城市污水是人類活動的必然產物, 其產生量隨著城市與社會經濟的發展不斷增加, 城市污水處理廠(wastewater treatment plant, WWTP)作為城市的“腸道”, 是控制水污染, 保證城市與人類可持續發展的重要設施.我國城市污水處理廠普遍采用活性污泥法處理污水, 其中微生物是污染物去除的主體, 因此微生物群落是系統穩定運行的基礎.
在群落中, 除原核生物外, 真菌、原生動物、藻類等真核微生物作為不可或缺的一部分, 在保障系統穩定運行過程中發揮著重要的作用.一方面, 原生動物可以攝食處理水中游離細菌, 指示活性污泥性質; 通過優勢種群變化、形態變化、繁殖方式變化來指示反應操作環境; 通過種群密度和種類的變化預測出水水質; 通過對細菌、有機顆粒和藻類等的強化和捕食作用強化凈化效果; 通過監測纖毛類的多樣性可以預估污水處理廠的運行狀況.另一方面, 隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲等病原性原生動物能導致人和動物腹瀉, 且具有個體小、潛伏期長、致病性強且易暴發流行的特點, 對下游生物造成極大的威脅.
活性污泥中真菌的出現一般也與水質有關.一方面, 絲狀真菌是形成活性污泥絮凝體的骨架, 使污泥具有良好的沉淀性能, 保持高的凈化效率、低的出水濃度和出水懸浮物濃度.另一方面, 絲狀真菌, 如Trichosporon屬, 若大量異常地增殖則會引發污泥膨脹現象, 常造成處理水質下降和污泥的大量流失, 影響處理系統的穩定運行.因此, 深入理解污水處理系統中真核微生物的特性, 對提高出水水質、保障污水處理系統的穩定運行具有重要作用.
傳統的微生物培養方法和形態學研究手段因自身存在的不足和問題, 限制了人們對真核微生物的認識, Meng等利用密度梯度離心結合定量蛋白銀染色的方法在黃海48個站位的沉積物樣品中鑒定出198種底棲纖毛蟲; 代仁海利用同樣的方法在春季長江口及東海的39個站位的沉積物樣品中檢獲278種底棲纖毛蟲, 但其中約37%的種類由于數量過少等原因導致分類信息不足, 難以準確鑒定.近年來高通量測序技術的研究手段極大地提高了微生物群落研究的深度與水平, 現已被廣泛用來解析農田、森林、土壤、海洋等環境中的微生物.在污水處理系統中, 相關研究大多集中于利用高通量測序技術結合其他生物信息學方法解析系統內細菌群落的結構和功能, 采用這一技術研究系統內真核微生物群落的報道還很少見.此外, 我國不同區域的地理環境和飲食結構均存在差異, 且有研究顯示自然系統內真核微生物群落和污水處理系統內的細菌群落均具有地域性差異, 然而不同區域活性污泥系統內的真核微生物群落地域性差異研究尚未開展.
因此, 本研究擬利用高通量測序技術, 結合多種生態學及數理統計相關分析方法研究我國城市污水處理系統中真核微生物的群落特性與地域性差異, 深化對污水處理系統中真核微生物的認識, 以期為指導污水處理系統的優化設計、提高出水水質、保障系統穩定高效運行提供科學依據.
1 材料與方法1.1 樣品采集與DNA提取
污泥樣品采集于2014年7~8月, 選取了北京, 深圳和無錫的14個污水處理廠, 為保證后續數據統計學分析結果的可靠性, 樣品采集遵循每個城市至少采集4個WWTPs, 每個WWTP至少采集3個曝氣池活性污泥樣品(分別在曝氣池前、中、后端)以及一個曝氣池上清液樣(曝氣池中端), 若同一WWTP具有不同的處理工藝, 則在不同處理工藝的曝氣池中均進行了活性污泥樣品和曝氣池上清液樣品的采集.同時, 原位測定曝氣池混合液的溫度、pH、溶解氧濃度和電導率等參數, 收集WWTPs的地理信息、城市氣候信息, WWTPs采用的處理工藝、設計參數、進出水水質情況和操作參數等基本信息.
采用統一的方法, 每個樣品采集30 mL, 并迅速置于冰上24 h內帶回實驗室, 充分搖勻后于15 000g離心10 min后棄去上清液, 取沉淀相保存于-80℃用于微生物DNA提取.采用PowerSoil®DNA提取試劑盒提取污泥樣品的DNA, 然后用ND-2000分光光度計和NanoDrop測定其濃度和純度, 保證每個樣品滿足測序的DNA質量要求.
1.2 18S rDNA高通量測序
利用引物TAReuk454FWD1(5′-CCAGCASC YGCGGTAATTCC-3′)和TAReukREV3(5′-ACTTTCG TTCTTGATYRA-3′)通過Illumina MiSeq測序平臺完成活性污泥系統內真核微生物18S rDNA測序, 然后在Galaxy平臺(http://zhoulab5.rccc.ou.edu:8080/root)上完成原始數據的整合, 物種信息分類, 生成操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)表格, .
1.3 數據分析
本研究使用了非度量多維尺度法(nonmetric multidimensional scaling, NMDS)和相異性分析非參數檢驗方法ADONIS(permutational multivariate analysis of variance)、ANOSIM(analysis of similarities)和MRPP(multi-response permutation procedure)檢驗北京、深圳和無錫這3個城市微生物群落結構的差異, 采用多元回歸矩陣分析(multiple regression on distance matrix, MRM)和partial mantel test分析確定影響群落結構的重要因素.以上分析通過R語言vegan、ape、ecodist程序包和Excel完成.
2 結果與討論2.1 OTU及其相對豐度的分布特征
為了保證樣品間數據的均等性, 本研究按照每個樣品8 190條序列的標準對測序結果進行隨機抽平處理, 61個樣品共得到499 590條序列.然后按照97%相似度的標準進行序列的OTU劃分, 共獲得3 794個OTUs.
數據分析結果表明, OTU的相對豐度分布極其不均勻, 只有少數的OTU相對豐度較高, 其中, 相對豐度大于0.10%的OTU僅有120個[圖 1(a)], 這也是常被觀測到的一種生態學現象.此外, 前84個OTUs(1.07%)的累積相對豐度就已達到總豐度的80%[圖 1(b)].同樣地, OTU在樣品中的分布也十分不均勻[圖 1(c)], 只有4個OTUs被所有樣品共有, 存在于50或更多個樣品中的OTU只有37個, 85.40%的OTU僅存在于不超過10個樣品中.另外, 從圖 1(c)還可以看出：活性污泥系統真核微生物群落中絕大多數OTU的分布頻率與相對豐度都很低, 但分布頻率較高的OTU傾向于具有較高的相對豐度, 即存在少量分布廣泛且相對豐度較高的OTU, 這與污水處理系統中細菌群落的分布規律相似.
圖 1
2.2 活性污泥系統內真核微生物群落的α多樣性
α多樣性能夠反映樣品內的微生物群落的豐富度和均勻度.本研究中, 活性污泥系統內每個樣品中真核微生物群落的OTU數目為212~689, 估算的OTU豐富度(Chao1)為370~1192, 香農-威納指數為1.58~4.80, 辛普森相關指數為1.8~38.65, 均勻度指數為0.29~0.73.城市水平來看, 3個城市活性污泥系統內真核微生物群落多樣性不同(表 1), 其中無錫群落的物種豐富度(實際值和估測值)最高, 深圳次之, 北京群落的物種豐富度則明顯低于無錫和深圳, 香農-威納指數在3個城市間也呈現相同的規律, 各城市群落物種均勻度差異不大.
表 1 城市樣品水平活性污泥系統內真核微生物群落α多樣性指數
與傳統的研究方法相比, 本研究利用高通量測序技術檢獲的真核微生物多樣性更高. Matsunaga等通過構建18S rRNA基因克隆文庫的方法研究了活性污泥中的真核微生物多樣性, 在獲取的834個克隆中, 60%的克隆很難鑒定, 最終僅獲取了80個OTUs; Matsubayashi等利用同樣的方法研究了厭氧污泥中的真核微生物多樣性, 發現系統內85%的真核微生物都是未知的, 樣品中估算的OTU數量(Chao1)僅為34~77個.盡管不同的數據處理軟件、參數的選擇等均可導致OTU數量的改變, 進而影響分子多樣性的評價, 且前期PCR擴增和測序等過程均可能導致微生物群落物種多樣性的高估, 但目前對其高估程度還難以準確定量.
與活性污泥系統內的細菌群落比較發現, 真核微生物多樣性較低. Zhang等使用454焦磷酸測序方法獲得的活性污泥系統內細菌群落OTU數目為1 183~3 567個, Xia等采用Illumina測序方法分別研究了MBR和OD系統內12周的活性污泥樣品內的細菌群落多樣性, 結果表明MBR系統和OD系統樣品的OTU數目分別為2 297~3 330和1 802~3 517個, 均高于真核微生物多樣性.具體聯系污水寶或參見http://www.dongaorq.cn更多相關技術文檔。
2.3 不同空間尺度下的活性污泥系統內真核微生物群落物種組成
物種組成是微生物群落研究的一項重要內容, 是探究群落優勢菌種或核心物種的基礎, 但不同空間尺度下活性污泥系統內的微生物群落組成可能有所差異.因此, 本研究主要從區域、城市和污水處理廠這3個空間尺度, Supergroup、Division兩個水平對OTU所屬的物種信息進行分析, 從而全面地揭示活性污泥系統內真核微生物群落的組成特征.
在區域尺度上, 在Supergroup水平下, 3 794個OTUs分屬于10個Supergroup[圖 2(a)], 其中, Opisthokonta的相對豐度最高, 為54.06%, Alveolata次之, 為35.90%.在Division水平下, 3 794個OTUs分屬于26個Division, 其中, 相對豐度大于1.0%的僅有10個[圖 2(b)], 但它們的累積相對豐度已大于98%.具體地, 87.08%的OTUs屬于Ciliophora、Fungi和Metazoa, 其中, 相對豐度最高的是Ciliophora, 為34.35%, 其次是Fungi和Metazoa, 相對豐度分別為33.02%和19.71%.
圖 2
(a)整體尺度, Supergroup水平; (b)整體尺度, Division水平; (c)城市尺度, Devision水平; (d)污水處理廠尺度, Devision水平(相對豐度小于1.0%的統一劃歸為others)圖 2 不同尺度/水平下活性污泥系統內真核微生物群落組成
在城市尺度、Division水平下[圖 2(c)], 3個城市的活性污泥真核微生物群落均以Ciliophora, Fungi和Metazoa為主要組成成分, 總相對豐度為86.22%~89.40%, 但是北京和無錫群落均以Ciliophora為最主要的組分, 深圳群落則以Fungi為最主要的組分.
在污水處理廠尺度、Division水平下[圖 2(d)], 除BJ6外的13個污水處理廠內的Ciliophora、Fungi和Metazoa的總相對豐度為83.21%~97.30%, BJ6較特殊, 三者總相對豐度僅為74.31%, 其他組分相對豐度較高.分析發現Perkinsea在各污水處理廠群落內分布極其不均勻, 在BJ6群落內的相對豐度高達19.99%, 但它們在BJ3和SZ4兩個群落內不存在, 在其他廠內的相對豐度也均很低(0.02%~2.53%). Perkinsea主要包括一些雙殼類軟體動物的寄生蟲, 常存活于淡水環境中.
2.4 活性污泥系統內真核微生物群落地域分布差異
采用基于Bray-Curtis距離的NMDS方法對來自于不同污水處理廠的樣品進行了群落結構分析, 結果如圖 3所示：整體上, 來自北京、深圳和無錫這3個城市的活性污泥系統內真核微生物群落各自聚為一類, 表明3個城市的活性污泥系統內真核微生物群落結構存在差異.相異性分析非參數檢驗方法ADONIS、ANOSIM和MRPP的結果也為3個城市真核微生物群落結構存在顯著差異提供了佐證(P < 0.01).具體看, 來自某一個城市不同污水處理廠的活性污泥真核微生物群落傾向于聚類在一起, 即來自同一城市的活性污泥系統內真核微生物群落具有較強的相似性, 不同污水處理廠的活性污泥系統內真核微生物群落結構存在差異, 表明活性污泥系統內真核微生物存在地域性差異.這與自然系統內真核微生物群落和污水處理系統內的細菌群落均存在地域性差異的結論一致.
圖 3
圖 3 基于NMDS的活性污泥系統內真核微生物群落結構分析
2.5 活性污泥系統內真核微生物群落結構的影響因素
群落多樣性和結構主要受確定性因素和隨機因素的影響.確定性因素通�；谏鷳B位理論描述, 隨機因素由中性理論闡述, 現有研究主要關注確定性因素中的環境條件對活性污泥系統內微生物群落結構的影響.基于高通量方法的研究表明WWTPs的水質參數、操作條件、地理位置和處理工藝等因素均會對污水處理系統微生物群落結構產生影響, 研究對象不同, 影響作用較顯著的因素種類不盡相同.
為了探明城市污水處理廠活性污泥系統內真核微生物群落結構的影響因子, 本研究利用partial mantel test分析了地理位置、進出水水質參數、操作條件等參數與群落結構的相關性, 結果表明, 在參與分析的20個因子中, 10個因子與群落結構顯著相關(P<0.05), 其中相關系數最大、相關性最強的因子是出水總氮濃度(r=0.61), 其次是水力停留時間(r=0.50), 污泥齡(r=0.43)和出水總磷濃度(r=0.38).與出水污染物參數相比, 進水污染物參數與群落相關性較弱[進水BOD濃度(r=0.33), 進水總磷濃度(r=0.26)], 此外, 與群落結構具有顯著相關性的因素還有地理緯度(r=0.30), 曝氣池溶解氧濃度(r=0.22), 年平均氣溫(r=0.22)和曝氣池混合液濃度(r=0.22).
由于partial mantel test只能逐一分析各環境因子與群落結構的相關性或將多個環境因子作為一個整體考察其與群落結構的相關性, 為了探究不同環境因子對群落結構影響的相對重要性, 本研究使用相同的影響因子組合構建了MRM模型.結果表明, 模型顯著且擬合度較高(R2=0.92, P<0.01).對于單個因子而言(表 2), 曝氣池混合液溫度是造成群落存在差異最重要的因素.環境溫度影響生物處理構筑物中生物化學過程的速度和趨向, 影響微生物的新陳代謝、進化速率等生理活動, 適宜的溫度能夠促進、強化微生物的生理活動, 反之, 能夠減弱甚至破壞微生物的生理活動, 導致微生物形態和生理特性的改變, 甚至可能導致微生物死亡, 進而影響活性污泥的微生物種群的形成和發展.
表 2 MRM分析各環境因子對活性污泥系統內真核微生物群落結構影響的權重1)
與進水污染物濃度(進水BOD濃度)相比, 出水污染物濃度(出水總氮濃度、出水總磷濃度)與群落結構具有較強的相關性, 其中出水總氮濃度與群落結構的相關性強于出水總磷濃度(表 2), Wei等基于ITS數據對污水處理廠中真菌群落結構影響因素研究表明, 出水總氮濃度與群落結構有很強的相關性.氮是微生物生長、繁殖、代謝不可缺少的重要元素, 另外, 出水總氮濃度也是出水水質監測的一個重要指標, 因此這也側面反映了真核微生物作為出水水質的指示生物, 其數量和密度與出水水質有重要關聯.齊嶸等采用活體鏡檢計數的方法對無機廢水硝化過程中原生動物群落結構進行了研究, 結果發現原生動物優勢種類的數量變化與出水NO3--N和NO2--N的濃度存在一定聯系, 即隨著NO2--N的大量累積, 表殼蟲生長繁殖旺盛, 密度最高可達575 ind.·mL-1, 成為系統中絕對優勢的原生動物; 但當NO2--N濃度小于10 mg·L-1時, 幾乎未見表殼蟲的存在, 而系統中的另一種典型的原生動物累枝蟲的數量則隨著NO3--N濃度的持續增加而逐漸增加.
此外, 地理距離也是影響群落結構的重要因子(表 2), 這與上文3個城市群落結構存在顯著差異的結果相一致, 說明微生物種群的確存在地域性差異, 事實上, 地理距離的差異導致了環境的異質性, 如氣溫、降水量的異質性, 進而導致了群落地域性差異. Bahram等報道了影響表層土壤真菌分布的最主要因素是降水量. Telford等的研究發現自然系統內的真核微生物(硅藻)會因為擴散限制而呈有限的地理分布, 其他學者的研究結果也同樣證明了微生物地域性差異的存在, 且地理距離造成的群落間的差異可能因空間限制而被長期保留.
此外, 常規污水處理廠操作運行參數曝氣池pH、污泥齡和曝氣池混合液濃度對群落結構也存在重要影響, 它們也是活性污泥系統內細菌群落的重要影響因子.
3 結論
(1) 不同空間尺度下, 活性污泥系統內真核微生物群落優勢種群組成相似.在Devision水平上, 3個城市真核微生物群落優勢種群主要由真菌、原生動物(纖毛亞門)和后生動物組成.
(2) 不同城市污水處理廠活性污泥系統內真核微生物多樣性存在差異, 無錫群落的多樣性(豐富度和香農-威納多樣性指數)最高, 北京的最低, 且3個城市的活性污泥系統內真核微生物群落結構存在顯著的地域性差異.
(3) 利用Partial mantel test和MRM探討了影響活性污泥系統真核微生物群落結構的因素, 結果表明, 曝氣池混合液溫度和出水總氮濃度與活性污泥系統內真核微生物群落結構的相關性較強.(來源：環境科學 作者：秦文韜)
