隨著我國經濟的發展和人口的增長，餐廚垃圾（FW）和污水處理廠剩余污泥（WAS）的產量增長迅速。厭氧發酵是實現剩余污泥和餐廚垃圾穩定化、減量化和資源化的主流技術之一，且其可產生高附加值的揮發性脂肪酸（VFAs）等產物。我國剩余污泥的碳氮比（C/N）為4.6～5.0，餐廚垃圾的C/N為10～30，而厭氧發酵技術適宜的C/N為10～20，選擇適當配比的剩余污泥和餐廚垃圾厭氧共發酵可提高有機質轉化效能。
水解階段是厭氧發酵的主要限速步驟。電化學預處理技術（EPT）被認為是強化厭氧發酵水解產酸的有效手段之一，EPT通過電化學過程產生強氧化性物質，可破壞污泥細胞穩態結構，有利于胞內有機質溶出，進而提高厭氧發酵的VFAs產量。由于餐廚垃圾中含鹽量（主要為NaCl）較高（約為0.34%～6.4%），這些鹽分經過電化學預處理后可生成活性氯化物（RCS），一方面RCS具有強氧化性，可促進胞內有機質溶出，富集篩選發酵功能菌；另一方面其濃度過高會抑制厭氧發酵菌的活性，降低產酸效能。因此，探究鹽度對電化學預處理后厭氧發酵產酸的影響，可確定剩余污泥-餐廚垃圾厭氧共發酵的最佳鹽度和適宜RCS濃度范圍，進而提高發酵功能菌占比和VFAs產量，但截至目前尚未見相關方面的研究報道。鑒于此，筆者研究了不同鹽度（3、6和10g/L，以NaCl計，下同）對電化學預處理后剩余污泥-餐廚垃圾厭氧共發酵產酸的影響，測定預處理前后有機質溶出情況和RCS濃度，考察厭氧發酵過程中VFAs產量及組成、微生物群落結構及數量的變化，探究最佳鹽度。
1、材料與方法
1.1 實驗材料
實驗用剩余污泥取自武漢市湯遜湖污水處理廠二沉池，經5mm篩網過濾后，用去離子水清洗3次以去除雜質和鹽分。餐廚垃圾取自華中科技大學東園學生食堂，主要成分為肉、蔬菜和米飯，除去懸浮油脂和鹽分后用攪拌器研磨成漿液狀態。剩余污泥和餐廚垃圾均于4℃冰箱中保存。厭氧共發酵所用接種物取自實驗室規模的中溫半連續餐廚垃圾厭氧發酵罐。分別檢測接種污泥、剩余污泥和餐廚垃圾的pH、總懸浮固體（TSS）、揮發性懸浮固體（VSS）、溶解性化學需氧量（SCOD）、碳水化合物、溶解性蛋白質和氨氮等常規指標，具體見表1。
1.2 電化學預處理實驗
1.2.1 電化學預處理裝置
電化學預處理實驗裝置由電化學工作站、電極、2000mL燒杯和磁力攪拌器組成，如圖1所示。電化學工作站可提供穩定電壓，電極采用4片網狀電極交替組成，根據前期研究結果，兩片為表面涂覆釕銥金屬氧化物涂層（Ti/IrO2-RuO2）的鈦基陽極板，兩片為純鈦基的陰極板，連接桿長12.0cm，電極網長6.0cm、寬5.0cm，極板間距為1.0cm。本實驗使用5V恒定電壓，采用磁力攪拌器對剩余污泥-餐廚垃圾進行攪拌混勻，避免電化學預處理過程中基質沉降，轉速為180r/min。
1.2.2 電化學預處理實驗設計
根據前期研究結果，按照剩余污泥和餐廚垃圾比例為1∶1（以VSS計）配制3組混合基質。燒杯有效容積為1000.0mL，分別投加419.7mL剩余污泥、29.5mL餐廚垃圾和550.8mL去離子水。配制后混合基質的TSS為8.6g/L，VSS為6.0g/L。根據前期實驗結果和相關文獻，向每組混合基質中加入不同劑量的NaCl，控制鹽度分別為3、6和10g/L。將配制好的3組混合基質在5V恒定電壓下處理60min，并在室溫下避光放置0.5d作為實驗組，分別命名為S3-EPT、S6-EPT和S10-EPT，以相同鹽度梯度但不進行電化學預處理的混合基質作為對照組，分別命名為S3-Blank、S6-Blank和S10-Blank。分別在電化學預處理開始前和結束后取3～5mL混合基質樣品，采用0.45µm過濾器過濾，分析SCOD、碳水化合物、溶解性蛋白質、VFAs、RCS等指標。
1.3 混合基質厭氧共發酵實驗
預發酵實驗中S10-Blank和S10-EPT組的VFAs累積產量顯著低于其他四組，故混合基質厭氧共發酵實驗僅從4個預處理燒杯（S3-Blank、S6-Blank、S3-EPT和S6-EPT）中分別取161.0mL轉移到250.0mL厭氧發酵瓶中，再加入39.0mL接種物，此時厭氧共發酵固液混合物總體積為200.0mL，TSS為11.4g/L，VSS為8.7g/L。隨后將厭氧發酵瓶密封并放入恒溫箱搖床中，溫度為（38±0.2）℃，轉速為150r/min，進行20d的厭氧共發酵實驗。每兩天從發酵瓶中取3～5mL混合樣品，過濾后分析發酵液的VFAs等理化指標。在第2和14天分別采集1mL樣品進行功能微生物測序以分析微生物群落結構，同時對第14天采集的樣品采用相關試劑盒檢測關鍵酶活性。實驗均設置平行組，并計算平均值和標準偏差。
1.4 分析項目與方法
TSS和VSS采用重量法測定，SCOD采用重鉻酸鉀法測定，溶解性蛋白質采用福林酚法測定，碳水化合物采用硫酸-蒽酮法測定，氨氮采用納氏試劑比色法測定。上清液中的RCS含量采用N，N-二乙基對苯二胺（DPD）分光光度法測定，以Cl2計。甲烷含量采用氣相色譜儀（GCTrace1300，賽默飛）測定，VFAs含量及組分采用氣相色譜儀（GC-2014，島津）測定。按照試劑盒法（硅基質吸附柱）從混合基質樣品中提取細菌和古菌總DNA，擴增DNA序列，按照標準規程在IlluminaMiSeq平臺上進行高通量測序。采用相關試劑盒對α-葡萄糖苷酶、蛋白酶、乙酸激酶（AK）、磷酸轉乙酰酶（PTA）、草酰乙酸轉羧化酶（OAATC）、琥珀酰輔酶A轉移酶（CoAT）、輔酶F420（F420）和乳酸脫氫酶（LDH）等關鍵酶的活性進行檢測。
2、結果與討論
2.1 鹽度對混合基質中有機質溶出的影響
經過電化學預處理后，不同鹽度（3、6和10g/L）的混合基質上清液中SCOD、碳水化合物和溶解性蛋白質含量均上升，其中，SCOD分別從1788.29、2175.11、2256.14mg/L升到2445.23、2532.82、4406.13mg/L，當鹽度為10g/L時SCOD上升最明顯；碳水化合物分別從876.11、849.89、863.33mg/L上升到988.71、1067.38、1009.08mg/L；溶解性蛋白質分別從59.18、72.07、64.07mg/L上升到162.86、167.34、95.45mg/L，當鹽度為3和6g/L時溶解性蛋白質上升更明顯。以上表明，電化學預處理有助于混合基質中有機質的溶出，鹽度較低（3和6g/L）的混合基質經電化學預處理后更有利于溶解性蛋白質的溶出，而鹽度較高（10g/L）的混合基質經電化學預處理后SCOD溶出量更高，但溶解性蛋白質溶出量較少，混合基質的可生化性較低。因此，較低的鹽度更有利于提高電化學預處理后混合基質中有機質的溶出效能，并提高混合基質的可生化性。由于鹽度為10g/L的混合基質經電化學預處理后可生化性較差，幾乎不產生VFAs，故后期僅探究3和6g/L這兩種較低鹽度對混合基質厭氧共發酵的影響。
2.2 鹽度對氧化性物質產生的影響
經過電化學預處理后，不同鹽度（3、6、10g/L）混合基質的RCS含量分別為11.60、207.71、346.17mg/L，RCS含量隨鹽度的升高而升高，且在鹽度為3~6g/L區間內增加迅速。圖2為不同鹽度（3、6、10g/L）的混合基質在電化學預處理后各指標之間的相關系數。可知，鹽度與RCS、pH、SCOD呈正相關，與氨氮、溶解性蛋白質呈負相關，相關系數均高于0.85，其中，鹽度和RCS含量存在良好的正相關性，R2為0.98。RCS可直接攻擊污泥內部細胞結構，導致污泥細胞裂解，從而促進混合基質中SCOD、碳水化合物和溶解性蛋白質的溶出并調節pH。
2.3 鹽度對厭氧共發酵產物的影響
不同鹽度混合基質厭氧共發酵產VFAs的情況如圖3（a）所示。可以看出，VFAs累積產量整體呈先上升后緩慢下降的趨勢。不同鹽度混合基質厭氧共發酵的VFAs產量有所差異，其中，S3-EPT組的VFAs產量遠高于對照組，在第14天達到最高值即2259.33mg/L（以COD計，下同），相比對照組提升了33.27%，而S6-EPT組的VFAs產量低于對照組。鹽度與RCS含量呈強正相關，RCS能夠破壞胞外聚合物、細胞膜和細胞壁，有利于厭氧發酵產酸；但RCS含量過高時會殺滅部分微生物，不利于混合基質厭氧共發酵產VFAs。實驗組的VFAs累積產量峰值均滯后對照組2~3d，說明電化學預處理后產酸時間出現遲滯。低含量的RCS有利于改善混合基質水解和酸化過程，從而提高產酸量。因此，鹽度為3g/L的混合基質經電化學預處理后產酸效果最好，但仍需要一段時間消耗RCS，恢復微生物活性，從而導致最高產酸時間滯后。
圖3（b）反映了鹽度對剩余污泥-餐廚垃圾厭氧共發酵產甲烷的影響。實驗組的甲烷累積產量緩慢增加，但均低于1mL/gVSS，幾乎沒有甲烷產生，而對照組S3-Blank和S6-Blank的甲烷累積產量從第4天開始上升，在發酵期末分別達到16.28、9.59mL/gVSS。以上結果表明，電化學預處理會顯著抑制產甲烷，這是由于產甲烷菌較為敏感，電化學預處理后殘留的RCS抑制了產甲烷菌活性。
如圖3（c）所示，在混合基質厭氧共發酵過程中，實驗組產酸的主要組分為乙酸和丙酸，二者之和可占到60%以上，發酵類型為丙酸型發酵，與已有的研究結果基本一致，其他組分主要包括丁酸和戊酸等短鏈脂肪酸。對照組S3-Blank的乙酸占比在第8天迅速下降至7%，而S6-Blank組在第14天下降至18%，隨后均處于2%～4%之間；對照組S3-Blank和S6-Blank的丙酸占比分別由前期的30%、26%緩慢升至第20天的63%、48%。乙酸的急劇下降可能是因為乙酸被產甲烷菌利用合成甲烷等，而由于丙酸轉化為乙酸的途徑受阻以及丁酸等分解為丙酸，導致丙酸占比持續上升。
在20d的厭氧共發酵過程中，實驗組S3-EPT的乙酸占比由初始的50%逐漸下降并最終穩定在35%左右；丙酸占比在第2天迅速上升，隨后逐漸穩定在30%左右。實驗組S6-EPT的乙酸占比先增加（第6天增至最高即57%）后下降并最終穩定在32%左右；丙酸占比在第8天迅速上升，隨后逐漸穩定在40%左右。實驗組最終的丙酸占比均低于對照組。結合VFAs產量和甲烷產量來看，實驗組S3-EPT在發酵14d后乙酸和丙酸累積產量最高，分別為832.51和735.60mg/L，但兩個實驗組均幾乎沒有甲烷產生。可見，電化學預處理有效抑制了產甲烷過程，阻止了VFAs中乙酸被消耗利用的途徑，有利于乙酸的積累，提高乙酸在VFAs中的占比。而隨著鹽度的提升，電化學預處理可提高丙酸占比，但考慮到S6-EPT組的VFAs總量低于S3-EPT組，電化學預處理仍不適合鹽度較高的混合基質。
以上研究結果說明，電化學預處理可有效抑制剩余污泥-餐廚垃圾混合基質厭氧共發酵產甲烷，有利于提高厭氧發酵液中的乙酸含量，提升發酵液作為碳源被利用的潛力。
2.4 鹽度對關鍵酶活性的影響
在厭氧共發酵中微生物通過分泌關鍵酶來催化物質的代謝與合成。分別以對照組為基準（相對酶活性為100%），計算不同鹽度實驗組的相對酶活性，結果見圖4。α-葡萄糖苷酶和蛋白酶為水解酶，前者可分解糖類，后者參與蛋白質的分解；乙酸和丙酸是混合基質厭氧共發酵過程中產生的主要VFAs，乙酸激酶（AK）和磷酸轉乙酰酶（PTA）主要參與乙酸的生成，草酰乙酸轉羧化酶（OAATC）和琥珀酰輔酶A轉移酶（CoAT）主要參與丙酸的合成；輔酶F420（F420）主要負責甲烷的合成；乳酸脫氫酶（LDH）主要參與乳酸的合成，可作為評價微生物細胞膜完整性的指標。
由圖4可知，實驗組S3-EPT的α-葡萄糖苷酶和蛋白酶相比對照組分別增加了11.48%和15.80%，實驗組S6-EPT的α-葡萄糖苷酶和蛋白酶相比對照組分別下降了12.97%和5.27%。這說明水解酶的活性可能與接種時RCS含量有關，RCS含量較高時會抑制水解酶的分泌；RCS含量較低時，雖然對微生物的影響較小，但由于發酵過程中微生物間的競爭激烈，水解菌活性也會受到一定抑制；合適的RCS含量有利于水解菌成為優勢菌種，促進其分泌α-葡萄糖苷酶和蛋白酶來降解糖類和蛋白質。在乙酸和丙酸合成方面，S3-EPT組AK、PTA、OAATC和CoAT的相對活性得到增強，相比對照組分別提升了18.45%、3.62%、23.88%和5.05%，乙酸和丙酸合成酶的活性增強，可促進VFAs的生成，與VFAs產量變化情況能較好地吻合。輔酶F420在電化學預處理后被有效抑制，S3-EPT組和S6-EPT組輔酶F420的相對活性較低，相比對照組分別下降了15.44%和15.29%，與實驗組甲烷產量處于較低水平的情況吻合。LDH酶的活性在S3-EPT組中相對較低（92.56%），在S6-EPT組中相對較高（112.34%），說明較高含量的RCS會破壞微生物細胞結構，導致LDH酶釋放。
整體來看，實驗組S3-EPT中與水解、乙酸合成、丙酸合成相關的酶活性增強，而產甲烷酶和乳酸脫氫酶的活性被抑制，關鍵酶活性的協同變化有效強化了混合基質水解和VFAs合成。實驗組S6-EPT中與水解、產酸和產甲烷相關的酶活性均降低，而LDH酶活性則提升了12.34%，說明對于較高鹽度的混合基質，電化學預處理會抑制酶活性，破壞微生物細胞結構，不利于厭氧共發酵，這也與鹽度為6g/L的實驗組產酸表現不佳的情況一致。
2.5 鹽度對微生物群落結構的影響
鹽度對厭氧共發酵中微生物群落結構的影響如圖5所示。由圖5（a）可知，發酵前對照組和實驗組在門水平上的微生物組成大致相似，占主要優勢的菌門為Firmicutes（厚壁菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Proteobacteria（變形菌門）和Actinobacteria（放線菌門）等水解酸化菌，對照組S3-Blank和S6-Blank中上述4種優勢菌門的相對豐度之和分別為89.79%和92.01%，經過電化學預處理后，優勢菌門的豐度變化較為明顯，實驗組S3-EPT和S6-EPT中上述4種優勢菌門的相對豐度之和分別為94.40%和74.73%，S3-EPT中4種優勢菌門的相對豐度之和最高，其中Firmicutes占據主導地位（64.90%），Firmicutes是一類常見的酸化細菌，主要參與蛋白質和糖類等有機物的降解，并將其轉化為VFAs，特別是乙酸。這與S3-EPT中VFAs產量最高和乙酸比例較高的情況相吻合。經過14d厭氧共發酵，實驗組S3-EPT和S6-EPT中以上4種優勢菌門的相對豐度之和相比對照組分別升高了24.28%和6.22%，其中S3-EPT組中Bacteroidetes在厭氧共發酵過程中的豐度提升最明顯，提升至39.00%，Bacteroidetes可分解碳水化合物和蛋白質，并合成乙酸等VFAs，Bacteroidetes豐度的提升有利于乙酸累積。可見，電化學預處理有利于富集篩選水解酸化細菌，為提高VFAs的合成提供了有利條件。
如圖5（b）所示，對照組和實驗組在屬水平上的微生物組成差異顯著，S3-Blank中占主要優勢的菌屬為Prevotella_9（普氏菌屬，9.27%）和Veillonella（韋榮氏球菌屬，8.20%），S6-Blank中占主要優勢的菌屬為Escherichia-Shigella（埃希氏桿菌屬，13.74%）和Clostridium_sensu_stricto_1（梭菌屬，9.65%）。經電化學預處理后，S3-EPT組的主要優勢菌屬變為Weissella（魏斯氏菌屬）和Leuconostoc（明串珠菌屬），相對豐度分別為29.11%和22.95%，還檢測出較高豐度的Lactobacillus（乳桿菌屬，9.95%），Leuconostoc、Weissella和Lactobacillus均屬于Firmicutes，是常見的乳酸菌。在VFAs的合成路徑中，乳酸可在丙酮酸脫氫酶作用下被轉化為丙酸。S6-EPT組的主要優勢菌屬變為Dechloromonas（脫氯單胞菌屬，6.47%），其他各菌屬的相對豐度較低（低于5%）。可見，鹽度的提升在一定程度上對微生物進行了篩選，鹽度越高，電化學預處理后殘留RCS含量越高，低含量RCS可篩選微生物種類，提高水解酸化菌的相對豐度，從而改善厭氧共發酵效果，而高含量RCS會抑制水解酸化菌活性。
經過14d厭氧共發酵，各組中優勢菌屬發生了明顯變化，對照組S3-Blank中占主要優勢的是Parabacteroides（副擬桿菌屬，16.43%）和U29-B03（12.07%），實驗組S3-EPT中相對豐度超過5%的菌屬較多，其優勢菌屬主要為Prevotella_7（普氏菌屬）、Caproiciproducens（產己酸菌屬）、Bifidobacterium（雙歧桿菌）和Clostridium_sensu_stricto_12（梭菌屬），相對豐度分別為21.07%、8.52%、6.75%和5.62%。有研究表明，Prevotella在pH為4.6～5.0條件下，可降解碳水化合物和部分蛋白質，合成琥珀酸和乙酸，提高VFAs產量。Caproiciproducens主要參與有機酸的代謝，產物為H2、乙酸、丁酸和己酸等。Bifidobacterium隸屬于Actinobacteria，可以將難降解的纖維素等分解。Clostridium作為一種水解菌株，在水解碳水化合物和蛋白質方面發揮著重要作用。對照組S6-Blank中占主要優勢的為Clostridium_sensu_stricto_12（梭菌屬，8.74%）和Parabacteroides（副擬桿菌屬，8.19%），實驗組S6-EPT中優勢菌屬主要為Bifidobacterium（雙歧桿菌屬）、Prevotella_7（普氏菌屬）和Veillonella（韋榮氏球菌屬），相對豐度分別為18.55%、16.56%和10.92%。盡管鹽度為6g/L的混合基質厭氧共發酵后水解酸化菌屬的相對豐度較高，但由于RCS含量較高，破壞了微生物細胞結構，細菌基因表達受限，限制了有機物分解與VFAs合成。
綜上，鹽度為3g/L的混合基質經電化學預處理后不僅有利于初期富集篩選Firmicutes，還可提高水解酸化細菌的豐度（如Prevotella_7），為強化產酸提供了有利條件；鹽度為6g/L的混合基質在電化學預處理后殘留RCS含量較高，雖篩選富集了水解酸化菌，但顯著抑制了微生物活性，不利于有機物分解與VFAs合成。
3、結論
①對于剩余污泥-餐廚垃圾混合基質，鹽度與電化學預處理后殘留RCS含量呈強正相關性，R2為0.98，殘留RCS可促進有機質溶出并調節pH，改善混合基質可生化性。相對較低的鹽度（3g/L）更有利于提高電化學預處理混合基質中有機質的溶出效能，可生化性較好的溶解性蛋白質相比未預處理組提升了近2倍。較高的鹽度（10g/L）雖然能促進混合基質中有機質的溶出，但易生物利用底物（如溶解性蛋白質）的溶出量較少。
②剩余污泥-餐廚垃圾混合基質的最佳鹽度為3g/L，VFAs產量最高達到2259.33mg/L，相比未預處理組提升了33.27%，水解、乙酸合成、丙酸合成相關酶的活性提高，而產甲烷酶活性被抑制，關鍵酶活性的協同變化有效強化了混合基質水解和VFAs合成。鹽度較高（6g/L）的混合基質中水解產酸相關酶活性相比對照組降低了5%～10%，不利于厭氧發酵產酸。
③鹽度的提升在一定程度上篩選了微生物種類，鹽度與電化學預處理后RCS含量呈強正相關性，殘留RCS有利于提高厭氧發酵過程中水解酸化菌的豐度。鹽度為3g/L的混合基質在厭氧發酵后優勢水解酸化菌門（如Firmicutes等）相對豐度之和相比對照組升高了24.28%。但過高RCS含量會破壞細胞結構和抑制微生物基因表達。（來源：中國市政工程西南設計研究總院有限公司，華中科技大學環境科學與工程學院）
