我國的工業化和城市化的快速發展大大推動了國內污水處理廠的建設，隨之而生的大量剩余活性污泥的無害化處置，成為了我國在未來必須面對的挑戰。污泥中含有病原菌、抗生素、重金屬等物質，若不妥善處理，會造成土地污染、地下水污染甚至大氣污染等嚴重環境問題。但因為污泥中含有大量有機質，可作為生物質資源，因此歐美國家主要使用厭氧消化工藝對剩余污泥進行“無害化”“資源化”處理。但是，我國污泥含水量高（>80%）且含有大量沙石，嚴重限制了污泥厭氧發酵的產氣效率。
近年的研究發現，通過一定的預處理手段能提高剩余污泥的甲烷產氣率。目前常用的污泥預處理方式有物理、化學、生物法或者聯合預處理法，均展現出了一定的應用前景：何順通過熱堿結合預處理污泥后與香蕉秸稈發酵，甲烷產率為183mL/g，相比未預處理時提高了3倍；Choi等通過熱水解預處理使污泥累積產甲烷量提高了1.4倍；謝帥等發現，當剩余污泥和餐廚垃圾混合發酵時，各種預處理法對于混合發酵的促進作用大小為熱處理＞超聲處理＞堿處理。
相比于耗能巨大的熱水解、工藝復雜的化學試劑添加等，生物預處理耗能低、操作簡單，更重要的是不會產生難降解聚合物質，使得處理后的原料對產酸菌、產甲烷菌的毒性更低，有機質的甲烷轉化率更高。生物預處理法包括酶處理和生物強化處理，通過淀粉酶、蛋白酶或產水解酶菌等，破壞大分子有機質的結構來提高污泥的降解率。但是酶處理法成本較高，生物強化法效果不穩定等問題限制了該技術的應用。
研究發現發酵液回流可明顯提高反應基質的產氣量，因為其中富集了豐富的甲烷菌、各類水解菌及水解酶。沼液回流技術普遍是將沼液直接回流進發酵罐中，目的是截流發酵罐內甲烷菌，但很少考慮到利用其中豐富的水解菌。本研究利用發酵液代替商業酶對污泥進行水解酸化預處理，從提高原料利用率的角度提高污泥產氣效率。
本研究首先使用正交試驗確定污泥厭氧發酵的最佳溫度、總固體含量（TS）和接種量，隨后利用不同比例的污泥厭氧發酵沼液對污泥進行酸化預處理，再通過產甲烷潛力試驗（biochemical methane potential，BMP），以最終累計甲烷產率為量化指標，得出最佳沼液回流比。
1、材料與方法
1.1 試驗原料
所用污泥取自四川省遂寧西南城市污水處理廠，放入4℃冰柜保存；接種物豬糞取自四川省成都市雙流縣，密閉常溫保存。接種物在中溫條件（37℃）下馴化3d，至產氣甲烷體積分數>60%。原料各種物理基本理化特性見表1。
1.2 儀器設備
所用批次發酵設備如圖1所示。整個裝置由兩個1L的帶有導管的玻璃瓶全密封組成，一個是厭氧反應瓶，一個是集氣瓶。水浴恒溫加熱控制反應溫度。
備裝有MolSieve13X（80/100SS）的3m不銹鋼柱熱導檢測器。氦氣用作載氣，流速為5.2mL/min，進樣口、色譜柱和檢測器溫度分別為200、80及220℃；氣相色譜6890N（Agilent），配備火焰電離檢測器和30m×0.25mm×0.25mm毛細管柱（DB-FFAP，USA），氫氣用作載氣，流速為5.2mL/min，進樣口、色譜柱和檢測器溫度分別為200、80及220℃；SX-5-12型馬弗爐；雷磁PHS-3E型pH儀；TU-1810SPC紫外可見光光度計；XMTD-7000電熱恒溫水浴鍋。
1.3 試驗方法
1.3.1 正交試驗優化剩余污泥厭氧發酵條件
在文獻調研的基礎上，設溫度（A）、總固體含量TS（B）、接種量（C）3個因子，每個因子設3個水平進行發酵試驗，通過正交試驗，以產氣總體積為考察指標，確定剩余污泥厭氧發酵的最佳環境條件。正交因素水平表見表2.根據表2設計3因素3水平9組正交試驗，每個組合4個平行，每天測量氣體甲烷含量和產氣體積。同體積接種物作為空白組。
1.3.2 不同比例回流液進行污泥酸化預處理
采用批次試驗探索污泥發酵液回流對污泥酸化預處理的影響。收集污泥在最佳厭氧發酵條件下產氣結束后的沼液為回流液，對污泥進行中溫酸化預處理。回流液使用前需在35℃下馴化至產氣甲烷體積分數>60%。按污泥鮮重，設置5個回流比（0%、5%、10%、15%和20%，V/m），添加回流液，后加入清水使各組酸化總體積相同。混合物密封放入35℃恒溫培養箱中培養3d，每天定時取樣測定揮發性脂肪酸（VFAs）含量，取樣前需晃動瓶身至物料均勻混合。
1.3.3 產甲烷潛力試驗
以上述5組回流液酸化預處理后的污泥為發酵底物，按最佳條件進行污泥BMP試驗。每天測量氣體成分和產氣體積，最后根據累計產甲烷率采用Gompertze修正模型分析。對照組使用未進行酸化處理的污泥作為發酵底物進行BMP試驗。同體積沼液接種物作為空白組。
1.4 測定方法
每日同時間點使用5mL注射器采集氣體樣，2h內使用氣相色譜（安捷倫7890A）測量氣體成分；液體樣經1000r/min離心10min后，1mL上清液加入100μL甲酸酸化（10:1，V/V），混合液離心后過0.45μm水系濾膜，0.1μL進樣量，氣相色譜（安捷倫6890N）測定VFAs；產氣總體積采用排水法測定；總氨氮（totalammonianitrogen，TAN）采用納氏試劑比色法；總固體含量（TS）、揮發性固體含量（VS）采用烘干法測定。
1.5 計算方法
公式（1）中n為發酵天數，V為每日產氣量（mL），c為氣體甲烷含量（%），m為TS質量（g）。
公式（2）為Gompertze擬合方程，RCH4是實際甲烷產率（mL/gTS-1），使用平均值進行擬合，P為預測甲烷產率（mL/gTS-1），Rmax為最大日產甲烷量（mLg-1d-1），λ為反應延滯期（d）。P、Rmax、λ根據試驗數據擬合得到。
公式（3）中TS1為初始含固率（%），TS2為反應結束后沼液含固率（%）。VS去除率算法一致。
試驗數據用軟件Excel2019和Origin9.0進行處理，除特殊說明外，所有結果以平均值±標準差表示，顯著性差異標注于數據或圖上。
2、結果與分析
2.1 污泥厭氧發酵環境條件正交試驗
正交試驗結果如表3所示。根據正交試驗極差分析法可知，影響總產氣量最主要因素是TS，其次是接種量、溫度。由K值確定污泥厭氧發酵最佳環境條件為溫度45℃，TS含量8%，接種量45%。根據各組產氣結果，第3組氣體體積最高，為6022±121mL。第3組環境條件為35℃，TS含量8%，接種量45%，與最佳環境條件差別僅為溫度，且因為溫度是3因素中影響最小的，所以從節約能源的角度出發，應將第3組條件設定為污泥厭氧發酵環境條件。
在其他研究過程中，發現污泥厭氧發酵條件為35℃，TS8%，接種量40%時（試驗組），污泥累計產甲烷率為64.25mL/g，高于上述設定條件下（對照組）的產甲烷率57.09mL/g（P<0.05）。結果如圖2所示。研究表明，不同接種物體積導致產酸菌和產甲烷菌比例不同，所以更高的接種量不一定產生更高的產甲烷量。所以，本研究污泥厭氧發酵條件優化結果為溫度35℃，TS8%，接種量40%。下述如無特殊說明，污泥BMP試驗均在此條件下進行。
2.2 不同回流比污泥酸化預處理
按照污泥鮮重添加5種不同比例的回流液（0%、5%、10%、15%和20%，V/m），分別是A組、B組、C組、D組和E組，每個處理3個平行，選用平均值作圖（圖3）。第0天為剛加入的回流液與樣品混合后取樣，即各組初始VFAs濃度分別為13669.2±839.7、14114.7±302.6、14390.6±78.1、15285.8±1460.8和14322.6±482.5mg/L，各組VFAs濃度初始值無顯著差異（P>0.05）。從圖3可以看出，酸化作用在第1天就開始了，并且B、C、D、E組VFAs含量在酸化第2天就達到了最高值，分別為18431±873.7、18152.8±65、21874.7±2007.6和25797.2±168mg/L，比初始值增加了30.58%、26.14%、43.10%和80.11%。且以乙酸、丙酸的含量增加為主。對照組A組在第3天達到最大值19783.5±1227mg/L，比初始值增加了44.73%。此外，除C組有不太明顯的上升現象外（P>0.05），其他3組均在第3天出現了揮發酸濃度下降的現象，但均高于初始值。所以，最終VFAs濃度由大到小的順序為A組（19783.5±1227mg/L）>E組（18857.6±550.1mg/L）>C組（18568.1±549.1mg/L）>D組（17761.9±514.3mg/L）>B組（16623.1±722.1mg/L）。
由以上結果可得，加入回流液處理后酸化階段能更快達到產酸高峰，且回流比越大，VFAs濃度越高。這說明回流液能有效增加污泥酸化階段效果，增加產酸量，縮短酸化時間。這可能是因為回流液富集了大量具有降解功能的微生物菌群和水解酶，這些微生物與水解酶共同作用，快速分解污泥中的大分子物質產生有機酸。此外，A組未添加回流液，但也表現出明顯的酸化現象，說明原污泥內存在部分降解菌，在環境條件適宜時，便能分解污泥。Wu等通過微生物群落分析也發現，污泥來源對污泥厭氧發酵群落結構的影響巨大，說明了污泥所含的初始微生物的重要性。值得注意的是，除A組外，各組揮發酸濃度在第3天明顯下降，可能是因為原料中的好氧微生物的生長代謝消耗了部分有機酸。這說明發酵回流液強化污泥酸化反應的效果跟反應時間存在密切關聯，時間太短酸化不徹底，時間太長會折損回流液的酸化效果。污泥厭氧發酵是一個動態調控的過程，至今我們仍未掌握更加精準的調控規律，因此，回流液對整個厭氧發酵過程的影響，還有待進一步的BMP試驗確定。
2.3 不同比例回流液對污泥厭氧發酵的影響
酸化后的污泥BMP試驗結果如圖4A所示，發酵周期為18d，各組累計產甲烷量（mL/g）由高到低為B組（82.36±0.56）>D組（76.80±2.82）>C組（72.54±2.08）>E組（71.51±2.57）>A組（68.54±2.35）。該結果說明，回流比為5%時，回流液對污泥厭氧消化過程的促進作用最明顯。而B組在酸化階段結束時VFAs含量最低，說明VFAs含量并不能準確地推斷系統產氣能力，還需根據BMP試驗來確定最佳工藝和回流比。
CK為原污泥直接發酵，累計產甲烷量為57.21±1.92mL/g。B組相對CK組，累計產甲烷量提高了43.96%，D組提高了34.24%，C組提高了26.8%，E組提高了25%，A組提高了19.8%。該結果說明，回流液預處理能提高污泥的甲烷產率；不同回流比對污泥的兩相厭氧消化反應的促進程度不同，隨著回流比的增大，呈現先增加后降低的趨勢。
本研究對試驗數據進行了Gompertz修正方程擬合（圖4B），進一步分析污泥厭氧消化產沼氣動力學過程。根據表4的參數結果顯示，B組的理論甲烷產率最高，為85.53mL/g，比CK組提高了49.5%。此外，添加了回流液的組理論甲烷產率均比A組和CK組高，與實際趨勢相同。B組最大產甲烷速率（Rmax）為8.81mLg-1d-1，比CK組提高了46.83%，相對A組則提高了20.52%，其他3個回流比也都高于CK組和A組。此結果表明，回流液能提高污泥的產甲烷率，提高原料有機質轉化率。另外，污泥經過酸化處理后發酵，延滯期明顯低于CK組（P<0.05），但不同回流比之間的延滯期差距不明顯（P>0.05），這可能和酸化時間有關。本研究的酸化停留時間為3d，此時各組VFAs含量從最高值下降，說明各組都達到了酸化成熟階段，所以各回流比處理對縮短厭氧發酵延滯期的作用差距不明顯。此外，第3天各組VFAs含量差別不大，則高回流比造成的pH值差異不大，對產甲烷過程的抑制作用也不明顯。值得注意的是，A組未添加回流液，但延滯期仍低于CK組（P<0.05），說明中溫培育也能縮短反應總時間，提高污泥厭氧消化系統的效率。污泥酸化預處理厭氧發酵工藝比普通發酵更具有應用價值。污泥酸化預處理，高活性微生物水解菌成功的對污泥結構進行了破壞，同時將更多的污泥有機物在短時間內轉化為可被甲烷菌利用的有機酸，從而提高了污泥厭氧發酵產氣率。
根據表4的結果，B組Rmax值高于A組，說明B組系統內的甲烷活性高于A組，因為回流液能增加系統內甲烷菌的豐度，使B組有機質轉化效率提高，從而產生了更多甲烷。而回流比更高的C、D、E組Rmax值略低于B組，可能是因為后3組的有機質在預處理階段被消耗太多，導致產甲烷期能被甲烷菌利用的有機質減少，底物濃度限制菌落活性，因此污泥產甲烷率更低。
圖5A記錄了在發酵過程中各組TAN和pH的平均值變化，B、C、D和E組的初始TAN值高于CK組和A組，但隨著發酵反應的進行各組之間TAN值差異減小，說明加入回流液會增加產甲烷反應初始TAN值，但并不會出現系統氨抑制，使反應失衡。該結果與Chan等的研究結果一致。此外，各組pH值在反應過程中也較穩定，處理組與對照組之間差異不大。
圖5B給出了各組TS去除率（%）結果，由大到小排序為A組（29.36±0.14）>B組（24.06±0.39）>D組（21.47±0.05）>E組（17.00±0.18）>C組（14.83±0.33）；VS去除率（%）變化趨勢一致：A組（31.22±0.18）>B組（29.68±0.29）>D組（23.56±0.28）>E組（16.99±0.23）>C組（15.46±0.08）。該結果說明，添加5%回流液就能明顯促進污泥有機質的去除。根據揮發酸試驗結果，回流比越大，最高VFAs值越大。D、E組在酸化階段VFAs值偏高而發酵產氣階段VS去除率偏低，進一步證明了過高的回流比，會使污泥有機質在酸化階段被浪費，無法進行有效的能源轉換。值得注意的是，A組的TS、VS去除率高于添加了回流液的組，但實際產甲烷率卻沒有增加，該結果說明，A組的污泥有機質并沒有轉化為生物氣體甲烷。可能是因為A組的甲烷菌活性不高，菌落活性低限制了底物轉化率，說明回流液有優化厭氧產氣反應群落結構的效果。因此根據試驗結果可知，回流液能夠明顯強化污泥厭氧發酵效果，且最佳回流比為5%（V/m，TS）。
3、討論
本研究結果表明，加入5%回流液，在35℃下酸化預處理3d，污泥厭氧發酵累計產甲烷率為68.54±2.35mL/g，提高了43.96%。回流液酸化預處理，能夠提高污泥總VFAs含量，提高甲烷菌含量，優化反應器產酸菌與產甲烷菌的比例，從而提高污泥產甲烷率。回流液所含豐富的水解酶和水解菌，使它具有代替商業酶的應用潛能，可作為污泥酶預處理的廉價原料來源。此外，從工藝實施角度，本研究的回流液酸化預處理與物理、化學預處理方式相比，設備成本優勢明顯。之前的研究結果表明，熱水解技術使污泥厭氧發酵投資費增加了26%，一噸干污泥處理費用高達550元。高昂的設備費和能耗費，同樣使熱水解、超聲等技術難以推廣實施。而污泥回流液酸化預處理工藝，無須增加設備費，且易于操作，能耗低，并能有效提高污泥產氣效率，非常適用于我國中小型污泥厭氧發酵廠的升級改造工程。
在同樣的溫度和預處理時間下，與未添加回流液組相比，回流液組更低的TS、VS去除率能獲得更高的甲烷產量，說明回流液能促進污泥有機質定向轉化為能源物質甲烷，加強污泥的“資源化”利用。
除了提高污泥產甲烷率，回流工藝能提高反應穩定性。厭氧發酵工程會使部分沼液直接回流進入發酵罐，容易產生氨抑制、酸積累等致使反應器失衡、產氣被抑制甚至停止產氣。本研究使用低回流比強化厭氧反應，另一方面，發酵液回流入酸化階段，通過原料產酸來平衡回流液的氨抑制作用，更能加強厭氧系統長期運行的穩定性。
值得注意的是，當加入20%回流液時，污泥總VFAs含量提高了80.11%，但并沒有獲得更高的污泥累計甲烷產量。因為回流液中含有部分好氧微生物消耗了這些物質，造成了污泥有機質的浪費。如果能夠屏蔽回流液中雜菌的影響，也許能進一步提高污泥產甲烷率。例如，Kavitha等使用生物法強化污泥酸化階段，他們在污泥酸化相中添加了兩株分離自污泥的產蛋白酶、淀粉酶的Bacillus03/04菌株培養液，進行72h酸化后，使污泥產甲烷率提高了80%，遠高于本研究結果。此外，回流液的來源也會影響污泥的產氣效果。Luo等通過對餐廚垃圾產酸相的滲濾液進行50%回流，使餐廚垃圾產甲烷率提高了70%左右。這可能是因為產酸相的條件更適合富集水解菌和水解酶，所以當它作為接種物時對原料的水解效果更強。污泥兩相厭氧發酵中的產酸相的滲濾液可能存在更豐富的、更有利于降解污泥類有機質的水解菌，如果回流污泥產酸相滲濾液，或在體系中添加從產酸相沼液中分離出的高效水解菌，或可以進一步強化污泥的預處理效果。
4、結論
本研究評價了中溫條件下（35℃），污泥發酵沼液對污泥厭氧發酵產沼氣的影響，證明了發酵液回流酸化預處理污泥工藝的可行性。試驗結果表明，當回流比為5%時（V/m，TS），污泥厭氧發酵周期為3+17d，累計產甲烷率為82.36±0.56mL/g。根據Gompertz修正方程擬合結果，得到試驗延滯期縮短至2.97d，最大日產甲烷量為8.81mLg-1d-1。該研究成果優化了傳統污泥厭氧發酵工藝，提高了污泥產氣率，且易操作，能耗低，為回流液的工程應用提供理論基礎。此外，回流液對污泥預處理的能力有限，今后可以從濃縮回流液濃度，定向富集回流液水解功能菌群等角度出發增強回流液對污泥的酸化預處理能力，進一步提高污泥累計產甲烷率。（來源：中國科學院成都生物研究所，中國科學院大學，中國科學院環境與應用微生物重點實驗室，廣西師范大學，四川能投水務投資有限公司）
