1 引言

　　氯苯類化合物作為農(nóng)藥及染料合成中間體、清洗溶劑及脫脂劑成分廣泛使用.自然界微生物缺乏降解此類化合物的酶或酶系統(tǒng)，很難進(jìn)行生物處理，微生物降解菌的篩選和降解性能研究是實(shí)現(xiàn)生物降解持久性有機(jī)污染物的關(guān)鍵.1，2，3，4-TeCB在GB 6944—2005中危險(xiǎn)標(biāo)記為14(有毒物品)，是一種典型的氯苯類化合物，對(duì)人體的皮膚、上呼吸道和粘膜有刺激作用，可在人體內(nèi)積累.目前四氯苯的研究主要圍繞其物理特性和毒性.四氯苯的晶體結(jié)構(gòu)和混合晶體結(jié)構(gòu)，在水和空氣之間的傳質(zhì)作用，沉積物和懸浮物對(duì)1，2，3，4-TeCB的吸附作用，1，2，3，4-TeCB對(duì)孕鼠肝和生殖率影響等均有廣泛研究.對(duì)于低分子氯苯類化合物及首先被限制使用的六氯苯微生物降解已有一些報(bào)道.但關(guān)于TeCBs的微生物降解研究卻鮮有報(bào)道.研究發(fā)現(xiàn)，五氯苯、六氯苯在降解過(guò)程中往往存在1，2，3，4-TeCB中間產(chǎn)物，這表明1，2，3，4-TeCB的降解是高氯苯化合物降解的關(guān)鍵步驟.本文從某氯苯試劑廠的土壤中取樣，篩選出一株以1，2，3，4-TeCB作為唯一碳源的降解菌，并研究了該菌株對(duì)1，2，3，4-TeCB降解效果及降解途徑，為微生物降解氯苯類物質(zhì)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

　　2 材料和方法

　　2.1 原料與試劑

　　所用土樣取自廣東某化學(xué)試劑廠長(zhǎng)期受四氯苯污染的土壤作為菌株分離源.

　　化學(xué)試劑：1，2，3，4-TeCB、丙酮、正己烷等試劑均為優(yōu)級(jí)純.培養(yǎng)基：常規(guī)牛肉膏蛋白胨;無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(組分不含Cl-)均為常規(guī)配方(試劑均為分析純)

　　2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

　　生化培養(yǎng)箱;恒溫水浴振蕩器;超凈工作臺(tái);高速離心機(jī);COD消解儀;離子色譜儀;高效液相色譜;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀.

　　2.3 菌種富集和分離純化

　　取1 g土壤于100 mL蒸餾水 中，搖床振蕩15 min，樣品稀釋后直接涂布在100 mg · L-1 1，2，3，4-TeCB的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基.待長(zhǎng)出菌落后，挑取單菌落在高濃度(250 mg · L-1)1，2，3，4-TeCB的液體培養(yǎng)基馴化.經(jīng)過(guò)5~7 d馴化后(定期更換培養(yǎng)液)，取1~2 mL菌液涂布于1，2，3，4-TeCB為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽平板，30 ℃恒溫培養(yǎng)，挑選生長(zhǎng)較快的單菌落接種到100 mg · L-1 1，2，3，4-TeCB液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng);多次平板劃線分離，獲得單菌落.

　　2.4 菌株形態(tài)觀察、生長(zhǎng)曲線及16S rDNA序列分析

　　將純化后的菌株在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，待長(zhǎng)出單個(gè)菌落后進(jìn)行形態(tài)觀察;對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色觀察;用OD600處測(cè)定生長(zhǎng)曲線.PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析檢測(cè)后將PCR產(chǎn)物送至廣州工業(yè)微生物檢測(cè)中心回收并測(cè)序.

　　2.5 菌株對(duì)1，2，3，4-四氯苯降解效果的研究

　　實(shí)驗(yàn)所用廢水為25 mg · L-1 1，2，3，4-TeCB模擬廢水，pH 7.

　　取200 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基置于500 mL錐形瓶中，經(jīng)高溫滅菌后，配置成25 mg · L-1的模擬廢水，分別加入2%、3%、5%的菌懸液.30 ℃，110 r · min-1.接種后每天定時(shí)取樣.分別測(cè)定模擬培養(yǎng)液中COD、Cl-濃度、1，2，3，4-TeCB濃度的影響，連續(xù)測(cè)定7 d.每組3個(gè)平行.

　　1)COD測(cè)定：快速消解分光光度法.

　　2)氯離子濃度測(cè)定：樣品測(cè)定前，樣品經(jīng)過(guò)0.22 μm 微孔過(guò)濾膜，用離子色譜儀測(cè)定氯離子濃度.

　　3)1，2，3，4-TeCB濃度測(cè)定：用高效液相測(cè)定.前處理：廢水經(jīng)0.22 μm微孔過(guò)濾膜過(guò)濾，測(cè)定過(guò)濾液中1，2，3，4-TeCB.測(cè)定條件：TH 1015型C18酸性柱;流動(dòng)相為甲醇與水按85:15體積比混合;柱溫25 ℃;進(jìn)樣體積10 μL;雙波長(zhǎng)檢測(cè)：波長(zhǎng)為214 nm、216 nm.

　　2.6 降解特性分析

　　不同處理時(shí)間的廢水經(jīng)0.22 μm 微孔過(guò)濾膜過(guò)濾，吹掃捕集后，利用氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)測(cè)定氯苯降解情況及產(chǎn)物分析.吹掃捕集條件：吹脫時(shí)間：11 min;吹脫溫度：350 ℃;解析溫度：225 ℃;解析時(shí)間：6 min;烘烤溫度：235 ℃;烘烤時(shí)間：5 min.注入樣品5 mL.色譜條件：檢測(cè)器溫度：300 ℃;進(jìn)樣口溫度：260 ℃;柱箱溫度：起始60 ℃，保持2分鐘，以5 ℃ · min-1的速度升溫至160 ℃，保持2 min.分流比：10 ∶ 1.

　　3 結(jié)果與分析

　　3.1 菌株生理生化特性、16S rDNA序列分析及生長(zhǎng)曲線

　　以1，2，3，4-TeCB為唯一碳源富集、分離、馴化微生物，篩選出一株在固體培養(yǎng)基上能快速生長(zhǎng)的菌株，命名為L(zhǎng)-1號(hào)菌.菌落表面圓滑，不透明，呈白色或微黃色.菌株為短桿狀，無(wú)鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，能產(chǎn)生中生芽孢.菌株革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性菌(G+)，如圖 1所示.在此基礎(chǔ)上，對(duì)L-1號(hào)菌的16SrDNA基因系列運(yùn)用Basics BLAST軟件分析，和Genbank比對(duì)，L-1菌ITS序列與Bacillus subtilis AF0907(枯草芽孢桿菌)和Bacillus carboniphilus JCM9731具有最高的同源性，均達(dá)到98.5%以上.結(jié)合生理生化特性，初步鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌.為了解菌株生長(zhǎng)特點(diǎn)，對(duì)L-1號(hào)菌進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，見(jiàn)圖 2.

 圖1 菌株 L-1 的菌落形態(tài)和革蘭氏染色

 
圖2 菌株 L-1 的生長(zhǎng)曲線

　　從圖 2中可見(jiàn)該菌株在0~3 h生長(zhǎng)較慢，5 h后迅速進(jìn)入生長(zhǎng)期，表明該菌株潛伏期較短能夠快速適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期.12~34 h該菌株生長(zhǎng)減慢，進(jìn)入穩(wěn)定期，直到30 h后該菌株一直處于穩(wěn)定期，表明該菌株生長(zhǎng)代謝穩(wěn)定期長(zhǎng)，降解潛能較大，利于工業(yè)應(yīng)用.在菌株培養(yǎng)了15 h后，菌的濃度能達(dá)到約108 cfu.為實(shí)驗(yàn)用菌提供保證.

　　3.2 不同接種量對(duì)反應(yīng)液COD的影響

　　將菌株制成菌懸液(108 cfu)，測(cè)定不同接種量對(duì)25 mg · L-1模擬廢水COD降解效果，初步反映菌液中有機(jī)污染物的量，結(jié)果見(jiàn)圖 3.

 圖3 接種量對(duì)廢水COD累積降解率的影響

　　從圖 3可見(jiàn)，隨著時(shí)間增長(zhǎng)，反應(yīng)液COD累積降解率逐漸增大，接種濃度越大降解率越高.7 d后降解率分別達(dá)到：32.61%;53.79%;62.71%.在第1~2 d時(shí)，菌株生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)期，降解效果好，反應(yīng)液COD降解較快.在第3 d后水中COD累積降解率穩(wěn)步增加，菌株生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定.3~7 d COD累積降解率斜率基本一致，表明單位時(shí)間菌體的降解效率穩(wěn)定.與圖 2中菌株生長(zhǎng)曲線相對(duì)應(yīng).說(shuō)明L-1菌株生長(zhǎng)代謝穩(wěn)定強(qiáng)，能充分利用廢水中的有機(jī)物.說(shuō)明該菌株并不能迅速的將1，2，3，4-TeCB完全礦化.在5 d后COD降解率逐漸減緩，但能保持一定的降解效果.

　　3.3 不同接種量對(duì)氯離子釋放量的影響

　　在配制模擬廢水時(shí)，無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中不含Cl-，反應(yīng)液中的氯離子含量多少反映了降解過(guò)程中對(duì)1，2，3，4-TeCB的降解脫氯過(guò)程，結(jié)果見(jiàn)圖 4.

 圖4 接種量對(duì)氯離子釋放濃度的影響

　　從圖 4可以看出氯離子釋放濃度趨勢(shì)與COD降解呈一定的相關(guān)性.在1~4 d，氯離子隨菌濃度增大，氯離子釋放量濃度增大.這表明菌株在1，2，3，4-TeCB降解的過(guò)程中確實(shí)有Cl-產(chǎn)生.且接種量越大，氯離子的釋放越多.但在5 d后氯離子釋放量，再次呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)，表明該菌有可能使1，2，3，4-TeCB釋放多個(gè)氯離子，可能使三氯或者二氯化合物脫氯.因此氯離子濃度的變換呈現(xiàn)二次增長(zhǎng)趨勢(shì).不同接種量反應(yīng)液中的氯離子濃度在7 d時(shí)的含量分別為：1.852 mg · L-1，2.742 mg · L-1，4.980 mg · L-1.

　　3.4 不同接種量對(duì)1，2，3，4-TeCB的降解量

　　從圖 5中可以看出，1，2，3，4-TeCB的降解量隨著時(shí)間的增加而增大，呈現(xiàn)一定的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，且菌株接種量大降解率高.2%、3%、5%接種量7 d后降解量可達(dá)13.74 mg · L-1，14.91 mg · L-1，20.47 mg · L-1.第1~4 d，盡管微生物量增多，但是菌株降解速率較慢，這可能與菌株尚沒(méi)有合成降解1，2，3，4-TeCB相應(yīng)的酶有關(guān).第4~6 d，1，2，3，4-TeCB的降解量逐漸加大.表明菌株逐漸適應(yīng)新的脅迫環(huán)境.到7 d降解量變化不大，表明菌株生長(zhǎng)所需有機(jī)物逐漸減少，降解效果也隨著下降.該結(jié)果與COD量變化不同，菌株COD在第7 d時(shí)最高只降解62%，這表明該菌株能利用1，2，3，4-TeCB，但對(duì)1，2，3，4-TeCB的完全礦化需要一個(gè)過(guò)程，該結(jié)果正好與氯離子的二次釋放相吻合.

 圖5 不同接種量對(duì)1，2，3，4-TeCB降解量

　　3.5 加標(biāo)回收率與RSD和GC-MS產(chǎn)物分析

　　進(jìn)一步分析L-1菌株對(duì)1，2，3，4-TeCB的降解產(chǎn)物的特性，樣品的加標(biāo)回收率見(jiàn)表 2.

 表2 樣品的加標(biāo)回收率與RSD

　　通過(guò)對(duì)反應(yīng)液GC-MS測(cè)定和分析，發(fā)現(xiàn)1，2，3，4-TeCB降解過(guò)程中存在：2，3，4，5-四氯-2，4-己二烯二酸(A物質(zhì))和2，3，5-三氯-2，4-二烯-1，4-內(nèi)酯-己酸(B物質(zhì)).圖 6(a、b)分別是A、B物質(zhì)的質(zhì)譜圖.

 圖6 A、B物質(zhì)的相對(duì)豐度

　　通過(guò)對(duì)廢水pH的測(cè)定，反應(yīng)液從pH 7降低到pH 5.3，說(shuō)明最終產(chǎn)物中生成了酸性物質(zhì).通過(guò)對(duì)產(chǎn)物的分析，推測(cè)1，2，3，4-TeCB降解途徑是先通過(guò)開(kāi)環(huán)后脫氯的途徑.通過(guò)對(duì)其降解途徑分析如圖 7所示.

 圖7 菌株L-1對(duì)1，2，3，4-TeCB的降解途徑

　　1，2，3，4-TeCB在加氫氧化酶的作用下產(chǎn)生環(huán)雙氧化，生成環(huán)氯代二醇，然后在脫氫酶的作用下脫去兩個(gè)氫原子生成3，4，5，6-四氯鄰苯二酚;再經(jīng)過(guò)氧化開(kāi)環(huán)生成2，3，4，5-四氯-2，4-己二烯二酸，并在相關(guān)酶的作用下發(fā)生內(nèi)酯化脫去氯離子生成2，3，5-三氯-2，4-二烯-1，4-內(nèi)酯-己酸，之后通過(guò)水解酶生成2，3，5-二氯-4-氧代-2-烯己二酸，這種化合物能在NADH作用下打開(kāi)雙鍵同時(shí)脫氯，形成飽和脂肪酸，最后生成琥珀酸和乙酸，最終進(jìn)入TCA循環(huán).該中間化合物大部分在反應(yīng)液中檢測(cè)出來(lái)，證實(shí)了該降解途徑的可行性及該菌種研究的潛在價(jià)值.關(guān)于菌株L-1的其他生理生化特性及菌種鑒定值得進(jìn)一步深入研究.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.dongaorq.cn更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　4 結(jié)論

　　1)從廣東某化學(xué)試劑廠周邊土壤篩選出一株能降解1，2，3，4-TeCB的菌株L-1，該菌株為短桿狀，能產(chǎn)生芽胞的革蘭氏陽(yáng)性菌，經(jīng)16S rDNA鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌.

　　2)菌株L-1不同接種量對(duì)模擬廢水(25 mg · L-1)的最佳處理效果：COD降解率達(dá)62.71%，氯離子濃度達(dá)4.980 mg · L-1;1，2，3，4-TeCB降解量高達(dá)20.47 mg · L-1.

　　3)廢水的COD降解率隨接種量增大和接種時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高;1，2，3，4-TeCB降解過(guò)程中有Cl-產(chǎn)生，且呈現(xiàn)二次增長(zhǎng)的現(xiàn)象;反應(yīng)液中1，2，3，4-TeCB濃度隨著接種時(shí)間逐漸降低，在第7 d 5%接種量處理組的降解量最大，高達(dá)20.47 mg · L-1，證實(shí)該L-1菌株能夠降解1，2，3，4-TeCB，但其完全礦化過(guò)程比較復(fù)雜.

　　4)通過(guò)GC-MS等分析發(fā)現(xiàn)1，2，3，4-TeCB的降解過(guò)程中存在2，3，4，5-四氯-2，4-己二烯二酸和2，3，5-三氯-2，4-二烯-1，4-內(nèi)酯-己酸兩種關(guān)鍵物質(zhì).推測(cè)其降解過(guò)程是先開(kāi)環(huán)后脫氯.