1 引言

　　隨著科技的迅速發展，工業化和城市化程度的不斷提高，水體富營養化的問題日益嚴重，使得水資源更加緊張.而氮是引起水體富營養化的主要因素.所以越來越多的國家和地區制定了氮排放標準.因此，研究開發經濟、高效的脫氮技術已成為水污染控制工程領域的研究重點.

　　生物處理法作為19 世紀末廢水處理新型技術，與物化處理法相比具有處理費用低，不會對環境造成二次污染等優點.因此，生物處理法至今已成為世界各國污水二、三級處理的主要手段.眾所周知氮元素可在相應微生物的作用下轉化成各種氧化態和化學形式(目前已知的生物氮循環途徑如 圖 1所示)，因此在污水生物脫氮處理中衍生了大量組合工藝.而厭氧氨氧化過程是目前最捷徑的生物脫氮過程，因此被譽為最具前景的污水脫氮工藝.為了更好的將厭氧氨氧化工藝應用到實際規模中，本文著重對厭氧氨氧化菌的發現及其與污水處理中常見細菌的協同與競爭關系進行了詳細的綜述.旨在為厭氧氨氧化工藝在污水生物處理中的應用提供理論依據，并為今后厭氧氨氧化工藝的研究方向提出一些意見.

　　圖 1 氮循環示意圖

　　2 厭氧氨氧化概述

　　早在1976年，Broda預言在自然界中存在一種以NO-2或NO-3作為電子受體把NH+4氧化成N2的化能自養型細菌.直到1995年，Mulder等處理酵母廢水的反硝化流化床反應器內發現了NH+4消失的現象，從而證實了厭氧氨氧化反應的存在.

　　厭氧氨氧化(Anaerobic ammonium oxidation，Anammox)是在缺氧條件下以亞硝酸鹽(NO-2)為電子受體將氨(NH+4)轉化成氮氣(N2)，同時伴隨著以亞硝酸鹽為電子供體固定CO2并產生硝酸鹽(NO-3)的生物過程.執行該過程的微生物稱之為厭氧氨氧化菌(Anaerobic ammonium oxidation bacteria，AAOB)，其化學計量學方程式如下：

　　1NH+4+1.32NO-2+0.066HCO-3+0.13H+→ 1.02N2+0.26NO-3+0.066CH2O0.5N0.15+2.03H2O

　　由于氨氧化細菌(Ammonium oxidation bacteria，AOB)可將氨氧化成亞硝酸鹽，為AAOB提供基質，所以目前對厭氧氨氧化工藝的應用通常與短程硝化(亞硝化)聯系在一起. 圖 2為亞硝化-厭氧氨氧化工藝與傳統的硝化-反硝化工藝的對比，通過對比可知亞硝化-厭氧氨氧化工藝具有如下優點：

　　圖 2 硝化-反硝化工藝與亞硝化-厭氧氨氧化工藝的比較

　　①厭氧氨氧化在缺氧條件下進行，無需氧氣的供應，可節省62.5%的能源消耗.

　　②厭氧氨氧化以無機碳(CO2或HCO-3)為碳源，無需投加有機碳，大大節省了碳源.

　　③亞硝化-厭氧氨氧化所產生的CO2與普通的硝化-反硝化系統相比減少90%.

　　④AAOB生長緩慢、產率低，因此工藝剩余污泥量少，污泥處置費用低.

　　⑤厭氧氨氧化氮去除率及氮去除負荷較高，從而能夠減少工藝占地面積，降低工藝基建成本.

　　AAOB是一群分支很深的浮霉狀菌.AAOB生長緩慢，在30~40℃條件下，其倍增時間為10~14 d，細胞產率為0.11 g(VSS)/g(NH+4)，如果對培養條件進行優化，其倍增時間可縮短至4.8 d，甚至1.8 d.如表 1所示為目前已發現的5屬17種Anammox菌.相關研究表明，AAOB為地球氮循環做出了巨大貢獻，目前已在自然環境和人工環境中發現了大量AAOB的存在.其中厭氧的自然生態系統包括：海洋沉積物和海洋水體、淡水沉積物和淡水水體、紅樹林地區(以及陸地生態系統等.而在人工生態系統中包括：污水處理廠、海洋循環水產養殖系統、垃圾滲濾液處理系統.此外，人們以各種環境中發現的AAOB作為基礎，將其引入污水處理系統，循序漸進地對AAOB進行馴化培養以處理各類廢水，包括實驗室規模、中試規模及實際規模的污泥消化液、垃圾滲濾液、焦化廢水、味精廢水、養豬廢水(以及制藥廢水等.

　　表1 目前已發現的5屬17種AAOB

　　厭氧氨氧化工藝是一種高效脫氮工藝，其最大氮負荷可達9.5 kg · m-3 · d-1，且處理污水成本只需0.75C =· kg-1，因此厭氧氨氧化是一種極具前景的生物處理工藝.但由于厭氧氨氧化至今未能獲得純培養，為了得到高純度的AAOB，目前只能用密度梯度離心的方法獲得純度為99.8%的AAOB，因此對AAOB的研究仍受到很大的阻礙，這意味著對厭氧氨氧化工藝的應用及推廣也會帶來諸多難題.然而“在單個細胞水平上對基因組進行測序”的單細胞測序技術能夠解決上述難題.因此對AAOB的進一步了解有賴于單細胞測序技術的成熟應用.

　　3 AAOB與其他微生物之間的關系

　　在自然生態系統和人工生態系統中，AAOB不僅與環境有著密切的關系，而且與其他微生物也有著密切的關系.微生物之間的關系有種內和種間關系.其中AAOB的種內關系主要體現在群體感應系統，而AAOB的種間關系主要是與氨氧化菌、亞硝酸鹽氧化菌、反硝化菌、厭氧甲烷氧化菌的合作與競爭關系.

　　3.1 AAOB的種內關系(群體感應系統)

　　群體感應作為一種通訊機制在微生物細胞之間普遍存在，它能夠根據菌群密度和周圍環境的變化來調節基因表達，從而控制菌群行為.由于AAOB 至今未能得到純培物，所以對AAOB 群體感應的深入研究無從下手. 但根據目前對AAOB的研究來看，Ding等(Ding et al.，2013)認為有3個現象可以推測厭氧氨氧化菌之間存在群體感應系統.

　　(1)厭氧氨氧化活性存在密度依賴性.根據Strous等的研究發現，只有當AAOB細胞濃度大于1010～1011 cell · mL-1時，AAOB才具有厭氧氨氧化活性.

　　(2)目前認為AAOB屬于革蘭氏陰性細菌，而對于革蘭氏陰性細菌的群體感應系統而言其自誘導物為N-乙酰化高絲氨酸內酯(N-acyl-homoserine lactones，AHLs)類化合物，主要用作種內“語言”，且對于革蘭氏陰性菌中AHLs的合成來說，S-腺苷甲硫氨酸(S- adenosyl methionine，SAM)和乙酰化載體蛋白(acyl-acyl carrier protein，acyl-ACP)是必要的生物分子.Strous等利用宏基因組學技術對C and idatus Kuenenia stuttgartiensis 的脂肪酸代謝基因組學信息進行了研究，發現其具有編碼SAM和acyl-ACP的合成酶的相關基因，證明其具有自誘導物合成潛力.

　　(3)De Clippeleir 等在研究長鏈高絲氨酸內酯對OLAND生物膜中厭氧氨氧化速率的影響時發現，在OLAND生物膜系統 中，添加N-十二酰基高絲氨酸內酯(N-dodecanoyl homoserine lactone，C12-HSL)可以增強AAOB活性，而對AOB沒有影響.C12-HSL屬于AHLs中碳鏈較長的一種，其對革蘭氏陰性細菌的自誘導起到關鍵的作用.

　　3.2 AAOB的種間關系 3.2.1 AAOB的種間競爭關系

　　目前已發現的AAOB有5屬17種，根據目前對AAOB的研究來說，除了用AAOB處理垃圾滲濾液的研究中發現C and idatus Scalindua brodae和C and idatus Scalindua wagneri有等量共存的現象，絕大多數情況下很少能發現兩種AAOB在相同單一生境中等量共存的現象，這意味著AAOB的確存在種間的競爭關系.不論在自然生態系統還是人工生態系統C and idatus Brocadia和C and idatus Kuenenia都最為常見，現以該兩種菌屬為例討論AAOB的種間競爭關系.

　　圖 3 C and idatus Kuenenia與C and idatus Brocadia的競爭曲線

　　van der Star等，用膜生物反應器富集AAOB時發現，在富集過程中存在種群結構逐漸由原來的C and idatus Brocadia轉變為C and idatus Kuenenia的現象.他們認為C and idatus Brocadia的繁殖策略屬于r-策略，而C and idatus Kuenenia則屬于K-策略. 圖 3為C and idatus Kuenenia與C and idatus Brocadia的競爭曲線，其中C and idatus Kuenenia的亞硝酸鹽半飽和常數KS=0.2～0.3 μmol · L-1，而C and idatus Brocadia的亞硝酸鹽半飽和常數KS≈5 μmol · L-1.因此C and idatus Kuenenia較C and idatus Brocadia生長緩慢，所以在底物濃度較低的情況下，C and idatus Kuenenia占主導作用，相反在底物濃度較高的情況下，C and idatus Brocadia占主導作用.因此，對于污水處理系統的高效運行來說，C and idatus Brocadia可能是很好的選擇.而對于處理低濃度廢水C and idatus Kuenenia則更為合適.

　　3.2.2 AAOB與硝化菌的種間關系

　　(1)AAOB與硝化菌基于底物協同作用

　　AOB將氨氧化成亞硝酸鹽，為AAOB提供基質，與此同時AAOB也為AOB去除有毒物質(亞硝酸鹽).在自然生態系統中，AOB和AAOB經常共同生長在氧最小區域(oxygen minimum zones，OMZs).目前已在多處海洋的OMZs處發現AOB和AAOB的存在，如智利北部OMZs發現AAOB，且在同一地平線處的秘魯OMZs中發現AOB.如 圖 4所示，為海洋生態系統中AAOB與其他微生物的競爭協同關系.據報道，在海洋50 m深處，AAOB的生物量(高達3000 cell · mL-1)和多樣性最高，而當深度達到300 m時，AAOB的生物量降低到450 cell · mL-1.這是因為深達300 m處的海洋極度缺氧，導致AOB不能生存，因此不能為AAOB提供充足的亞硝酸鹽，所以在300 m深處AAOB活性喪失.同時在黑海的OMZs中也存在著AOB-AAOB互利共存的現象.

　　圖 4 海洋生態系統中AAOB與其他微生物的競爭協同作用示意圖

　　在人工生態系統中，CANON(completely autotrophic nitrogen removal over nitrite)工藝和OLAND(oxygen limited autotrophic nitrification and denitrification)工藝結合AOB和AAOB進行脫氮.其原理為AOB首先將氨轉化成亞硝酸鹽，之后由AAOB將剩余的氨和AOB產生的亞硝酸鹽轉化成氮氣.Sliekers等研究表明AAOB不具備水解尿素的能力，因此AAOB不能以尿素作為氮源，但是AOB具有將尿素轉化為氨氮的能力，因此在處理含尿素廢水時，AOB不但能為AAOB提供亞硝酸鹽，而且還能提供氨氮.AAOB和AOB的協同作用主要依賴氨和亞硝酸鹽，其中亞硝酸鹽占主導地位.

　　(2)AAOB與硝化菌空間協同作用

　　空間協同作用主要存在于顆粒污泥和生物膜中，AAOB、AOB、NOB在顆粒污泥或生物膜中的位置主要由DO決定.因為AAOB對氧氣極為敏感，耐氧能力極低，所以AOB通常長在顆粒污泥或生物膜的表層，而AAOB則長在內部、這是因為AOB可以消耗氧氣為AAOB提供缺氧環境，同時還可以提供亞硝酸鹽基質.對NOB進行檢測發現其在顆粒污泥中的含量遠低于AOB，究其原因主要是在低氧環境下AOB對氧的親和力比NOB要強. 圖 5所示為AAOB與AOB的空間協同作用關系.

　　圖 5 AAOB與AOB的空間協同作用示意圖(背景為顆粒污泥切片熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)圖片; 其中AAOB探針AMX368用Cy3標記(紅色)，AOB探針NSO190、NOS1225用Cy5標記(藍色)，NOB探針Ntspa662、NIT1035用Fluos標記(綠色))

　　(3)AAOB與硝化菌基于底物和DO的競爭作用

　　AOB和AAOB都以氨作為基質，然而DO作為一個重要的影響因子可以決定系統中的優勢菌種.由于AAOB無需氧氣所以在缺氧條件下AAOB占主導作用.但這并不意味著AOB會在系統中消失，因為AOB有多種代謝方式，這有益于他們在不利的條件下生存(Bock et al.，1995). 有趣的是，據報道Nitrosomonas europaea也可以按照厭氧氨氧化方式進行代謝，但其競爭基質的能力弱于AAOB(Schmidt and.

　　氧對厭氧氨氧化活性具有極強抑制作用.據Jetten等報道微量的溶解氧(>0.5%)就會抑制厭氧氨氧化過程.而Strous等研究表明，只有在充入惰性氣體，將水中的溶解氧完全吹脫時，AAOB才具備降解氨及亞硝酸鹽的能力，也就是說只有在嚴格無氧的條件下才能檢測到厭氧氨氧化活性，且該研究進一步表明，溶解氧抑制是可逆的.此外AAOB與AOB相比其倍增時間長且細胞產率低.以上這些說明，當AOB與AAOB在好氧條件下進行競爭，AOB會獲得更多的基質和空間.

　　3.2.3 AAOB與反硝化菌的種間關系

　　(1)AAOB與反硝化菌基于底物的協同作用

　　在自然生態系統中，如海洋表面，由于氧氣比較充足，氨可被氧化為硝酸鹽，在水的流動作用下硝酸鹽被傳輸到海洋深處的缺氧區，在缺氧區反硝化菌可將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，為AAOB提供必要基質. 為了衡量厭氧氨氧化作用對海洋氮循環的貢獻大小，對格陵蘭東、西海岸的沉積物、杜爾塞海灣的缺氧水體以及黑海水域做了相關研究.發現由厭氧氨氧化作用所產生的N2占總N2的量分別為：1%~35%、19%~35%和40%.

　　在人工生態系統中，AAOB可以和反硝化菌共存.在以反硝化污泥當做種泥來啟動厭氧氨氧化反應器研究中發現AAOB和反硝化菌都以亞硝酸鹽當做基質，但能夠決定脫氮過程的主要因素是C/N比和TOC負荷.Tal等以硝化污泥和反硝化污泥當做種泥來富集厭氧氨氧化，結果表明用反硝化污泥富集的厭氧氨氧化活性較高(以聯氨氧化活性表征約0.16 μmol · beed-1 · h-1)，說明AAOB和反硝化菌的協同作用要強于AOB.

　　(2)AAOB與反硝化菌基于底物和有機物的競爭作用

　　反硝化菌和AAOB都以亞硝酸鹽作為基質，但反硝化菌的另一種基質有機物能夠抑制厭氧氨氧化活性.當COD/NO-2-N比值較低時，以厭氧氨氧化方式去除氮的過程不會有顯著的影響，甚至AAOB能夠利用有機物作為基質.但當COD/NO-2-N比值較高時，亞硝酸鹽將會被反硝化菌所利用，從而抑制AAOB.值得注意的是反硝化菌是異養菌，其生長速率和細胞產量都比AAOB高，自養的AAOB逐漸被淘洗從而使厭氧氨氧化的脫氮能力降低，這意味著如果反應器一直在不利于AAOB的條件下運行，反硝化菌的數量將會超過AAOB的數量，而AAOB在整個菌群中的比例將會隨之降低.但相關研究表明在少量有機物存在的條件下AAOB可以執行另一種代謝途徑：利用有機物作為電子供體將硝酸鹽還原為氨，即異化硝酸鹽還原為氨(dissimilatory nitrate reduction to ammonia，DNRA). 圖 6所示為少量有機物存在條件下，AAOB與反硝化菌的競爭關系.

　　圖 6 有機物存在下AAOB與反硝化菌的競爭關系

　　Güven 等研究表明，有機酸能被AAOB轉化，而對于丙酸來說，其消耗速率較高為0.8 nmol · min-1 · mg protein-1，而葡萄糖、甲酸、丙酸則對厭氧氨氧化的活性無明顯影響.進一步研究發現AAOB以亞硝酸鹽或硝酸鹽作為電子受體的情況下可將丙酸轉化為CO2.且對長達150 d系統中的微生物進行種群結構的分析發現AAOB數量和反硝化菌的數量并沒有顯著變化，這意味著AAOB與反硝化菌相比顯示出對丙酸的競爭優勢.在膜曝氣生物膜系統中，當COD/N>2時，厭氧氨氧化活性降低，異養菌成為優勢菌屬.當COD高于300 mg · L-1時，厭氧氨氧化活性喪失，甚至從系統中消失. Molinuevo等研究表明，當COD高于290 mg · L-1時，厭氧氨氧化作用被反硝化作用所取代.如若發生上述這些情況，通常采用AAOB細胞固定化技術或額外投加AAOB的方法來解決.

　　3.2.4 AAOB與厭氧甲烷氧化菌的種間關系

　　據報道氨、溶解性甲烷、亞硝酸鹽(硝酸鹽)通常共存于缺氧生態環境中.而根據化學計量反應式(1)(2)，吉布斯自由能變皆小于零，說明反應可自發正向進行，因此可以推測自然界中存在以NO-2和NO-3為電子受體的厭氧甲烷氧化過程.但經過長時間的調查和研究都未曾在自然界中尋其蹤跡.直至1991年，Smith等利用原位自然梯度示蹤實驗在受污染的地下水環境中發現了厭氧甲烷氧化耦合反硝化的現象，但一直未能獲得其富集培養物.直至2006年Raghoebarsing 等，用Twentekanaal河的缺氧沉積物作為接種污泥，在實驗室條件下獲得了以硝態氮作為電子受體的厭氧甲烷氧化富集培養物，并將該過程命名為反硝化型甲烷厭氧氧化(Denitrification-dependent anaerobic methane oxidation，DAMO). 值得注意的是，當系統中同時存在NO-2和NO-3時，反硝化型厭氧甲烷氧化過程優先利用亞硝酸鹽作為電子受體，因此又將該過程稱為依賴亞硝酸鹽型的厭氧甲烷氧化(nitrite-dependent anaerobic methane oxidation，N-DAMO).

　　在自然生態系統中，N-DAMO主要分布于淡水水域，且在淡水沉積物和淡水水域中也發現了AAOB的存在，這是否能夠說明N-DAMO和AAOB可以在相同的生境下共存呢?通過對N-DAMO與AAOB的生理學和生態學的研究表明，N-DAMO與AAOB很可能在含有甲烷、氨、氮氧化物的缺氧生態環境中共存.

　　Wang，在研究水稻土(0~100 cm)中N-DAMO與AAOB的共存和分布時發現N-DAMO與AAOB共存于水稻土中，且兩者均在30~60 cm處分布較多.Yang 等，對青藏高原的兩個鹽湖(鹽度分別為32和84 g · L-1)的表層沉積物進行研究，發現N-DAMO和AAOB可以共存于天然鹽堿環境中.Zhu 等，對濕地生態系統中的厭氧氨氧化和厭氧甲烷氧化作用進行了詳細的綜述，并推測淡水濕地非常適合AAOB和N-DAMO的共同生長.

　　在人工生態系統中，同樣也發現了N-DAMO與AAOB共存的現象.Luesken等，以N-DAMO富集污泥(70%~80%)作為種泥，在SBR反應器中進行N-DAMO和AAOB的混合培養.161 d后，混合培養物中N-DAMO和AAOB的數量各占50%左右，且該系統能有效的同步去除氨、溶解性甲烷及亞硝酸鹽，其亞硝酸鹽轉化速率為0.1 kg · m-3 · d-1(17.2 mmol · d-1).而Zhu 等，則以實際規模的厭氧氨氧化反應器中的顆粒污泥作為種泥，進行N-DAMO和AAOB的混合培養研究.研究表明AAOB顆粒污泥作為接種污泥進行N-DAMO和AAOB的混合培養是可行的.同時他們也證明了實際規模的厭氧氨氧化反應器中的N-DAMO的確為NO-2(或NO-3)及甲烷的去除做了貢獻.

　　關于N-DAMO與AAOB的協同與競爭作用的機制研究較少.如 圖 6所示，為AAOB與N-DAMO的競爭與協同作用關系.從圖中可以看出，N-DAMO與AAOB都在缺氧條件下生存且都以亞硝酸鹽作為電子受體，即他們在同一個體系中共同競爭亞硝酸鹽.且Jetten等表明如果系統中氨含量過高，則N-DAMO將會失去與AAOB的競爭能力，這說明AAOB與N-DAMO相比具有更強的亞硝酸鹽親和能力.此外，N-DAMO反應過程中所產生的CO2可作為AAOB的無機碳源，而當NO-2濃度較低時，AAOB反應過程中產生的NO-3也可作為N-DAMO的電子受體.

　　厭氧消化工藝的主要終產物為氨和甲烷.氣相中的甲烷易被收集和純化用作能源物質，但液相中的甲烷卻很難被回收，尤其是在低溫條件下.如果不對溶解性甲烷進行適當處理，其將會緩慢釋放到空氣中造 成溫室效應.因此N-DAMO與AAOB混合培養技術 用于處理厭氧消化工藝出水具有非常光明的前景.具體參見污水寶商城資料或http://www.dongaorq.cn更多相關技術文檔。

　　圖 7 AAOB與N-DAMO的競爭與協同作用示意圖(背景為熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)圖片; 其中AAOB探針AMX368用Cy5標記(藍色)，N-DAMO探針DBACT1027用Cy3標記(黃色))

　　厭氧氨氧化工藝作為一種具有能耗低、無需碳源等優點的新興工藝，受到越來越多學者的研究和關注.但執行厭氧氨氧化過程的AAOB生長緩慢、細胞產率低，且易受環境條件的影響，使得該工藝應用受到嚴重阻礙.為了更好的將厭氧氨氧化工藝投入實際生產規模中，對有利于AAOB種群競爭的因素進行相關研究是相當必要的.而想要促進厭氧氨氧化生長，提高厭氧氨氧化活性，必須優化營養條件和環境條件.如 圖 8所示為各競爭因素對AAOB種群結構的影響.通過控制運行參數可對種群結構進行調整，使相應的菌種介入為AAOB提供基質，而將AAOB的競爭 者從反應器中淘汰.因此研究AAOB與其他細菌的協同競爭關系相當重要.

　　圖 8 競爭因素對AAOB種群結構的影響

　　對今后AAOB與其他細菌的協同競爭關系的相關研究，建議學者們從如下幾個方面進行.

　　1)由于厭氧氨氧化的純培物至今未能獲得，因此阻礙了AAOB的群體感應系統和種內競爭的機理研究，為更加深入的了解AAOB種內關系建議加強AAOB的純培養研究.

　　2)目前只對C and idatus Kuenenia stuttgartiensis和C and idatus Scalindua profunda的基因組進行了研究，且表現出明顯的區別.而其他的厭氧氨氧化菌的序列測定仍沒有報道，是否其他厭氧氨氧化菌也擁有某些特殊功能基因，而這些基因又能夠潛在的影響AAOB種內關系，這對AAOB的種內關系的研究來說具有非常重要的意義.

　　3)由于N-DAMO的研究才剛剛起步，所以目前對N-DAMO與AAOB混合培養的研究甚少，以至于對N-DAMO與AAOB的協同競爭關系仍然不明確，而厭氧氨氧化-甲烷厭氧氧化聯合工藝對處理厭氧消化工藝出水非常有效，因此在今后厭氧消化工藝的研究中可以將其推廣以致應用.