看出，培養基中N含量的消耗在Co2+濃度富余情況下消耗速率低于正常值，但最終趨勢類似，N濃度均從最初的1.98 mmol降到約0. 通過比較圖 8發現，在當培養基中Co2+含量變化不大后，N的消耗繼續直至消耗殆盡. 這可能是因為培養基中Co2+的消耗伴隨著離子交換，當培養基中Co2+濃度較高時阻止N通過位于細胞膜上的離子通道輸出細胞[27]. 由此可知，葡萄藻貼壁培養或許在鈷元素去除方面比其它培養方式更有優勢.具體參見污水寶商城資料或http://www.dongaorq.cn更多相關技術文檔。
3 結論
(1) 葡萄藻貼壁培養對工業廢水中重金屬鈷元素的去除效率較高，而且可以促進生物燃料烴類的合成. 在利用藻類生產生物燃料的同時，去除工業廢水中N、 P及重金屬元素，可為綠色高能燃料烴類的生產與工業廢水處理耦合提供理論基礎，為工業廢水處理提供“綠色生態”途徑.
(2) 葡萄藻貼壁培養可處理含鈷工業廢水，一定范圍內Co2+濃度(<4.5 mg·L-1)對藻細胞生長影響不大，反而有利于烴類的合成. 4.5 mg·L-1 Co2+可以促進葡萄藻長鏈烴類的合成，提高烴產量.
(3) 葡萄藻貼壁培養去除工業廢水中Co2+的能力為1473.9 μmol·g-1，遠高于報道的微藻P. littoralis.
