1 引言(Introduction)

　　厭氧發酵產沼氣是畜禽養殖廢水的主要處理技術.沼氣發酵過程可去除原料中大量可溶性有機物, 但化學需氧量(COD)、氨氮(NH3-N)等濃度依然較高, 抗生素等微量有機污染物也難以脫除, 直接排入水體會帶來環境污染和生態威脅(孫建平等, 2009; Park et al., 2010; Chen et al., 2015).微藻生長速率快、環境適應性強, 生長過程中可吸收利用沼液中營養物質, 從而降低氮磷等主要污染指標而達到處理沼液的目的(王愿珠等, 2017).同時, 微藻生物質具有高附加值, 可用作生物柴油的原料(Levine et al., 2011; 程軍等, 2016), 也可作為動物飼料(Cheng et al., 2015).培養成本較高制約了微藻生物質能源與資源化利用技術的應用, 而營養物質的成本占微藻總培養成本的10%~20%(Singh et al., 2011), 因此利用沼液培養微藻, 降低微藻培養營養成本與水耗, 將有助于降低微藻培養成本, 同時實現廢棄物資源化再利用.

　　Singh等(2011)利用小球藻和柵藻凈化家禽糞便沼液, 總氮(TN)和總磷(TP)去除率分別達到60%和80%.然而, 其沒有考察沼液中COD的凈化效果. Ji等(2015)將餐廚廢水按照體積比例0.5%~10%與標準培養基混合后培養綠藻Scenedesmus obliquus, 對TN和TP的脫除效率分別為75%和12%.Wang等(2010)探究小球藻凈化牛糞厭氧發酵沼液, COD、NH3-N、TN和TP的去除率分別為27.4%~38.4%、100%、75.7%~82.5%和62.5%~74.7%.顯然, 沼液中COD的凈化率較低, 對TN和TP的脫除效率也不高.沼液滅菌、CO2曝氣是微藻凈化沼液中兩個關鍵環節, 而目前的研究中關于滅菌方式以及CO2體積濃度對微藻凈化沼液效率的影響幾乎沒有涉及.另外微藻對沼液中抗生素等微污染物的脫除效果也未見報道.

　　本文針對養豬場廢水厭氧發酵沼液, 采用小球藻光合生長脫除其中污染物, 考察了臭氧氧化及高壓蒸汽兩種沼液滅菌方式及優化的CO2體積濃度對沼液脫N, P和去除COD、抗生素替米考星等污染物的影響.

　　2 材料與方法(Materials and methods)

2.1 養豬場廢水來源及藻種

　　養豬場廢水原液及其厭氧發酵沼液采集自嘉興大運河生態牧業公司.對沼液樣品離心除去懸浮顆粒物后, 取上清液滅菌和調節pH后接種小球藻進行生長凈化實驗.

　　實驗所用藻種Chlorella PY-ZU1是由Chlorella Pyrenoidosa經過5.5萬居里的60Co -γ射線輻射誘變得到的(Cheng et al., 2013).細胞在SE標準培養基中保藏, 包含0.25 g NaNO3、0.075 g K2HPO4 · 3H2O、0.075 g MgSO4 · 7H2O、0.025 g CaCl2 · 2H2O、0.175 g KH2PO4、0.025 g NaCl、40 mL土壤浸出液, 0.005 g FeCl3 · 6H2O, 1 mL Fe-EDTA和1 mL A5微量元素溶液, 溶解在958 mL的去離子水中.

　　2.2 沼液預處理、滅菌以及微藻培養方式

　　沼液通過高速離心機8000 r · min-1離心10 min, 上清液用1 mol · L-1的氫氧化鈉和1 mol · L-1的鹽酸調節pH到6~6.5, 作為不滅菌組的培養基.上清液在112 ℃進行高壓蒸汽滅菌30 min, 再用1 mol · L-1的氫氧化鈉和1 mol · L-1的鹽酸調節pH到6~6.5, 作為高壓蒸汽滅菌組的培養基.將臭氧發生器產生的濃度為50 mg · L-1的臭氧氣體連續通入1 L沼液中10 min, 再用1 mol · L-1的氫氧化鈉和1 mol · L-1的鹽酸調節pH到6~6.5, 作為臭氧氧化滅菌組的培養基.在1 L臭氧氧化滅菌后的沼液中添加43.9 mg KH2PO4(10 mg · L-1 P元素)和4.8 mg FeCl3 · 6H2O(1 mg · L-1 Fe元素)作為添加P元素和Fe元素實驗組的培養基.

　　Chlorella PY-ZU1在人工溫室中培養, 溫度為27 ℃, 光照強度為8000 Lux, 24 h連續光照.反應器為柱狀生物反應器(160 mm × ϕ56 mm工作容積為300 mL), 富CO2氣體從一根長鋼管(180 mm×ϕ3 mm)通入反應器底部.取新鮮的藻種接種到不同處理的沼液中, 接種密度為0.1 g · L-1, 通入體積濃度為2%~30%的CO2氣體, 通氣量由質量流量計控制為30 mL · min-1.

　　2.3 分析測試方法

　　COD、NH3-N、TN、TP等水質成分測試：取10 mL藻液在9000 r · min-1轉速下離心5 min, 取上清液由HACH DR890水質分析儀測量.沼液的陽離子由熱電公司X series電感耦合等離子體質譜ICP-MS測量, 陰離子含量用瑞士Metrohm 883 Basic IC Plus離子色譜儀測量.粗纖維采用FOSS FT350(丹麥)纖維測定儀測量, 有機酸采用HP 6890/5973GC-MS聯用儀測量.培養期間, 通過離心法測定小球藻的生物量, 取10 mL藻液在9000 r · min-1轉速下離心5 min, 去除上清液, 然后用去離子水清洗重復兩次, 再在80 ℃下烘干24 h, 用電子天平稱重, 以g · L-1計算生物質干重.藻液pH檢測：取2 mL藻液于試管中, 將便攜式pH計(Mettler Toledo FG-2, 瑞士)探頭浸沒在藻液中, 穩定后讀取pH值.

　　3 結果與討論(Results and discussion)

3.1 養豬場廢水原液及其厭氧發酵后沼液的成分分析

　　養豬場廢水原液(以下稱原液)在經厭氧發酵處理前COD為1580 mg · L-1, TN為1095 mg · L-1, 有機物主要成分是粗纖維和有機酸(表 1), 另外還含有微量抗生素替米考星.微量的抗生素存在于水體中也會對環境帶來較大潛在威脅, 如毒害水生生物、誘導抗生素抗性基因和細菌.經過厭氧發酵, 沼液中COD降至794 mg · L-1, 總氮降至854.7 mg · L-1, 依然遠遠高于排放標準.氨氮含量升高, 原因是水解酸化和厭氧發酵過程中大分子有機物如蛋白質等降解釋放出氨氮的速度快于細菌消耗氨氮的速度.沼液中主要的無機元素呈降低趨勢(表 2).沼液中除了微量元素鐵(0.29 mg · L-1)、錳(0.20 mg · L-1)、鉬(0.0070 mg · L-1), 其他元素均遠高于小球藻標準培養基, 富含有機質、氮、磷等營養成分及氨基酸等生命活性物質, 因此沼液中含有足夠的營養物質可以用來支持微藻生長.此外, 沼液中重金屬含量極低, 除含有極少量砷以外, 其他均低于檢測限, 因此重金屬在微藻中的富集作用可以忽略.

　　表 1 養豬場厭氧發酵前原液及發酵后沼液的主要污染物

　　表 2(Table 2)

　　表 2 養豬場厭氧發酵前原液、發酵后沼液及小球藻標準培養基的無機成分

 　　3.2 滅菌方法對微藻生長和污染物脫除的影響

　　沼液中含有細菌等各種微生物, 可能會與微藻爭奪營養而抑制微藻生長.分別考察了對沼液不滅菌、高壓蒸汽滅菌和臭氧氧化滅菌對微藻生長脫除沼液中污染物的影響.首先, 測試了在對藻液進行滅菌之后, 接種微藻之前, 沼液中污染物的含量.在高壓蒸汽滅菌以后, 沼液中COD、NH3-N、TN、TP和替米考星的濃度分別為：780.62、703.92、835.23、12.21和0.0064 mg · L-1.高壓蒸汽滅菌對污染物濃度影響較小, NH3-N和TN濃度的下降是由于高溫促進了NH3的揮發.采用臭氧氧化滅菌之后, 沼液中COD、NH3-N、TN、TP和替米考星的濃度分別為：725.87、691.36、820.39、12.22和0.0059 mg · L-1.由于臭氧具有強氧化性, 能夠攻擊C═C鍵和苯環, 將較大分子的有機物降解成較小分子有機物, 因此COD下降了8.5%, 同時由于向沼液中曝入氣體, 加快了NH3的揮發, 因此NH3-N和TN也有所下降, 但臭氧滅菌對各種污染物脫除比例較小.圖 1a表明, 不滅菌條件下, 小球藻生長速度較慢, 經過11 d培養生物質產量為3.01 g · L-1, 但未因細菌污染而死亡.COD、NH3-N、TN和TP的脫除效率分別為41.6%、65.3%、67.1%和62.7%, 抗生素替米考星的脫除效率為65.9%(圖 1b), 污染物脫除效率較低.而經過高壓蒸汽滅菌后, 微藻生物質產量提高到3.89 g · L-1, 提高了29%.121 ℃高壓蒸汽使沼液中微生物細胞的蛋白質由于高溫而凝固, 從而達到滅菌的效果.冷卻后再接種小球藻培養時, 由于沒有其它微生物爭奪營養, 小球藻快速生長同化沼液中的C、N、P等營養元素, COD、NH3-N、TN和TP的脫除效率分別提高到46.3%、72.2%、71.2%和98.0%, 抗生素替米考星的脫除效率提高到72.8%.顯然, COD的脫除效率依然較低.這是因為沼液中的COD主要組成是纖維素、有機酸等難降解較大分子量的有機物, 微藻對此的同化降解能力較低、速度較慢.采用臭氧氧化滅菌條件下, 微藻生物質產量提高到4.50 g · L-1, 比未滅菌條件下提高了49.5%.臭氧依靠其強氧化性, 損傷沼液中微生物的細胞膜成份, 導致其新陳代謝障礙, 并繼續穿透膜破壞膜內脂蛋白和脂多糖, 改變細胞的通透性, 從而導致細胞溶解、死亡(胡桂英等, 2009).臭氧氧化滅菌后的沼液中小球藻快速生長, COD、NH3-N、TN和TP的脫除效率分別提高到73.9%、85.1%、80.1%和98.4%, 抗生素替米考星的脫除效率提高到83.5%.相對未滅菌條件, COD的脫除效率顯著提高了77.6%.這是因為臭氧對沼液的作用除了滅菌以外, 還會攻擊沼液中大分子有機物的苯環及其他不飽和基團, 使纖維素、有機酸等降解為小分子有機物, 從而有利于微藻吸收利用(Vaiopoulou et al., 2015).此處臭氧的使用量較小, 僅能將大分子轉化為小分子, 因此臭氧對COD的脫除率不高, 小球藻對小分子有機物的同化吸收是COD脫除的主要組成部分.因此, 結合本研究中沼液特點, 臭氧氧化滅菌是最優的滅菌方法.具體聯系污水寶或參見http://www.dongaorq.cn更多相關技術文檔。

　　圖 1

　　圖 1臭氧氧化滅菌和高壓蒸汽滅菌條件下微藻生長曲線(a)及污染物脫除效率(b) (各工況下均通入15% CO2)

　　3.3 CO2濃度對微藻生長脫除污染物的影響

　　微藻光合自養需要CO2, 考察了不同CO2體積濃度對微藻生長和營養同化效率的影響.當CO2濃度為2%時, 小球藻生物質產量為2.48 g · L-1(圖 2a).COD、NH3-N、TN和TP的脫除效率分別為42.5%、65.9%、68.1%和71.9%, 抗生素替米考星脫除效率為70.7%(圖 2b).隨著CO2濃度從2%增加到15%, 微藻生物質產量從2.48 g · L-1增加到4.50 g · L-1, 提高了81.5%.相應的COD、NH3-N、TN和TP的脫除效率分別提高到73.9%、85.0%、80.1%和98.4%, 抗生素替米考星的脫除效率提高到83.5%.光合作用分為光反應和暗反應兩個階段.光反應吸收光能產生ATP和NADPH, 為暗反應提供能量和原料.暗反應又稱碳固定反應, 利用光反應產生的ATP和NADPH, 將CO2固定為細胞中的有機物.隨著通入的CO2濃度增大, 沼液中光合作用暗反應的原料增多, 有利于加快暗反應的進行, 促進CO2固定為生物質, 從而導致微藻生長加快.除此之外, 藻液中連續通入CO2會導致藻液中H+濃度升高, 而微藻光合作用會消耗H+, 導致H+濃度升高.在低CO2濃度下, 藻細胞生長消耗H+速率比CO2溶解生成H+速率快, 因此pH上升, 而小球藻最適pH在6.0~6.5, 較低的pH值不利于藻細胞光合生長.隨著通入的CO2濃度從2%增加到15%, CO2溶解增多, H+生成速率接近消耗速率, 藻液的平均pH值從7.5下降到6.3(沼液初始pH范圍為6~6.5).隨著CO2濃度從15%繼續提高到30%, 微藻生物質產量從4.50 g · L-1降低到2.46 g · L-1.相應的COD、NH3-N、TN和TP的脫除效率分別降低至41.9%、69.7%、53.5%和61.1%, 抗生素替米考星的脫除效率降至72.7%.文獻表明, 過高濃度的CO2對微藻生長具有明顯抑制作用(楊熙等, 2017).隨著CO2濃度從15%提高到30%, 由于H+生成速率過快, 遠大于消耗速率, 因此培養液pH從6.3下降到5.7, 培養液的酸化使得藻細胞生長速率降低.通入體積濃度30%的CO2對微藻生長產生了較強抑制.實驗結果表明, 微藻培養時通入體積濃度為15%的CO2, 能夠促進微藻生長速率, 顯著提高沼液凈化效率.

　　圖 2

　　圖 2通入不同體積濃度CO2條件下微藻生長曲線(a)及污染物脫除效率(b) (各工況下均采用臭氧氧化滅菌)

　　3.4 沼液中添加P和Fe元素對微藻生長和污染物脫除的影響

　　由表 2可知, 沼液中磷元素(12.30 mg · L-1)和鐵元素(0.29 mg · L-1)濃度遠低于小球藻標準培養基.研究表明, 對淡水浮游植物, 當環境中的N : P摩爾比大于20 : 1時, 對植物造成磷限制(李夜光等, 2006).本實驗中使用的養豬場廢水厭氧發酵沼液N : P為69 : 1, 很顯然會對小球藻形成磷限制.鐵是藻類生長過程中電子傳遞、光合作用、呼吸作用等多個生物過程的必要元素, 是除N、P元素外藻類生長中最重要的元素, 缺鐵可導致葉綠素含量降低, 從而抑制光合生長(于洪賢等, 2016).因此, 為進一步提高微藻生長速率和污染物脫除效率, 研究了在沼液中添加10 mg · L-1 P元素和1 mg · L-1 Fe元素對微藻生長的影響.在不添加任何元素的條件下, 小球藻最大生物質產量為4.50 g · L-1(圖 3a).COD、NH3-N、TN和TP的脫除效率分別為73.9%、85.0%、80.1%和98.4%, 抗生素替米考星的脫除效率為83.5% (圖 3b).在沼液中添加10 mg · L-1 P元素后再接種培養小球藻, 此時小球藻最大生物質產量增加到5.36 g · L-1, 提高了19.1%.顯然, 添加P元素彌補了沼液中磷源不足的缺陷, 有利于促進微藻生長.相應的COD、NH3-N和TN的脫除效率分別提高到79.1%、87.8%和85.6%, TP的脫除效率為98.3%, 幾乎不變, 這是因為P元素相對缺乏, 在培養過程中幾乎可以全部利用.抗生素替米考星的脫除效率也提高到88.0%.

　　圖 3

　　圖 3沼液中添加P和Fe元素條件下微藻生長曲線(a)及污染物脫除效率(b) 

　　在沼液中添加1 mg · L-1 Fe元素后再接種培養小球藻, 相對于不添加任何元素的情況, 小球藻最大生物質產量增加到5.54 g · L-1, 提高了23.1%.添加Fe元素有利于微藻光合色素的合成, 促進新陳代謝, 從而加快生長速率, 提高營養鹽同化速率.相應的COD、NH3-N和TN的脫除效率分別提高到81.8%、90.3%和88.4%, TP的脫除效率為98.4%幾乎不變, 抗生素替米考星的脫除效率提高到90.7%.添加P元素和Fe元素均有利于提高微藻生物質產量和污染物脫除效率, 同時添加兩種元素時, 促進效果更加明顯.實驗結果表明, 在沼液中同時添加10 mg · L-1 P元素和1 mg · L-1 Fe元素后再接種培養小球藻時, 小球藻最大生物質產量為5.81 g · L-1, 相對未添加任何元素條件下提高了29.1%.兩種主要元素的補充使得沼液中的營養成分得以滿足微藻生長需要.相應的COD、NH3-N、TN和TP的脫除效率分別提高到88.5%、93.6%、91.2%和98.9%, 抗生素替米考星的脫除效率提高到90.7%.各種污染物的脫除效率均達到較高水平, 污染物濃度也達到國標排放標準.

　　4 結論(Conclusions)

　　1) 本文通過選擇滅菌方式、優化CO2濃度和沼液無機成分大幅提高微藻生物質產量和沼液凈化效率.對沼液臭氧氧化滅菌使生物質產量提高49.5%, 通入15% CO2使生物質產量提高81.5%, 添加10 mg · L-1 P元素和1 mg · L-1 Fe元素使生物質產量進一步提高29.1%.

　　2) 在最佳條件下:對沼液臭氧氧化滅菌, 添加10 mg · L-1 P元素和1 mg · L-1 Fe元素, 培養過程中連續通入體積濃度為15%的CO2, 小球藻生物質產量達5.81 g · L-1, 相應的COD、NH3-N、TN和TP的脫除效率分別為88.5%、93.6%、91.2%和98.9%, 抗生素替米考星的脫除效率提高到90.7%.

　　3) 微藻生物質富含油脂, 可提取并進一步加工成生物柴油.脫脂后的微藻生物質富含蛋白質、氨基酸等營養元素, 可用作畜禽養殖飼料.微藻凈化沼液的方法和技術在凈化沼液的同時, 利用太陽能將沼液中的污染物變廢為寶, 實現了廢棄物資源化利用.(來源：環境科學學報 作者：葉慶)