1 引言

　　生物在線預(yù)警是指利用生物體生理、生化或行為對(duì)水環(huán)境變化產(chǎn)生的反應(yīng)信息，對(duì)水質(zhì)惡化趨勢(shì)的預(yù)測(cè)和突發(fā)事件的報(bào)警(Gerhardt et al., 2006).與其他生物監(jiān)測(cè)儀器相比較，以監(jiān)測(cè)魚(yú)類(lèi)行為變化為基礎(chǔ)的水質(zhì)生物在線預(yù)警系統(tǒng)具有更好的穩(wěn)定性、可靠性、管理方便且運(yùn)行費(fèi)用低，是水源地、河流、污水處理廠等監(jiān)測(cè)水質(zhì)變化的最佳選擇(張金松等，2013).

　　環(huán)境中的污染物對(duì)幾乎所有的魚(yú)的行為都能夠產(chǎn)生影響，包括運(yùn)動(dòng)、繁殖、學(xué)習(xí)記憶能力、遷移、對(duì)掠食者的回避行為、捕食、社交等(Atchison et al., 1987).Ingram 等(2004)通過(guò)虹鱒魚(yú)的呼吸行為變化，如呼吸頻率和深度等，監(jiān)測(cè)某紙漿和造紙廢水的毒性.Kang等(2009)以污染物暴露后青鱂魚(yú)出現(xiàn)急速游動(dòng)、浮頭行動(dòng)等異常行為作為判斷水質(zhì)是否安全的依據(jù).趙曉艷等(2010)則利用非接觸類(lèi)電場(chǎng)感應(yīng)斑馬魚(yú)的活躍強(qiáng)度、呼吸頻率等可迅速檢測(cè)到水體中有機(jī)磷農(nóng)藥和抗生素的突發(fā)暴露.這些預(yù)警系統(tǒng)都是以1~2條魚(yú)為監(jiān)測(cè)單元，因在單獨(dú)空間內(nèi)其個(gè)體行為差異較大，使儀器的穩(wěn)定性能較低.和個(gè)體相比，當(dāng)魚(yú)處在群體中時(shí)可互相溝通并傳導(dǎo)信息，擁有更大的感知范圍，并且受到污染物刺激后，魚(yú)群會(huì)通過(guò)回避、急速運(yùn)動(dòng)、集群等一系列行為的改變來(lái)維持體內(nèi)的穩(wěn)定應(yīng)對(duì)環(huán)境的變化(Schlenk et al., 2001).Chew等(2009)改變以個(gè)體魚(yú)為觀察對(duì)象的方式，通過(guò)捕捉20條魚(yú)在魚(yú)缸中的分布和活動(dòng)，考察魚(yú)群的活躍水平、軌跡曲線密度、回避行為以及魚(yú)群中的“社交互動(dòng)”等來(lái)評(píng)價(jià)魚(yú)類(lèi)對(duì)污染刺激的行為反應(yīng).Barry(2011)的研究表明，在一定濃度的化學(xué)藥品的刺激下魚(yú)除了有快速游動(dòng)的反應(yīng)外，魚(yú)群的軌跡分布也發(fā)生明顯的變化，魚(yú)群更傾向于貼壁運(yùn)動(dòng)，同時(shí)分形維數(shù)也在不斷減小.因此，選擇合理的指標(biāo)，魚(yú)類(lèi)群體行為變化的連續(xù)監(jiān)測(cè)，獲得更加全面的信息，可提高水質(zhì)在線監(jiān)測(cè)預(yù)警儀器的靈敏和穩(wěn)定性.

　　本研究改變以個(gè)體魚(yú)為觀察對(duì)象的方式，通過(guò)捕捉5條斑馬魚(yú)在魚(yú)缸中的分布和活動(dòng)，考察魚(yú)群的游動(dòng)速度、高度、平均距離、分散度和不同區(qū)域停留時(shí)間等6個(gè)指標(biāo)，綜合游動(dòng)行為、通訊行為和分布區(qū)域的變化，用更加全面的信息反應(yīng)水質(zhì)突變狀況.實(shí)驗(yàn)以正常水體中斑馬魚(yú)的群體行為變化為基礎(chǔ)，模擬氯氰菊酯和溴氰菊酯這兩種典型污染物質(zhì)突發(fā)性聯(lián)合脅迫下，斑馬魚(yú)的行為響應(yīng)來(lái)驗(yàn)證監(jiān)測(cè)指標(biāo)選取的合理和有效性.

　　2 實(shí)驗(yàn)材料和方法

　　2.1 斑馬魚(yú)的培養(yǎng)

　　實(shí)驗(yàn)采用的斑馬魚(yú)(Zebrafish，Danio rerio)是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)推薦的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)生物之一，在環(huán)境毒性評(píng)價(jià)的相關(guān)研究中應(yīng)用廣泛.本實(shí)驗(yàn)室對(duì)斑馬魚(yú)的飼養(yǎng)繁殖采用流水式，養(yǎng)殖用水為脫氯自來(lái)水，水溫為(28±1)℃，溶解氧為(6.5±0.2)mg · L-1，光照周期為10 h：14 h，以豐年蝦為食，每天投食2～3次.實(shí)驗(yàn)時(shí)挑選魚(yú)齡為6~8個(gè)月，體長(zhǎng)為(30±2)mm的斑馬魚(yú)，每組實(shí)驗(yàn)用魚(yú)5條，雌雄比例為3：2，實(shí)驗(yàn)前24 h不喂食.

　　2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

　　2.2.1 斑馬魚(yú)急性毒性實(shí)驗(yàn)

　　參照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn) ISO 7346 1-3《物質(zhì)對(duì)淡水魚(yú)(斑馬魚(yú))急性致死毒性的測(cè)定》，以1.5 g(魚(yú))· L-1的要求，設(shè)置6個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，每組放10尾斑馬魚(yú).實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第0、8、12、24 h觀察并記錄各容器實(shí)驗(yàn)魚(yú)的存活情況.用鑷子夾魚(yú)的尾部，如無(wú)反應(yīng)，即認(rèn)為魚(yú)已經(jīng)死亡，發(fā)現(xiàn)死魚(yú)后及時(shí)撈出.利用Graphpad Prism 5.0擬合劑量-效應(yīng)曲線并計(jì)算得出24 h半致死濃度(LC50-24h).

　　2.2.2 斑馬魚(yú)魚(yú)群行為變化實(shí)驗(yàn)

　　采用水質(zhì)毒性在線檢測(cè)儀(RTB，深圳水務(wù)(集團(tuán))有限公司研制)進(jìn)行斑馬魚(yú)的個(gè)體和群體行為變化的定量監(jiān)測(cè)，如圖 1所示.在一個(gè)尺寸為400 mm×75 mm×300 mm的測(cè)試箱前設(shè)置一個(gè)CCD攝像頭，利用攝像追蹤系統(tǒng)和圖像分析技術(shù)，通過(guò)識(shí)別每條魚(yú)的特征輪廓來(lái)確定斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)方向與位置，并以12~16幀每秒的速度記錄標(biāo)志點(diǎn)坐標(biāo)通過(guò)軟件轉(zhuǎn)換計(jì)算出魚(yú)群的運(yùn)動(dòng)行為參數(shù)，包括游動(dòng)行為(速度和高度)、通訊行為(平均距離和分散度)和區(qū)域分布情況(各區(qū)域停留時(shí)間占總時(shí)間的比例)，各指標(biāo)定義如表 1所示.

　　圖 1 測(cè)量斑馬魚(yú)行為變化的實(shí)驗(yàn)裝置設(shè)計(jì)圖

表1 監(jiān)測(cè)指標(biāo)的解析

　　實(shí)驗(yàn)用水采用半靜態(tài)式流水實(shí)驗(yàn)，控制進(jìn)水流速為1 L · h-1，水溫為25 ℃，光照恒定，盡量減少人為、噪音等非水質(zhì)因素的干擾.實(shí)驗(yàn)共計(jì)運(yùn)行3 h.其中，前1 h為空白實(shí)驗(yàn)，記錄該組斑馬魚(yú)在正常水質(zhì)狀況下的各監(jiān)測(cè)指標(biāo)的變化范圍，從第2 h開(kāi)始時(shí)，即第60 min時(shí)加入化學(xué)物質(zhì)，模擬實(shí)際水體突發(fā)性污染事件，記錄斑馬魚(yú)的行為變化.每組實(shí)驗(yàn)的行為數(shù)據(jù)由5條魚(yú)的平均數(shù)求得，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行3組平行，結(jié)果以3組平行實(shí)驗(yàn)組的平均值顯示.

　　3 結(jié)果

　　3.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

　　氯氰菊酯和溴氰菊酯對(duì)斑馬魚(yú)的24 h半致死濃度如表 2所示.結(jié)果表明，溴氰菊酯和氯氰菊酯對(duì)斑馬魚(yú)的LC50-24h分別為13.75×10-3 mg · L-1和69.61×10-3 mg · L-1，對(duì)斑馬魚(yú)的毒性大小為溴氰菊酯>氯氰菊酯.本研究以LC50-24h為1個(gè)毒性單位(1 TU)，在兩種化合物在各自0.25 TU(氯氰菊酯3.75 μg · L-1和溴氰菊酯15 μg · L-1)的聯(lián)合暴露下觀察斑馬魚(yú)的行為變化規(guī)律.

表2 氯氰菊酯和溴氰菊酯對(duì)斑馬魚(yú)的24 h急性毒性

　　3.2 斑馬魚(yú)游動(dòng)行為的變化

　　如圖 2所示，第1 h正常水體暴露時(shí)，無(wú)外界刺激的干擾，斑馬魚(yú)的行為強(qiáng)度變化穩(wěn)定，游動(dòng)速度主要在30~60 mm · s-1之間均勻波動(dòng)，平均速度為46.52 mm · s-1，標(biāo)準(zhǔn)差為9.08 mm · s-1;而高度在50~200 mm之間均勻波動(dòng)，第1 h的平均高度值為124.60 mm，標(biāo)準(zhǔn)差為39.85 mm，如表 3所示.

　　圖 2 突發(fā)污染暴露下斑馬魚(yú)群體游動(dòng)行為的變化

　　接觸到污染物的斑馬魚(yú)興奮異常，速度在30 min內(nèi)持續(xù)增大，變化范圍明顯高于暴露前水平，在60~85 mm · s-1的范圍內(nèi)波動(dòng)，最大速度高達(dá)84.25 mm · s-1.隨后急劇下降，在15 min內(nèi)降低至暴露前均值的42%左右，速度分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差也是暴露前2倍，如表 3.最終速度維持在10~30 mm · s-1的水平并在后續(xù)的暴露中都維持在這一范圍內(nèi)變化.而高度的變化稍微滯后于速度的突變，在暴露12 min后才明顯增高，并在持續(xù)的20 min內(nèi)均值都高于200 mm，隨著暴露時(shí)間的增長(zhǎng)，高度又逐漸恢復(fù)，第2 h的均值大小和暴露前相當(dāng)，但標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，即數(shù)據(jù)波動(dòng)大.

表3 暴露前后斑馬魚(yú)游動(dòng)行為數(shù)值分析

　　3.3 斑馬魚(yú)通訊行為的變化

　　受到污染物刺激后的魚(yú)群明顯失去原有的群體性，在剛接觸到污染物的10 min內(nèi)有明顯的集群現(xiàn)象，平均距離和分散度短暫下降，然后又逐漸增大.魚(yú)群分布在暴露1 h后與暴露前差異顯著，平均距離均值從暴露前124 mm增加到178 mm，即增大43.5%，而分散度均值也由暴露前10%增加到22%，增大120%，如表 3所示.在第2 h的暴露中，平均距離和分散度的變化又有緩慢恢復(fù)至暴露前水平的趨勢(shì)，均值迅速下降，但標(biāo)準(zhǔn)差仍呈增大趨勢(shì)，即數(shù)據(jù)波動(dòng)變大，如圖 3所示.

　　圖 3 突發(fā)污染暴露下斑馬魚(yú)社交行為的變化

　　3.4 斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)區(qū)域的分布

　　從圖 4明顯可以看出，正常水體中，斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)軌跡均勻分布在整個(gè)魚(yú)箱中，污染物暴露后，魚(yú)的活動(dòng)范圍明顯減小，有逃離監(jiān)測(cè)箱左下角(進(jìn)水口)在右上角(出口處)游動(dòng)的趨勢(shì).為了更好的研 究魚(yú)的逃避行為，將這一趨勢(shì)進(jìn)行量化，把魚(yú)箱等分為五行五列，分別統(tǒng)計(jì)每5 min內(nèi)斑馬魚(yú)在每一區(qū)域的停留時(shí)間占總時(shí)間的比率，結(jié)果如圖 5所示.暴露前1 h斑馬魚(yú)在各區(qū)域內(nèi)的分布基本穩(wěn)定，其中在列1和行5區(qū)域內(nèi)停留時(shí)間較多，為27%和25%左右，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，這兩個(gè)區(qū)域的停留時(shí)間逐漸縮短，而列5和行1內(nèi)有明顯的增加趨勢(shì)，都增至25%左右.

　　圖 4 斑馬魚(yú)的魚(yú)群運(yùn)動(dòng)軌跡圖(a. 第30 min，b. 第90 min)

　　圖 5 斑馬魚(yú)暴露前后運(yùn)動(dòng)區(qū)域的分布

　　4 討論

　　正常水體在監(jiān)測(cè)期間水質(zhì)保持一致，因無(wú)外來(lái)刺激的干擾，斑馬魚(yú)魚(yú)群的行為變化穩(wěn)定，游動(dòng)速度、高度、平均距離和分散度等指標(biāo)都在均值上下穩(wěn)定波動(dòng)，運(yùn)動(dòng)軌跡在檢測(cè)箱中均勻分布.由此可知，斑馬魚(yú)的游動(dòng)行為在正常的水質(zhì)狀況下呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性，可用于水質(zhì)突變條件下斑馬魚(yú)的行為比較，具有一定的可靠性.Gerhardt等(2002)證明在一定的水體環(huán)境下，利用不同頻率信號(hào)記錄的生物的游動(dòng)、爬行、行走和呼吸等運(yùn)動(dòng)行為參數(shù)都在一個(gè)穩(wěn)定范圍內(nèi)變化.斑馬魚(yú)就被應(yīng)用于該儀器中，空白暴露時(shí)穩(wěn)定的行為變化趨勢(shì)為后續(xù)污染物暴露的反應(yīng)提供了可靠的參照(趙曉艷等，2010).

　　利用對(duì)化學(xué)刺激品敏銳的感覺(jué)器官，斑馬魚(yú)可感知水體突變的狀況，表現(xiàn)出慌亂不安的過(guò)度活躍(Graham et al., 2004).游動(dòng)速度在暴露過(guò)程中變化最為敏感和劇烈，前30 min內(nèi)持續(xù)增大，變化區(qū)間由暴露前30~60 mm · s-1變化到60~85 mm · s-1.這種急速運(yùn)動(dòng)被稱為“回避反應(yīng)”，是魚(yú)對(duì)水環(huán)境污染所產(chǎn)生的第一層次行為變化，其表現(xiàn)形式和所維持的時(shí)間長(zhǎng)短受暴露化合物的種類(lèi)及濃度的影響(任宗明等，2008).斑馬魚(yú)通過(guò)行為機(jī)制逐漸適應(yīng)污染環(huán)境而導(dǎo)致的行為的變化，但隨著暴露時(shí)間的增長(zhǎng)，污染物逐漸在斑馬魚(yú)體內(nèi)積累，毒性最終爆發(fā).暴露30 min后，斑馬魚(yú)的游動(dòng)速度急劇下降.有研究表明，溴氰菊酯具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，可通過(guò)抑制腦突觸體膜上的ATP酶，使突觸后膜上的乙酰膽堿酯酶(AchE)等神經(jīng)遞質(zhì)大量聚集，從而引起腦AchE被抑制，而氯氰菊酯的暴露則可使魚(yú)體內(nèi)產(chǎn)生大量的氧元素O2-，以致SOD酶活性被抑制，導(dǎo)致鰓、肝等組織的損傷(Soderlund et al., 2002).污染物對(duì)斑馬魚(yú)生理及組織等的影響導(dǎo)致其游泳速度最終維持在10~30 mm · s-1之間，僅是暴露前的1/2倍.

　　速度突然增大是魚(yú)類(lèi)對(duì)環(huán)境變化刺激的第一反應(yīng)，其次才是咳嗽頻率等呼吸行為的改變(Gerhardt et al., 2005).Kang等(2009)以“急速運(yùn)動(dòng)”和“浮頭行動(dòng)”作為衡量青鱂魚(yú)運(yùn)動(dòng)異常的重要指標(biāo)，指出污染物質(zhì)對(duì)魚(yú)呼吸系統(tǒng)阻礙可導(dǎo)致游動(dòng)深度的變化.但是，對(duì)呼吸系統(tǒng)的損傷要有一個(gè)毒物累積的過(guò)程，所以高度的反應(yīng)會(huì)滯后于速度的變化.從魚(yú)群高度的變化可知，暴露12 min后游動(dòng)高度明顯的增大，由暴露前的50~200 mm變化到150~270 mm.隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，斑馬魚(yú)不斷通過(guò)自身的生理和行為調(diào)節(jié)適應(yīng)了外界環(huán)境的壓力，游動(dòng)高度在第2 h內(nèi)逐漸恢復(fù)至暴露前水平，但標(biāo)準(zhǔn)差仍然繼續(xù)增大，即斑馬魚(yú)不斷調(diào)節(jié)適應(yīng)的過(guò)程中行為的穩(wěn)定性變差.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.dongaorq.cn更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　受到環(huán)境污染的刺激，魚(yú)類(lèi)會(huì)在驚恐慌亂或靜止某個(gè)角落的狀態(tài)下使魚(yú)群失去原有的分布和通訊行為.接觸到污染物的前10 min內(nèi)平均距離和分散度迅速下降，魚(yú)群出現(xiàn)短暫的集群現(xiàn)象.黃東龍等(2001)實(shí)證在鉛、鎘等重金屬的暴露下，斑馬魚(yú)在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生明顯的群聚性行為.這種行為也是一種對(duì)外界壓力的回避行為.隨著接觸時(shí)間的增長(zhǎng)，魚(yú)群變得松散，群體性游動(dòng)現(xiàn)象減弱，平均距離和分散度的波動(dòng)區(qū)間明顯高于暴露前水平，分散度甚至為暴露前的2倍.Chew等(2009)證明在氯的刺激下，斑馬魚(yú)魚(yú)群失去原有的運(yùn)動(dòng)、分布和社交規(guī)律.進(jìn)一步研究中還要再增加一些如平衡損失率、不規(guī)則轉(zhuǎn)彎等個(gè)體異常的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，這樣個(gè)體和群體變化相結(jié)合，以獲得更加全面的信息.

　　隨著暴露時(shí)間的增長(zhǎng)，斑馬魚(yú)不斷通過(guò)行為、代謝調(diào)節(jié)等適應(yīng)環(huán)境的變化，游動(dòng)高度、平均距離和分散度等逐漸恢復(fù)至暴露前水平，但仍選擇在濃度相對(duì)較低、接近水面的出水口附近游動(dòng).感知到水體中污染物的存在后，魚(yú)會(huì)往無(wú)污染或污染程度較輕的區(qū)域逃避(Clingerman et al., 2007).Gullick等(2003)使裝置形成不同的污染物濃度梯度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)魚(yú)的大部分時(shí)間集中在潔凈水一端.雖然水箱中的水力流態(tài)是自下向上但進(jìn)水口處的濃度還是高于出水處，魚(yú)可感知這些區(qū)域的差異，逃離濃度較高的列1和2的區(qū)域在行1和行2的停留時(shí)間明顯增加.

　　5 結(jié)論

　　斑馬魚(yú)是一種群游魚(yú)類(lèi)，在水體中連續(xù)不斷的游動(dòng)且可互相溝通，和個(gè)體相比集群之后能快速獲得更大的感知范圍，快速傳導(dǎo)信息，為水質(zhì)在線預(yù)警提供更加全面、有效的信息.在溴氰菊酯和氯氰菊酯的聯(lián)合暴露的刺激下，斑馬魚(yú)的表現(xiàn)出快速不安的急速游動(dòng)，速度由暴露前30~60 mm · s-1增至60~85 mm · s-1，而高度的變化滯后于速度12 min左右.在活動(dòng)強(qiáng)度發(fā)生改變的同時(shí)，斑馬魚(yú)魚(yú)群的分散度和平均距離也不斷增大，分別增大43.6%和120.0%.但隨著暴露時(shí)間的增長(zhǎng)，污染物也不斷在體內(nèi)積累，最終導(dǎo)致游泳速度明顯下降且在污染濃度較低的區(qū)域停留時(shí)間增長(zhǎng)，而高度、平均距離和分散度逐漸恢復(fù)至暴露前水平，但波動(dòng)較大.利用速度、高度、平均距離、分散度、不同區(qū)域停留時(shí)間等6項(xiàng)可完整的描述這一過(guò)程的變化，全面及時(shí)的獲得魚(yú)群受污染物影響的行為變化特征，是用于水質(zhì)預(yù)警的可靠指標(biāo).后續(xù)的研究應(yīng)該考察斑馬魚(yú)魚(yú)群對(duì)其他污染物的行為反應(yīng)，并通過(guò)計(jì)算和比較各指標(biāo)權(quán)重和參與運(yùn)算的方式，確定一個(gè)能夠綜合評(píng)價(jià)水質(zhì)變化程度的參數(shù).