1 引言

　　近年來，隨著我國畜禽養殖業規模化和集約化的快速發展，畜禽污染廢水已經成為我國水環境污染的重要源頭之一(Xian et al., 2010).盡管通過厭氧與好氧等生物凈化技術的處理，排水可以達到我國《畜禽養殖業污染物排放標準》(GB 18596—2001)的要求，但廢水中仍具有較高濃度的氮磷等營養鹽殘留，如何有效地對此類廢水進行深度凈化處理日益被社會所關注.目前，在國內外熱帶或亞熱帶地區，生態處理技術在畜禽污水深度處理方面展現了良好的發展潛力，其中，水生植物濾床(Aquatic plant filter bed，APFB)已在此領域展現其可行性.水生植物作為水生植物濾床的主要組成單元，通常選用水生蔬菜(如空心菜、水芹、西洋菜等)，在深度凈化廢水的同時，實現資源的回收利用.

　　相比養殖廢水中氮磷等營養鹽對環境的污染情況，由于對環境微生物的抗性影響作用，廢水中殘留的抗生素及抗生素抗性基因等微污染物也逐漸被重視關切.近年來研究調查報告指出，我國每年生產的抗生素約有46.1%被用于畜禽養殖過程中治療和預防等方面.但由于畜禽對抗生素的低吸收性，大量的抗生素成分通過畜禽廢水排放進入環境.同時，獸用抗生素的大量應用也增加了抗生素抗性基因在畜禽腸道內水平轉移和抗性固定的頻率，從而增加抗生素抗性基因在環境中傳播擴散的機率(Wu et al., 2010).因此，研究人員在關注畜禽養殖廢水中氮磷去除的同時，也開始研究廢水中殘留抗生素和抗性基因與生態處理工藝的相互作用關系(Liu et al., 2013a).然而，目前關于畜禽養殖廢水深度處理過程中，抗生素和抗生素抗性基因在水生植物濾床中響應情況的研究報道還很罕見，并且工藝設計參數和外界因素對其的作用影響還有待深入研究.基于此，本文研究了典型抗生素和抗生素抗性基因在種植不同水生蔬菜的水生植物濾床中去除和累積情況，并考察季節變化對此過程的作用影響.以期為更好地利用水生植物濾床深度處理畜禽養殖廢水提供科學依據.

　　2 材料與方法

　　2.1 實驗設計與樣品采樣

　　本實驗采用3組水生植物濾床系統，分別為空白對照組、空心菜種植系統和水芹種植系統，濾床系統有效容積為5 L.研究在試驗前期采用Hoagl and 營養液將空心菜和水芹在沙盤上進行育種至10 cm，之后選取性狀表征相似的水生蔬菜分別移栽到2個系統中，每個濾床中栽種植物20株.實驗進程分為兩個階段，即夏季(8—9月)和冬季(12月—1月)，每個階段獨立進行，分別栽種水生植物，每階段運行時間為60 d.為模擬實際養殖廢水的抗生素水平，實驗設計在實際養殖廢水投加3大類抗生素成分(四環素類抗生素3種、磺胺類抗生素3種及喹諾酮類抗生素3種，共9種)以作實驗水體，在保證植物體的正常生長前提下，3大類抗生素含量保持相似水平，各類總量分別為30 μg · L-1.其中，實際養殖廢水取自廈門市集美區某養豬場的厭氧好氧串聯生物處理裝置后集水池，并置于冰箱(4 ℃)中保存備用.

　　設定水生植物濾床的水力負荷為5 cm · d-1.廢水樣品在夏季和冬季每階段，3組系統分別取樣7次，進行抗生素分析測定，并結合不同系統的水力損失進行綜合評價.每個階段結束時期，即第55 d對3組系統內抗生素和抗生素抗性基因在系統內累積情況進行測定，并對出水中抗生素抗性基因含量進行分析.實驗選取常見的幾種典型抗生素抗性基因作為目的基因進行檢測:2 種磺胺類抗生素抗性基因 sul I、sul II和5 種四環素類抗生素抗性基因 tetA、tetM、tetO、tetW和tetX.在我國養殖廢水和周邊土壤的調研中，四環素類和磺胺類抗性基因豐度與動物養殖場和污水處理廠的分布顯著相關，具代表性.

　　2.2 分析項目與方法

　　2.2.1 抗生素的LC-MS 分析

　　預處理 ：水樣以 0.45 μm 濾膜過濾，去除懸浮物;植物組織與底泥分別凍干后研磨，稱取一定質量，每 1 g固體樣中 加入 0.1 g Na2EDTA，并加入適量乙腈磷酸鹽混合液浸提，經振蕩超聲萃取抗生素，離心收集上清液，重復兩次，加入定量超純水制為樣品浸提液.經過預處理的樣品浸提液 以 1 滴 · s-1的速度通過預先經6 mL 丙酮、6mL甲醇和6mL甲酸/水溶液(體積比0.5 ∶ 99.5)活化的HLB 固相萃取柱，待上清液完全流出后，依次用 6 mL 水和6 mL 甲酸/水溶液(體積比5 ∶ 95)淋洗，棄去全部流出液.減壓抽干30 min，最后用3 mL 甲醇溶液洗脫.將洗脫液在 37 ℃吹氮、濃縮至干，用 1 mL 甲酸/水標準溶解液(體積比20 ∶ 80)溶解殘 渣，過 0.45 μm 濾膜，供液相質譜儀測定.

　　樣品測定：取經過預處理的樣品提取液經 LC-MS(ABI 3200Q TRAP)測定.色譜條件(Xian Q et al., 2010)：色譜柱為Inertsil ODS-SP，柱溫 40 ℃;流速 0.8 mL · min-1;進樣量 20 μL;流動相為甲醇和0.5%(體積分數)甲酸;流速1.0 mL · min-1.質譜條件：離子化方式為電噴霧電離源正源模式(ESI+)，離子源I(GS1)和II(GS2)的氣流量分別為50和60 mL · min-1，電離電壓 5500 V;輔助加熱氣溫 550 ℃.

　　2.2.2 抗生素抗性基因的 RT-PCR 定量分析

　　本試驗選取常見的幾種典型抗生素抗性基因作為目的基因：2 種磺胺類抗生素抗性基因 sul I、sul II和5 種四環素類抗生素抗性基因 tetA、tet M、tetO、tetW和tetX，對采集水樣中所提取的 DNA 進行定量檢測，引物設計參考已發表的文獻(Liu et al., 2013a).

　　DNA 提取：采用E.Z.M.A土壤DNA提取試劑盒(美國Omega生物技術公司)，按照生產商提供的說明提取土壤中的微生物基因組DNA.其中，水樣中DNA提取如下：取0.5 L水樣，用0.45 μm濾膜過濾，然后用超純水沖洗濾膜，收集沖洗液，采用UItraclean Water DNA Kit試劑盒，按照生產商說明的方法提取水樣中DNA.提取的 DNA 用瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計(UV-8000PC)檢測含量及純度(A260/A280 值在 1.8~2.0 之間)，結果表明，用試劑盒提取的 DNA為純度較高的生物基因組DNA.

　　RT-PCR ：用Takara Bio Inc公司的 RT-PCR 試劑盒 進行 7 個目的基因的 SYBR Premix Ex Taq II實時定量 PCR 反應.PCR 反應體系(體積為 20 μL)包括目的基因上、下游引物及ROXII 各0.4 μL，SYBRmix10 μL，待測DNA模板 2 μL，ddH2O 6.8 μL.PCR 反應程序為：95 ℃預變性5 min后循環擴增40次，其中，sulI 94 ℃變性10 s，65 ℃退火45 s;su II 94 ℃變性10 s，57 ℃退火45 s;tetA 94 ℃變性10 s，52 ℃退火45 s，80 ℃延伸10 s;tetM 94 ℃變性10 s，45 ℃退火45 s，80 ℃延伸10 s;tet O 94 ℃變性10 s，45 ℃退火45 s，81 ℃延伸10 s;tet W 94 ℃變性10 s，60 ℃退火45 s，83 ℃延伸10 s;tetX 94 ℃變性10 s，52 ℃退火45 s，80 ℃延伸10 s.16SrDNA的PCR 反應體系與目的基因相同，40次循環的擴增程序：95 ℃變性10 s，53 ℃退火35 s，81 ℃延伸10 s.

　　2.3 數據統計與分析

　　所有數據用 Excel 軟件進行統計學處理，采用 t 檢驗進行顯著性分析.由于不同的水生植物濾床存在的水量損失不同，且差異較大.因此，對不同系統中抗生素去除效率η根據公式(1)進行計算.

　　式中，Ci和Ce分別為出入水質中抗生素濃度(μg · L-1)，Qi和Qe分別為出入水量(L)

　　3 試驗結果

　　本試驗全程對系統出水同步進行常規檢測，種植植物系統在兩個階段對COD、TN和TP平均去除率均達60%、30%和8%以上，處理效果良好.兩個實驗周期內，兩種植物體生長狀況均表現良好，未出現明顯的抑制現象.由此表明添加抗生素并未影響到水生植物濾床對水體中常規污染物的處理效果，系統對抗生素去除和抗性基因表達差異與植物活性抑制與否無關，而是取決于系統內植物的種類.

　　3.1 抗生素出水濃度和去除效率

　　本試驗的固液樣品中有3大類9種抗生素成分被分析測定，然而由于同類單體抗生素可在體系中發生同型轉換，從而可能會導致單體抗生素在系統內變化規律并非由體系配置和外界因素的影響所造成，因此，本研究將同類抗生素進行集加，對不同大類抗生素(四環素類 TCs、磺胺類 SMs和喹諾酮類 QNs)的試驗結果進行分析.

　　不同季節情況下3組水生植物濾床的抗生素出水濃度和去除效率的平均值如圖 1所示.研究結果表明，水生植物濾床可去除廢水中殘留抗生素成分，但不同類別抗生素在不同配置的系統中去除效果具有差異性，并且受季節變化影響明顯.

 圖 1 不同季節情況下3組系統中抗生素的出水濃度(a)和去除效率(b)

　　在抗生素出水濃度方面，相比空白對照組，夏季運行下3大類抗生素在空心菜和水芹系統中出水濃度較高，而在冬季則表現出相反的運行情況，種植植物系統中的抗生素在夏季和冬季的出水濃度分別約為4.19~25.24 μg · L-1和7.83~23.28 μg · L-1;在夏季水芹系統抗生素出水濃度(TCs 4.19 μg · L-1、SMs 13.18 μg · L-1、QNs 22.26 μg · L-1)要低于空心菜系統(TCs 6.87 μg · L-1、SMs 16.29 μg · L-1、QNs 25.24 μg · L-1)，而在冬季水芹系統抗生素出水濃度要高于空心菜系統.在基于水力平衡的抗生素去除效率方面，研究結果指出，不同季節情況下抗生素去除效率與抗生素出水濃度結果相似，即相比空白對照組，水生植物種植系統中抗生素去除效率在夏季較低，而在冬季則表現出較高的去除能力，種植植物系統中3大類抗生素在夏季和冬季的去除效率分別約為6.84%~71.83%和19.25%~58.38%;通過比較不同植物種植系統中抗生素去除效率發現，在夏季水芹系統對抗生素的去除效率分別為71.83%(TCs)、46.80%(SMs)和21.53%(QNs)，這要明顯高于空心菜系統(TCs 33.28%、SMs 19.73%、QNs 6.84%)，但在冬季運行情況下兩組水生植物濾床對抗生素的去除效率差異不顯著.

　　3.2 抗生素在植物與底泥中累積含量

　　在夏季和冬季試驗末期，水生植物濾床中底泥和植物莖葉中抗生素累積含量被分析測定，結果如圖 2所示.研究表明，植物葉片和莖部中抗生素累積含量分別約為0.15~7.33 μg · g-1(以干重計，下同)和1.72~103.7 μg · g-1，相比植物葉片，3類抗生素在植物莖部都具有較高的累積含量.但在夏季運行情況下，3類抗生素在空心菜莖部具有明顯較高的累積含量(22.89~103.7 μg · g-1)，而在冬季3類抗生素在水芹葉片中具有明顯較高的累積含量(3.52~7.33 μg · g-1).通過含量集合可知在夏季空心菜中抗生素累積含量較高，而水芹則在冬季要比空心菜累積更多的抗生素成分.然而在底泥方面，四環素類和磺胺類抗生素的累積含量相似，并且受季節因素影響并不顯著;但對于喹諾酮類抗生素，研究發現其在夏季系統底泥中累積含量約為11.17~12.26 μg · g-1，這要明顯高于其在冬季系統中累積含量.

 圖 2 不同季節情況下3組系統中抗生素在植物葉(a)、莖(b)和底泥(c)中的累積含量

　　3.3 抗性基因出水相對含量

　　在夏季和冬季試驗末期，為了考察分析深度處理養殖廢水過程中微生物在水生植物濾床中的變化趨勢，3組系統的出水及底泥中抗生素抗性基因含量和16S rDNA水平被測定，并且為減少分析測定過程中所產生的誤差，本研究后續論述將基于抗生素抗性基因的相對含量(目標基因拷貝數/16S rDNA拷貝數)進行分析探討.

　　不同季節情況下3組水生植物濾床的出水中16S rDNA含量、抗生素抗性基因絕對濃度和抗生素抗性基因相對含量如圖 3所示.對比不同季節情況下空白組出水中相對含量，tetO和tetA在夏季系統中具有較高含量，約為1.05×10-1和1.11×10-1，而其他5種抗生素抗性基因在冬季系統中要高于夏季系統.而對于不同植物而言，夏季運行時sulI、sulII、tetA、tetM、tetX和tetO在空心菜系統出水中具有較高含量，而冬季運行情況下sulI、sulII、 tetW、tetM、tetX和tetO在水芹菜系統出水中含量較高.而無論季節變化還是工藝配置差異，相比其他抗生素抗性基因，tetX在系統中都具較高的相對濃度，約為3.75×10-2和8.62×10-1.

 圖 3 不同季節情況下3組水生植物濾床的出水中16S rDNA含量、抗生素抗性基因絕對濃度和抗生素抗性基因相對含量

　　3.4 抗性基因在底泥中累積含量

　　不同季節情況下3組水生植物濾床的底泥中16S rDNA含量、抗生素抗性基因絕對濃度和抗生素抗性基因相對含量如圖 4所示.與抗生素抗性基因出水相對含量相似，對比不同季節情況下空白組底泥中相對含量，tetO和tetX在夏季和冬季系統中具有相似含量，分別約為1.29×10-1和1.05×10-1，而其他5種抗生素抗性基因在冬季系統中要高于夏季系統.在不同植物對比方面，研究結果指出，夏季運行時sulI、sulII、tetA、tetM和tetO在空心菜系統出水中具有較高含量，而冬季運行情況下除 sulII之外，其他6種抗生素抗性基因在水芹菜系統底泥中具有較高相對含量.總體而言，系統出水與底泥中抗生素抗性基因水平對植物種類和季節因素變化的響應趨勢相似.

 圖 4 不同季節情況下3組水生植物濾床的底泥中16S rDNA含量、抗生素抗性基因絕對濃度和抗生素抗性基因相對含量

　　4 討論

　　抗生素在生態工藝中的去除包含多種作用機制，包括生物降解、吸附固定、水解作用、光解作用和植物吸附.然而由于本實驗裝置由PVC板材制作，并且植物系統和空白組分別由植物和板材覆蓋，從而光解作用在本系統內對抗生素的去除可忽略.此外，研究表明吸附作用是抗生素在生態工藝中去除的主要途徑，然而由于本系統中沒有填加填料，吸附固定主要通過底泥累積而實現，但系統底泥含量較低，并且抗生素在底泥中的累積情況也表明其在底泥中累積濃度也較低，因此，吸附作用對抗生素在系統中去除的貢獻較小.通過對植物體內抗生素含量分析可知，水生植物濾床中植物吸收作用可有效去除抗生素，特別是在冬季階段，有空心菜和水芹系統對抗生素的去除效率明顯要高于空白對照組.因此，水生植物濾床中植物吸收作用、生物降解和水解作用是其去除廢水中抗生素成分的主要途徑.

　　本研究經歷夏季和冬季兩個階段，水生植物濾床中抗生素去除情況在有無植物種植系統中出現了明顯差異.結合水力平衡的去除效率的實驗結果，抗生素可在系統內被大幅度去除，但由于夏季階段植物栽種可導致水體蒸發量增加，從而造成水體中抗生素含量的明顯升高.研究結果表明，相比水芹系統，空心菜系統中水體蒸發量更大，從而造成了空心菜系統的抗生素出水濃度明顯高于其它兩組系統.而在冬季運行階段，植物對水體吸收能力減弱，從而降低了抗生素在植物種植系統中出水濃度.在前期研究人工濕地處理養殖廢水過程中也得到相似結論(Liu et al., 2014).兩種不同植物系統中抗生素的去除效率差異與植物的水力傳導有關.研究指出，植物可以通過主動吸收和蒸騰作用吸收水體中的抗生素.并且，研究表明植物對有機污染物的富集和抗生素的辛醇/水分配系數(logKow)對數之間存在著密切的相關性，植物對有機污染物的吸收和轉化需要合適的分配系數，極性疏水(logKow>4)或者極性親水(logKow<1)的有機物不易被植物吸收.結果表明，植物主要是以蒸騰作用為動力，通過吸收水分去除水體中抗生素成分，也說明空心菜系統和水芹系統中抗生素去除效率存在差異，即由于空心菜系統對水分吸收能力較強，從而提高了抗生素的去除效率.

　　相比夏季運行情況下，抗生素抗性基因相對含量在冬季系統內相對較高，說明抗生素抗性基因在水生植物濾床中傳播擴散并不受季節變化所帶來的溫度變化影響.抗生素在廢水中殘留含量可能具有更高的相關性.研究已經證明，抗生素成分存在環境中可誘導產生具有忍耐性的抗性菌株.其中，Luo等(2010)對中國海河流域河水及沉積物中的抗生素抗性基因水平的檢測結果發現，磺胺類抗性基因豐度與磺胺類抗生素成顯著正相關，表明磺胺類抗生素的存在確實選擇性地富集了相應的抗性基因，其豐度高達1011 copies · g-1沉積物，低于本試驗sul在對照組的1012 copies · g-1底泥，高于植物組最高水平1010 copies · g-1底泥.本試驗四環素類抗性基因水平檢測發現，植物組出水中tetW、tetM和tetO含量水平均低于處理養殖廢水的人工濕地系統的1.07×1010、4.03×1010和4.92×1010 copis · L-1(鄭加玉等，2013).而在對比不同植物系統中抗生素抗性基因含量方面，研究也表明夏季運行時sulI、sulII、tetA、tetM、tetX和tetO在空心菜系統出水中具有較高含量，而冬季運行情況下sulI、sulII、tetW、tetM、tetX和tetO在水芹菜系統出水中含量較高，這與出水中抗生素濃度呈現相關性.因此，水生植物濾床中抗生素抗性基因水平與水體中殘留抗生素具有重要的關系.具體參見污水寶商城資料或http://www.dongaorq.cn更多相關技術文檔。

　　5 結論

　　研究結果表明，水生植物濾床對于畜禽養殖廢水具有一定的處理能力.結合生態工藝結構與運行機制，可推斷水生植物濾床中植物吸收作用、生物降解和水解作用是其去除廢水中抗生素的主要途徑.不同植物因其蒸發量、水力傳導不同，以及抗生素的辛醇/水分配系數對數(logKow)不同，植物對不同抗生素的富集效果不同.由于空心菜系統對水體吸收能力較大，從而提高了抗生素在其中的去除效率，相應的空心菜系統和水芹系統中抗生素去除效率具差異性.抗生素抗性基因在水生植物濾床中的傳播擴散并不受溫度變化的影響，而與抗生素在廢水中的殘留含量具有更高的相關性.