隨著沼氣工程的大規模發展, 大量富營養的豬糞沼液廢水對水體環境以及人類健康造成嚴重危害.豬糞沼液廢水是一種較難處理的有機廢水, 具有高濃度氮磷、成分復雜等特點.在未得到妥善處理的情況下, 其中的氮、磷以及有機物等會導致水體富營養化、地下水污染, 造成人類飲用水的污染等水環境問題, 嚴重破壞水體生態平衡.另一方面, 廢水中氨的釋放也會對大氣帶來嚴重的污染.因此尋求一種有效、簡單且經濟的豬糞沼液廢水處理技術極為重要.

　　國內外對豬糞沼液廢水的處理已進行大量的研究, 研究人員也相繼開發了不同的豬糞沼液廢水處理工藝, 主要包括還田模式、自然處理模式和厭氧發酵產沼氣模式等.傳統的處理方式雖能在一定程度上達到除污的目的, 但也會帶來二次污染.目前, 利用微藻處理豬糞沼液廢水的技術已得到國內外學者的印證.豬糞沼液廢水中含有大量藻類生長所需的氮、磷以及其他營養物質, 將豬糞沼液廢水凈化與微藻的培養相結合, 既可以達到排放標準, 降低豬糞沼液廢水處理成本, 又可以節約微藻的培養成本, 同時還可利用微藻生物質中的高附加值產物.但是, 傳統的液體懸浮培養(如跑道池等)處理沼液因占地面積大、處理效率不高、條件不易控制、采收成本較高等問題一直未得到工藝化推廣利用.

　　本研究采用貼壁技術培養微藻處理豬糞沼液廢水.貼壁培養是將藻細胞與培養基相分離, 并將藻細胞固定在特定的生物膜材料上, 極少量的培養基液體通過附著多孔材料的背面或內部滴入以使藻細胞處于半干濕潤狀態, 并在一定光照強度與營養鹽濃度下進行生長的培養方式.利用貼壁方式培養微藻處理豬糞沼液廢水, 培養結束后省去了藻細胞離心等高能耗過程, 大大降低培養成本.盡管如此, 通過微藻貼壁培養處理豬糞沼液廢水的效果還需要進一步考察研究.當前, 對于藻類細胞的生長以及生物技術方面的應用大多集中于傳統的液體懸浮培養, 包括開放的培養池或是PBR反應器, 但這方面的知識信息并不適用于新型的生物膜貼壁培養方式.

　　小球藻在培養中油脂含量高、生長周期短、適應能力強、光合效率高, 是一種典型的較為理想的藻種資源.本試驗將豬糞沼液廢水(原水)稀釋成不同比例用于小球藻的貼壁培養, 進而考察小球藻在不同稀釋倍數豬糞沼液廢水下的生物量增長、油脂積累、pH變化及COD、氨氮、總氮、總磷、重金屬銅、鋅、鐵去除效率, 以確定小球藻在豬糞沼液廢水中貼壁培養的最適宜生長濃度, 探究小球藻貼壁培養處理豬糞沼液廢水的效果, 以期為畜禽污染控制和豬糞沼液廢水深度處理提供一定的理論基礎.

　　1 材料與方法1.1 藻種來源與培養

　　本試驗所用小球藻(Chlorella pyrenoidosa)由湖北工業大學淡水藻種庫提供.小球藻藻種培養過程所用培養基為BG11.

　　1.2 豬糞沼液廢水

　　豬糞沼液廢水取自湖北省武漢市某畜禽養殖企業經厭氧發酵后的沼液污水, 取水時間為2016年9月27日10:00.豬糞沼液廢水儲存于18℃的溫度下, 經自然沉降2 d后, 取其上清液進行試驗.將豬糞沼液廢水(原水)稱為1倍豬糞沼液廢水, 即取沉降后的上清液3 L制成培養基. 2倍豬糞沼液廢水, 即取沉降后的上清液1 500 mL, 再向其中加入1 500 mL的蒸餾水, 共計3 L制成培養基.以此類推, 5倍、10倍豬糞沼液廢水按上述方法稀釋制成培養基.

　　1.3 反應器與培養方法

　　本試驗小球藻藻種培養所用反應器為玻璃柱式反應器, 內直徑0.05 m, 柱高0.55 m, 工作體積0.90 L.反應器內部布置直徑5 mm的玻璃通氣管, 混合有1.5%CO2體積比的壓縮空氣(0.10 MPa)以1 mL·s-1的通氣速率通過通氣管從反應器底部鼓泡, 從而將藻液攪動并補充碳源.培養過程中連續光照, 培養柱表面光強60 μmol·(m2·s)-1, 培養溫度20℃±1℃.

　　貼壁培養反應裝置(圖 1), 一塊長0.40 m, 寬0.20 m, 厚3 mm的玻璃板置于0.50 m×0.30 m×0.05 m(長×寬×高)的玻璃腔中, 將玻璃板的一面附濾紙, 并接受正上方的光照.將小球藻藻種經過培養至對數期后, 接種相同濃度藻液于醋酸纖維素膜上, 再將其附著于玻璃板的濾紙上, 將附有藻種的玻璃板放入玻璃腔內, 通過循環泵滴加保持小球藻附著材料的濕潤狀態, 同時為保障玻璃腔內的穩定環境, 用保鮮膜封住玻璃腔的一面.為了培養液更均勻地滲入藻細胞內, 將玻璃培養缸放置一定角度, 熒光燈置于培養腔正上方提供光源.豬糞沼液廢水貼壁培養小球藻時未通CO2, 以空氣鼓泡代替, 每2 d取樣一次, 共培養8 d.其他外界培養條件與藻種液體培養條件相同.

圖 1 微藻貼壁培養裝置示意

　　1.4 試驗指標分析方法1.4.1 小球藻細胞生物量測定

　　將0.45 μm, 直徑50 mm, 面積為0.001 m2的醋酸纖維濾膜煮沸3次后, 在105℃烘箱中烘至恒重(W1), 將待測藻樣(DW)用去離子水沖洗至燒杯中, 并倒入抽濾裝置內抽濾至已稱重的濾膜上, 將附著藻的濾膜放入105℃烘箱中烘至恒重(W2), 用分析天平稱量即為藻樣重量(g·m-2).

　　1.4.2 小球藻藻細胞油脂含量測定

　　小球藻總脂含量的測定采用改進的氯仿-甲醇法.收集藻細胞, 用一定量蒸餾水沖洗離心后冷凍干燥.稱取50 mg左右(重量W1)藻粉于研缽中, 加入200 mg已烘干的石英砂, 研碎后加入5 mL甲醇, 2.5 mL氯仿, 高速振蕩5 min.搖床12 h, 離心取出上清7.5 mL置于新管1.向固相中再加入5 mL甲醇, 2.5 mL氯仿, 高速振蕩5 min, 搖床2 h, 離心取出上清7.5 mL置于新管1, 后加入5 mL氯仿和9 mL體積分數為1%的NaCl溶液, 保證最終體系為甲醇:氯仿:1%NaCl=2:2:1.8, 振蕩混勻.將新管1于8 000 r·min-1下離心10 min, 去上清, 下層液轉移入20 mL干凈玻璃管(已稱重W2).吹氮氣+61℃水浴, 約10 min待氯仿揮發殆盡后, 于105℃烘3 h, 冷卻后, 稱重W3.

　　1.4.3 貼壁培養基中pH、NH4+-N、TN、TP、COD濃度的測定

　　取貼壁培養循環裝置中豬糞沼液廢水, 每2 d分別對pH、NH4+-N、TN、TP及COD進行測定. pH的測定應用pH計; NH4+-N測量采用納氏試劑分光光度法(GB 7479-1987); TN測定采用過硫酸鉀消解紫外分光光度法(GB 11894-1989); TP測量采用鉬酸銨分光光度法(GB 11893-1989); COD的測定采用重鉻酸鉀氧化處理法(GB 11914-1989).

　　1.4.4 貼壁培養基中重金屬Cu2+、Zn2+、Fe2+濃度的測定

　　重金屬Cu2+、Zn2+、Fe2+的含量測定采用AAnalyst 400原子吸收分光光度計. Fe2+采用火焰原子吸收分光光度法(GB 11911-89), 檢出限為0.03 mg·L-1; Cu2+、Zn2+都采用原子吸收分光光度法(GB 7475-87), 檢出限均為0.05 mg·L-1.

　　1.5 試驗數據分析方法

　　數據采用統計軟件SPSS 10.0進行單因素方差分析, 采用LSD和Tukey HSD法進行統計檢驗(P<0.05).試驗中, 曲線作圖及擬合采用Origin完成.

　　2 結果與討論2.1 貼壁培養小球藻在不同稀釋倍數豬糞沼液廢水中生長狀況

　　本試驗中, 試驗各處理組的小球藻的生長情況存在較大的差異(圖 2).試驗初期(2 d內), 各組的初始小球藻生物量均為8.50 g·m-2. BG11培養基下的小球藻的生長情況作為空白對照, 經過8 d培養后, 其生物量僅為21.30 g·m-2, 相應的生物產率是1.60 g·(m2·d)-1.各梯度下, 其中除了小球藻在稀釋濃度為1倍豬糞沼液廢水中沒有明顯生長, 其他梯度組小球藻生物量都明顯增加, 各組生物量變化趨勢相近, 隨著培養時間的延長而增加.各梯度下小球藻生物量變化趨勢為：初期上升速度較快, 此后生物量增長幅度較小.經過8 d培養, 在各梯度豬糞沼液廢水生長下小球藻生物量按大小順序排列依次是5倍>2倍>10倍>BG11>1倍.

圖 2 貼壁小球藻在不同稀釋倍數豬糞沼液廢水下生物量的變化

　　由此可知, 豬糞沼液廢水稀釋5倍的培養條件下, 相較于其他處理組, 其生長最好, 從圖 2中可明顯看出, 第4 d起該條件下的小球藻生物量便明顯高于其它濃度梯度, 培養8 d后小球藻生物量高達42.20 g·m-2, 生物產率為4.21 g·(m2·d)-1.在未經稀釋的豬糞沼液廢水(1倍)中培養小球藻, 培養相同時間后生物產率僅為0.33 g·(m2·d)-1.稀釋2倍的豬糞沼液廢水, 其中的小球藻生物產率只有3.15 g·(m2·d)-1.在一定范圍內, 氮磷濃度越高, 小球藻生長越快, 超過一定范圍, 小球藻生長反之越慢, 進而影響生物量的積累. 1倍處理組的豬糞沼液廢水的氮磷濃度較之于小球藻生長適宜所需要的氮磷濃度要高很多, 一定程度上抑制了藻細胞的生長, 該條件下小球藻的生物量要明顯低于稀釋5倍條件下的值. BG11培養基是小球藻正常生長的營養鹽條件, 但從圖 2可知BG11培養條件下的小球藻的生物量低于稀釋2倍培養條件下的小球藻的生物量.由于豬糞沼液廢水的營養成分較充裕, 而稀釋2倍的豬糞沼液廢水中, 營養成分濃度高于BG11, 但又未達到抑制小球藻生長的高濃度水平, 因此生物量積累情況優于BG11培養的值.另外, 10倍稀釋倍數下小球藻的生物量也低于稀釋5倍時的值, 生物產率只有2.76 g·(m2·d)-1.豬糞沼液廢水稀釋10倍的培養條件下, 可能因為豬糞沼液廢水被過分稀釋后, 其中的營養鹽含量較低, 小球藻在其中的生長因營養鹽濃度過低而受到抑制.

　　2.2 貼壁培養小球藻在不同稀釋倍數豬糞沼液廢水中油脂積累狀況

　　根據1.4.2節中油脂的測定方法, 各處理組的油脂的測定值見表 1.豬糞沼液廢水稀釋1倍的培養條件下, 油脂含量為20.5%;豬糞沼液廢水稀釋2倍的培養條件下, 油脂含量為28.5%;豬糞沼液廢水稀釋5倍的培養條件下, 油脂含量為32.7%;豬糞沼液廢水稀釋10倍的培養條件下, 油脂含量為29.7%.比較而言, 沼液稀釋5倍的條件下油脂含量高.

　　表 1 貼壁小球藻在不同稀釋倍數豬糞沼液廢水下油脂的含量

　　張桂艷等通過重要理化因子對小球藻生長和油脂產量的影響進行試驗, 研究發現氮濃度變化對小球藻的生長和油脂積累都有明顯影響.王翠等研究了pH值對豬糞沼液廢水培養小球藻生長及油含量積累情況的影響.研究證實弱堿性條件下小球藻細胞油脂積累更有優勢.前面研究證明, 豬糞沼液廢水稀釋5倍條件下小球藻生長最好, 生物量積累最佳.相應地在藻細胞生長的穩定期后, 由細胞內部其他組分轉換為油脂的含量也越多.各豬糞沼液廢水稀釋培養條件下, 除了原水(1倍)中藻細胞油脂含量較低, 其它兩個處理組的藻細胞油脂含量相差不大.低濃度豬糞沼液廢水中的營養鹽包括氮源含量均較少, 小球藻在其中生長過程較慢, 生物量積累不多.但是, 一般情況下, 當微藻生長受到脅迫或限制時, 油脂含量反而會提高.因此稀釋10倍的油脂含量高于稀釋2倍的處理組的油脂含量.

　　2.3 不同稀釋倍數下豬糞沼液廢水的pH的變化

　　pH值是衡量藻類生長環境的重要指標, 它主要是通過改變培養基的酸堿度, 進而影響培養基溶液的滲透壓, 同時在呼吸作用中影響微藻對有機碳源的利用效果, 因此pH是影響藻類生長代謝的重要因子之一.小球藻生長的pH值范圍為3.5~9.5.試驗期間, 不同稀釋倍數豬糞沼液廢水培養條件下的pH變化特性如圖 3所示.從中可知, 各處理組培養基的pH在8.1~9.5之間變化.各處理組的變化趨勢：試驗第2 d, 培養基的pH均上升, 之后6 d變化幅度都相對平穩.試驗初期測定此豬糞沼液廢水pH為8.1.試驗結果表明, 經過8 d培養, 稀釋1倍的培養基pH為8.2, 稀釋2倍的培養基pH為9.1, 稀釋5倍的培養基pH為9.5, 稀釋10倍的培養基pH為8.7, 各處理組間培養基pH差異較為明顯, pH按大小順序依次為5倍>2倍>10倍>1倍.由于培養基中的pH主要是由二氧化碳的電離平衡決定, 小球藻的光合作用是以水體中二氧化碳、碳酸根、碳酸氫根為原料, 光合作用越強, 電離平衡就往氫氧根方向移動, 造成pH升高.結合2.1節已經得出稀釋5倍條件下, 小球藻的生物量最高, 那么, 在光照強度、溫度、培養基總量、初始接種量等相同的培養條件下, 再結合圖 2分析, 不難得出, pH隨小球藻生物量的增加而升高, 從而使得培養基呈弱堿性.因此, 比較而言弱堿性條件有利于油脂的積累, 這也與Guckert等的研究相吻合.

圖 3 不同稀釋倍數豬糞沼液廢水中pH的變化

　　2.4 不同稀釋倍數下小球藻凈化豬糞沼液廢水中營養鹽的效果

　　小球藻培養一個周期后(8 d), 不同稀釋倍數豬糞沼液廢水中COD、NH4+-N、TN、TP濃度的變化情況如圖 4所示.

圖 4 不同稀釋倍數豬糞沼液廢水中營養鹽的濃度

　　由于藻細胞在生長過程中需要利用廢水中有機物質進行自身物質的合成, COD是沼液中的主要營養物質, 也是養殖業需要考慮能否達標排放的重要指標.通過對豬糞沼液廢水稀釋一定的倍數培養小球藻, 同時觀察其對豬糞沼液廢水凈化的效果.從圖 4(a)中可以看出, 豬糞沼液廢水稀釋倍數為1、2、5、10倍的培養液COD初始值分別為385.77、267.87、116.10、82.00 mg·L-1.培養8 d, 相應的各處理組豬糞沼液廢水中的COD值分別下降為97.19、55.99、16.12、21.53 mg·L-1, 去除效率分別為74.8%、79.1%、86.8%、73.7%.本試驗表明, 小球藻在豬糞沼液廢水稀釋倍數為1、2、5倍的培養基中能夠生長良好, 在培養周期內COD下降速度非常快, 去除COD的效率隨著培養基稀釋倍數的增加而增加.但是豬糞沼液廢水稀釋10倍時小球藻去除COD速率緩慢, 這或許是因為稀釋倍數較大, 營養物質質量濃度過低, 培養基中低濃度的有機質無法較好地滿足小球藻所需物質合成的需要.因此小球藻在豬糞沼液廢水稀釋倍數為5倍時去除COD效率最好, 其對于COD的去除效果要遠遠高于傳統的液體培養處理法.

　　圖 4(b)為不同處理組NH4+-N的去除效果.初始豬糞沼液廢水的NH4+-N值為578.27 mg·L-1, 試驗第1 d, 豬糞沼液廢水稀釋倍數為2、5、10倍的混合液中的NH4+-N值分別為293.72、134.17、38.20 mg·L-1.試驗開始后各處理組NH4+-N質量濃度迅速下降, 前4 d的變化相當明顯.試驗結束第8 d, 各處理組中沼液的NH4+-N值分別降低為103.19、13.61、2.67、3.10 mg·L-1, 去除效率分別為82.2%、87.8%、94.1%、91.9%.微藻對培養液中氨氮的去除方式有兩種, 一是藻類的生長吸收消耗的易吸收氮源主要是氨氮, 用于合成自身細胞所需的有機物; 二是微藻光合作用時, 溶液中pH值升高, 從而導致氨氮的揮發.本試驗中, 稀釋10倍的培養基中, 混合液的氨氮濃度相對較低, 但仍然可以提供滿足小球藻生長的條件.而稀釋1倍和2倍的培養基由于營養成分略高于小球藻適宜的生長條件, 有抑制小球藻生長的可能性.綜上所述稀釋5倍的處理組NH4+-N值的去除效果是最好的.

　　從圖 4(c)可知, 豬糞沼液廢水稀釋倍數為1、2、5、10倍的混合液中的TN初始值分別為63.03、33.09、14.49、5.34 mg·L-1.試驗第8 d, 各處理組中豬糞沼液廢水中的TN值分別降低為9.87、4.95、2.29、0.88 mg·L-1, 相應地去除效率分別為84.3%、85.0%、85.2%、83.6%.微藻對于沼液中氮化合物的去除主要是通過其吸收作用, 將含氮化合物通過自養作用合成藻細胞中氨基酸以及蛋白質等物質.由于豬糞沼液廢水稀釋10倍時, 低濃度的營養物質雖對小球藻的生長有一定影響, 但去除TN效率仍然可以達到83.6%.其他處理組的處理效率也均在80.0%以上.因此小球藻對于豬糞沼液廢水中TN去除效果很好.

　　圖 4(d), 初始豬糞沼液廢水的TP值為39.12 mg·L-1, 豬糞沼液廢水稀釋2、5、10倍的混合液中TP值分別為18.53、6.65、4.86 mg·L-1.培養至第8 d, 各處理組培養基中的TP值分別降低為11.63、2.86、1.05、1.84 mg·L-1, 去除效率分別為70.3%、84.5%、84.3%、62.1%.同樣, 微藻對磷的去除途徑主要有兩種：一是微藻生長同化培養液中的磷元素, 合成自身的營養物質.二是藻的光合作用使溶液中pH值上升, 磷元素以難溶鹽的形式沉淀下來. 圖 4(d)反映了各組豬糞沼液廢水中TP的去除趨勢, 很明顯隨著培養時間的延長, TP逐漸被小球藻利用代謝, 效率均達到83%以上, 高于Ruan等用傳統方式的凈化效果.當豬糞沼液廢水稀釋5倍時TP的濃度下降速度較為均勻并且下降速率最高.

　　2.5 不同稀釋倍數下小球藻對重金屬Cu2+、Fe2+、Zn2+的去除效果

　　研究人員發現有些藻體對重金屬具有一定的富集能力, 這使藻類作為生物吸附劑修復水體重金屬污染成為可能.對重金屬Cu2+、Fe2+、Zn2+共存情況下的豬糞沼液廢水進行定期取樣檢測, 測定小球藻對Cu2+、Fe2+、Zn2+的去除情況, 如表 2所示.

　　表 2 不同稀釋倍數豬糞沼液廢水中重金屬濃度/mg·L-1

　　從表 2中可以看出, 小球藻對Cu2+、Fe2+、Zn2+的去除是個較為快速的過程.試驗開始2 d后, 各處理組中Cu2+、Fe2+、Zn2+的濃度迅速下降, 培養6 d后逐漸趨于平緩.稀釋1、2、5、10倍的豬糞沼液廢水對于Cu2+的去除效率分別為：65.0%、64.9%、72.9%、35.0%.其中去除效率最高的是稀釋5倍的培養基, Cu2+濃度由初始0.70 mg·L-1下降到了0.19 mg·L-1.稀釋1、2、5、10倍的豬糞沼液廢水對于Fe2+的除去效率分別為43.8%、70.6%、73.0%、67.3%.此時, 去除效率最高的也是稀釋5倍的豬糞沼液廢水, 該培養基中的Fe2+濃度由0.89 mg·L-1降低到0.24 mg·L-1.稀釋1、2、5倍的豬糞沼液廢水對于Zn2+的除去效率分別為62.5%、59.4%、70.0%.由于Zn2+使用1.4.4節中試驗方法測試時, 其檢出限為0.05 mg·L-1. 10倍的豬糞沼液廢水中Zn2+的初始含量為0.11 mg·L-1, 第2 d其含量已經檢測不到.以上分析可知, 稀釋5倍的培養基對于重金屬Cu2+、Fe2+、Zn2+的吸收效果是最好的.

　　5倍稀釋倍數的培養基對于重金屬Cu2+、Fe2+、Zn2+的吸收效果表明, 其吸附能力大小依次為：Fe2+>Cu2+>Zn2+.吳海鎖等研究了多種金屬離子共存時, 小球藻對金屬的吸附具有一定的選擇性, 其對Cu2+的吸附能力強于Zn2+, 且不同離子間有一定的抑制作用, 這與本研究結果相似.各處理組由于重金屬濃度還未達到毒害藻體死亡的含量, 因此4個處理組的去除效率都是逐漸升高的.這與藻細胞對重金屬的吸附機制有關, 吸附的最初時期金屬離子通過絡合、離子交換等作用吸附在細胞壁上, 這是一個快速吸附的過程, 此后在細胞代謝的作用下吸附在表面的金屬離子被轉運至細胞體內, 重金屬被藻細胞富集, 因此去除率隨時間慢慢上升.但是1倍、2倍處理組對重金屬離子的去除效果并未像5倍時那么好, 而10倍處理組由于稀釋倍數過高, 最終的去除效果也并非如5倍時明顯.這可能是由于金屬陽離子進入藻液時立即被細胞壁上的羥基(—OH)、羧基(—COOH)等基團水解釋放的陰離子和質子結合, 吸附在細胞表面, 而同時重金屬對藻細胞的脅迫作用致使藻細胞生長受阻.或可能由于某一種金屬進入藻液后和氨基、羧基等功能基團相互作用并大量附著在藻細胞表面.重金屬對小球藻生長有抑制作用, 低濃度下抑制效果不明顯, 高濃度下顯著影響藻細胞生長, 且重金屬大量存在會使藻細胞破碎.但由于本試驗中培養基中重金屬濃度并非很高, 所以并未對小球藻正常的生長產生較大影響, 反而一定程度上可以滿足小球藻生長對于微量元素的需求, 所以最終的去除效率也較明顯.具體參見污水寶商城資料或http://www.dongaorq.cn更多相關技術文檔。

　　3 結論

　　(1) 小球藻貼壁培養處理豬糞沼液廢水是可行的.在不同稀釋倍數下(1、2、5、10倍)的豬糞沼液廢水中, 小球藻均能生長.在豬糞沼液廢水稀釋5倍時, COD為121.72 mg·L-1, 氨氮為134.17 mg·L-1、總氮為14.49 mg·L-1、總磷為6.65 mg·L-1, 此時小球藻生長最好, 培養一個周期8 d后生物產率為4.21 g·(m2·d-1).對COD、氨氮、總氮、總磷的去除效率最高, 分別為：86.8%、94.1%、85.2%、84.3%.

　　(2) 豬糞沼液廢水稀釋5倍時, 小球藻貼壁培養藻細胞的油脂含量最高, 為32.7%, 其次是稀釋2倍下, 小球藻油脂含量為28.5%.同時, 在豬糞沼液廢水稀釋5倍時, 小球藻貼壁培養去除重金屬銅、鋅、鐵的效果最好, 去除率分別是72.9%、70.0%、73.0%.