氧化石墨烯( GO) 是石墨烯基納米材料中較為典型的一種，其優異的性質在新能源、電子信息、生物醫藥、環境保護等領域都有巨大的應用潛力。然而GO 在生產、運輸、使用和廢棄過程中將會不可避免地進入到城市污水處理系統，目前城市污水處理系統主要依賴于操作簡便的活性污泥法，因此，探究GO 對活性污泥及污水處理效果的影響至關重要。
GO 的抗菌性已被廣泛證實，研究表明，其對細菌的毒性作用主要表現為對細胞膜的破壞以及氧化脅迫作用，所以，GO 對活性污泥微生物也必然存在一定的影響。現有關于 GO 細菌毒性的研究大多針對單一菌種，對活性污泥系統中微生物的毒性研究主要集中于高濃度的短期暴露影響，與現實情況中的低濃度、長期暴露環境區別較大。因此，探究GO長期暴露對SBR 性能和微生物群落結構的影響能為污水廠處理石墨烯基納米材料污染物提供科學依據，進而更加有效地處理各類突發情況。
1 材料與方法
1.1 材料和儀器
實驗用水為人工配制的模擬生活污水。模擬廢水組成: CH3COONa ( 512 mg / L) 、NH3Cl( 100mg / L) 、KH2 PO4 ﹒ H2O( 60mg / L) 及濃縮微量元素液; 實驗廢水的水質指標為 COD 400 mg / L，氨氮( NH4 N) 25 mg / L，總磷( TP) 10 mg / L，pH 為7.0 ～7.5。微量元素包括: MgSO4 ·7H2 O( 5. 07 mg / L) ，MnSO4 ·4H2 O( 0. 31 mg /L) ，FeSO4·7H2 O( 2. 49 mg / L) ，CuSO4( 0. 25 mg / L) ，Na2 MoO4 ·2H2 O( 1. 26 mg / L) ，ZnSO4 ·7H2 O( 0. 44mg / L) ，NaCl( 0. 25 mg / L) ，CaSO4 ·2H2 O ( 0. 43 mg / L) ，CoCl2 ·6H2 O( 0. 41 mg / L) ，EDTA( 1. 88 mg / L) 。實驗所用儀器為: 磁力加熱攪拌器、電磁式空氣泵、蠕動泵、電熱鼓風干燥箱、電子天平、超聲波清洗器、掃描電鏡、紫外分光光度計、pH 計、電子萬用爐。接種污泥取自長春市北郊污水處理廠好氧池活性污泥。
1.2 實驗裝置
實驗裝置為 4 個SBR 反應器，外徑 11cm，內徑10cm，有效容積2L，排水體積 1L。反應器設有進水口、出水口、排泥口、曝氣頭和攪拌器。調節溫度為 22℃ ±3℃ 、pH 值為7.6 ～8.0、溶解氧為3 ～3.5mg / L。SBR 反應器運行周期為8h，進水10min，厭氧攪拌120 min，曝氣210min，靜置沉降130min，出水10min。實驗裝置示意圖如圖 1 所示。
1－曝氣泵; 2－氣體流量計; 3－曝氣頭; 4－磁力攪拌器; 5－進水口; 6－出水口; 7－排泥口; 8－蠕動泵; 9－進水箱
圖 1 實驗裝置示意圖
1.3 實驗過程及采樣
反應器運行45d，在實驗開始前對活性污泥進行馴化，在脫氮除磷性能穩定后開始實驗。在4 個反應器中加入GO，使反應器中 GO 濃度為 0mg / L、1mg / L、5mg / L、10mg / L。根據出水和排泥所損失的GO 量，每天添加一定量的GO。反應器每天運行3 個周期，每2d 選取固定時間對各反應器出水取樣。
1.4 水質指標分析方法
各反應器出水用0.45 um 的水系濾膜濾后的NH4 N、TN、TP 均采用國家標準方法測定。COD、PH、DO均采用哈納檢測儀進行檢測。
1.5 高通量測序方法
本文中污泥樣品的測序工作由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。根據 E.Z.N.A. soil 試劑盒 ( O- mega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.) 說明書進行總DNA 抽提，DNA 濃度和純度利用NanoDrop2000 進行檢測，利用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 提取質量; 用 338F( 5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG- 3’) 和806R( 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’) 引物對 V3 - V4 可變區進行 PCR 擴增。利用 Illumina 公司的 MiseqPE300 平臺進行測序。原始測序序列使用 Trimmomatic 軟件質控，使用FLASH 軟件進行拼接。使用的UP-ARSE 軟件( version 7.1) ，根據 97%的相似度對序列進行OTU 聚類; 使用UCHIME 軟件剔除嵌合體。具體聯系污水寶或參見http://www.dongaorq.cn更多相關技術文檔。
2 結果與討論
2.1 GO 對 SBR 系統性能的長期影響
各反應器出水中COD 濃度如圖2 所示。進水 COD 約為 400mg / L，在45d 的運行時間里，控制組的 COD 平均去除率達到95.1%。1mg / L GO 對COD 的去除影響并不明顯; 在 11d 時，5mg / L GO 組的出水 COD 上升到 42mg / L，去除率下降到 89.5%; 在21d 時，出水COD 達到最高，濃度為 67mg / L，去除率下降到 83.3%; 21d 后，出水COD 濃度有所下降，但平均去除率仍在89% 以下。10mg / L GO組的出水COD 高于控制組，最高時達到43mg / L，去除率為89. 3%。
圖 2 GO 對 COD 去除的影響
分析結果可知，5mg / L GO 與 10mg / L GO 均對 SBR系統的 COD 去除率產生了抑制，5mg / LGO 對 COD 去除的抑制作用更強。污水生物處理去除COD 主要是通過污泥微生物的生產代謝對污水中的有機物進行利用，除此之外，還有可能被菌膠團等物質吸附后隨剩余污泥排出。因此，10mg / L GO 對去除 COD 的抑制效果低于 5mg / L GO 的原因可能是GO 對反應器中的有機物產生了更好的吸附，一定程度上降低了 COD。但顯而易見的是，GO 對活性污泥微生物產生了一定的毒性，并且能夠降低有機物的去除效率。
4 個反應器中出水氨氮的濃度如圖 3 所示。進水氨氮約為25mg / L，控制組的氨氮濃度去除率達到95. 1%，1mg / L GO 組的出水氨氮濃度與控制組的區別不大，在23d 后略高于控制組。5mg / L GO 與10mg / LGO 對氨氮的去除有明顯的抑制，在29d 前，10mg / L GO 的出水氨氮濃度高于5mg / LGO 組，隨后氨氮濃度有所下降并趨于平穩，而5mg / L GO 在29d 后的氨氮濃度高于10mg / L GO。在出水氨氮趨于平穩后，5mg / LGO 組的氨氮平均去除率下降到70.5%，10mg / L GO 組的平均去除率為70.2%。
通過實驗結果推斷，GO 能夠抑制硝化細菌的活性，削弱其將氨氮轉化為亞硝態氮的能力。其原因可能是由于GO 的存在，使得硝化細菌生長速率降低，從而抑制硝化作用。
圖 3 GO 對氨氮去除的影響
各反應器總氮濃度如圖 4 所示。為期45d 的實驗期間，控制組與1mg / L GO 組的總氮去除率區別不大，平均去除率分別為 84.1%和 83.4%。實驗開始后，5mg / LGO 組與10mg / LGO 組的出水總氮濃度逐漸上升，并在17d 左右開始趨于穩定，且10mg / LGO 對總氮去除的抑制程度高于5mg / LGO。二者在45d 內的總氮平均去除率分別下降至60.3%和54.1%。這一結果說明，GO 對脫氮細菌的生物活性存在抑制作用。
圖 4 GO 對總氮去除的影響
4 個反應器中出水 TP 濃度如圖 5 所示，進水 TP 約為 10mg / L，控制組與 1mg / L GO 組的總磷去除率均在 90%以上，說明低濃度 GO 對總磷的去除并無顯著影響。5mg / L GO 組的出水 TP 濃度最高達到 7. 11mg /L，去除率下降 28.9%，10mg / L GO 組的出水 TP 濃度最高達到 5.98mg / L，去除率為 40.2%。由數據可知，GO長期暴露后，5mg / L GO 對總磷去除的抑制程度要略高于 10mg / L GO。GO 對除磷效率的抑制可能是由于其對活性污泥中除磷相關細菌活性的抑制，也有可能是由于微生物細胞因 GO 的毒性而破裂，使內容物外泄從而導致總磷升高。
圖 5 GO 對總磷去除的影響
2.2 微生物群落多樣性分析
可以通過單樣本的多樣性( Alpha 多樣性) 分析來反映微生物群落的豐富度和多樣性，包括通過一系列統計學分析指數來估計環境群落的物種豐度和多樣性。OTU( Operational Taxonomic Units) 是為了便于分析，人為給某一個分類單元( 品系，屬，種、分組等) 設置的統一標志，再通過聚類操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，一個小組就是一個OTU。反映群落豐富度的指數有sobs、chao、ace 等; 反映群落多樣性的指數有 shannon、simpson、npshannon 等; 反映群落覆蓋度的指數為coverage。
本文列舉了具有代表性的 OUT、shannon、simpson、coverage、chao 指數。shannon 指數越大，simpson 指數越小，說明樣品生物多樣性越高; Chao 指數越高，表明群落豐度越高; coverage 數值越高，則樣本中序列被測出的概率越高。如表 1 所示，GO 短期暴露的4 個樣品中，5mg / L GO 的 OTU 數量最低，而1mg / L GO 與 10mg / L GO 的OTU 數與空白組相差不大。短期暴露的 4 組樣品中，5mg / L GO 的多樣性最低，物種豐度也較其他 3 組更低。而1mg / L GO 的多樣性比空白組更高，可能是由于低濃度 GO 對微生物有促進作用。
長期暴露的4 組樣品多樣性與物種豐度普遍低于短期暴露的樣品，其原因可能是實驗室的配水與實際污水相比過于單一。但不同濃度的 GO 仍然對活性污泥的多樣性產生了不同的影響。與短期暴露時相同，5mg / L 的 OTU 數最低( 776) ，比空白組( 992) 降低了約 20%，1mg / L GO( 791) 與10mg / L GO( 794) 的 OTU 數也都低于空白組。4 組樣品中，5mg / L GO 的 shannon、chao 指數最低，simpson 指數最高，物種多樣性與群落豐度最低。總的來說，5mg / L GO 對物種多樣性的負面影響最大，而1mg / L GO 在短期暴露時會增加物種多樣性。
如圖 6 為污泥樣品在門水平的細菌豐度分布圖。由圖 6 可知，變形菌門( Proteobacteria) 、擬桿菌門 ( Bacteriodetes) 、放線菌門( Actinobacteria) 綠灣菌門( Chloroflexi) 為 4 種優勢菌群。其中，變形菌門的含量占總菌數的 43.2% ～ 67.5%，在所有樣本中處于絕對優勢。說明變形菌門的變形菌門細菌能夠很好地去除廢水中有機物，是污水處理廠常見的菌種，且均為革蘭氏陰性菌。長期暴露的樣品與短期暴露相比，變形菌門的比例均有提升，而長期暴露的5mg / L GO 污泥樣品中，變形菌門的比例最高，達到了 67.5%。
擬桿菌門在長期暴露時也受到較大的的影響，擬桿菌門能促進含氮物質的利用、轉化類固醇生物和水解大分子物質，對生物脫氮過程起到重要作用，是專性厭氧微生物。GO 長期暴露后，擬桿菌門的相對豐度有不同程度的上升，其中，10mg / LGO 的擬桿菌豐度上升最高，達到34.5%。
GO 長期暴露的樣品中放線菌門與綠灣菌門的相對豐度普遍低于短期暴露的樣品。長期暴露的 4 個樣品中，放線菌門相對豐度的下降幅度更為明顯，而綠灣菌門的相對豐度隨 GO 濃度的增加而下降。
圖 6 門水平微生物群落分布
從暴露時間角度考慮，GO 短期暴露與長期暴露對污泥樣品門水平的菌群豐度分布會產生不同的影響，長期暴露會增加變形菌門與擬桿菌門的豐度，降低擬桿菌門與放線菌門的豐度。從暴露濃度角度考慮，暴露45d 時，5mg / L GO 對變形菌門細菌促進作如圖 7 所示。污泥樣品在屬水平上共檢測出 47 個屬，優勢菌屬有Cytophagaceae、Thiothrix、Xanthomonadaceae、Acinetobacter、Candidatus Competibacter、Anaerolineaceae、Saprospi-raceae、Nitrosomonadaceae、Comamonadaceae、Nitrospira、Zoogloea、Saprospiraceae 等。Cytophagaceae 具有脫氮除磷的功能，是污泥樣品中最優勢的菌屬。暴露45d 時，5mg / LGO 的 Cytophagaceae 菌屬豐度下降較為明顯，這可能是由于絲硫菌屬( Thiothrix) 在競爭中形成了較大優勢，對 Cytophagaceae 菌產生了抑制。絲硫菌是引發污泥膨脹的主要菌屬，5mg / LGO 樣品中絲硫菌豐度上升了23.3%，這也解釋了長期暴露時反應器的污泥沉降性下降的原因。Xanthomonadaceae 細菌具有脫氮功能，經過 GO 長期暴露后，其相對豐度由空白組的7. 5%降到了4.6%，且GO 濃度越高下降幅度越大，這也可能是導致反應器脫氮能力降低的原因。Nitrospira是典型的亞硝化細菌，Thauera 菌具有反硝化作用，這兩種菌在長期暴露后的相對豐度也都下降到1% 以下。
Tetrasphaera 是除磷菌，該菌也在長期暴露后豐度明顯減少。Anaerolineaceae 具有反硝化功能，經GO長期暴露后豐度有一定程度的上升。
3 結論
( 1) 1mg / LGO 對各水質指標沒有明顯影響，5mg / L GO 與10mg / LGO 則對 COD、NH4 + - N、TN、TP 都有不同程度的抑制作用，其中，5mg / LGO 對出水水質的影響大于10mg / L GO; 而GO對磷去除的抑制作用最
圖 7 屬水平微生物群落分布
強，GO 濃度為 5mg / L 時，去除率最低時下降到 28.9%。
( 2) 結果表明，高濃度 GO 會明顯降低微生物群落的豐富度和多樣性，其中，5mg / L GO 的影響大于 10mg / L GO，1mg / L GO 在短期暴露時能夠提升物種多樣性。GO 長期暴露后變形菌門與擬桿菌門的種群豐度有明顯提升; 5mg / L GO 樣品中絲硫菌( Thiothrix) 豐度上升到 23.3%，這解釋了污泥膨脹及沉降性變差的原因; Xanthomonadaceae、Nitrospira、Thauera 等與脫氮有關的功能性菌屬在高濃度 GO 暴露后豐度有明顯下降，這解釋了 SBR 反應器脫氮能力下降的原因; 除磷菌( Tetrasphaera) 在 GO 長期暴露后豐度也有所下降，這也對應了 GO 對 SBR 反應器除磷能力的抑制。(來源：東北師范大學 環境學院)
