1 引言
隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)規(guī)�；a(chǎn)及國務(wù)院審議通過《畜禽規(guī)模養(yǎng)殖污染防治條例(草案)》，畜禽養(yǎng)殖場污水的高效無害化處理日顯重要.采用沼氣池厭氧處理是當(dāng)前對畜禽養(yǎng)殖污水最常見的處理方式，但從沼氣池中排出的沼液中富含氮磷等營養(yǎng)素，直接排放到天然水體中仍然會引起水體嚴(yán)重富營養(yǎng)化.將沼液直接歸田然后通過農(nóng)作物吸收是當(dāng)前沼液最主要的處理方式.然而在農(nóng)村城鎮(zhèn)化建設(shè)的背景下，沼液直接歸田也存在受季節(jié)影響、單位面積處理效率低、所需配套農(nóng)田面積大等問題.因此，仍需尋找高效的沼液安全利用途徑.
利用藻類的吸收、富集和降解作用，可有效對污水進行處理.早在1957年，Oswald等提出利用藻類去除污水中氮磷的可行性，之后應(yīng)用微藻處理生活污水和工業(yè)污水的研究不斷深入.Tam和Wong證實了蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)和柵藻(Scenedesmus sp.)在污水二級處理中具有良好的氮、磷的去除效果，經(jīng)7 d處理即可去除污水中2/3以上的氮磷.董俊德等研究表明小顫藻(Oscillatoria tenuis)和兩棲顫藻(O. amphibia)對污水的無機磷去除率高，而對硝態(tài)氮的處理能力較差;極大螺旋藻(Spirulina masima)則能去除較多的硝態(tài)氮.Martınez等研究了溫度和攪拌形式對斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)在二級城市污水中的脫氮除磷能力，發(fā)現(xiàn)在25 ℃和磁攪拌的情況下，磷的最大去除效率可達98%，氨氮的去除率可達到100%.李川等發(fā)現(xiàn)固定化的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)對人工污水中NH+4-N的去除效率最好，而魚腥藻(Anabaena sp.)對NO-3-N的去除率高.劉林林等對15株微藻在豬場養(yǎng)殖污水中的氮磷凈化能力及其細胞營養(yǎng)分析后發(fā)現(xiàn)多棘柵藻(Scenedesmus spinosus)SHOU-F8是豬場養(yǎng)殖污水凈化耦合微藻生物柴油生產(chǎn)的合適藻株.上述研究表明，微藻對污水氮磷的凈化效果受藻種、培養(yǎng)條件及污水中氮磷的形態(tài)與濃度等因素影響.
利用微藻凈化豬場養(yǎng)殖污水的研究已見較多報道，但利用微藻凈化豬場養(yǎng)殖污水中的氮磷并耦合微藻高附加值產(chǎn)品生產(chǎn)的研究較少.狹形小樁藻(Characium angustum)是一種淡水綠藻，屬于綠球藻目(Chlorococcales)，小樁藻科(Characiaceae)，小樁藻屬(Characium)，廣泛分布于包括污水在內(nèi)的多種類型的水體中，但目前對這種微藻尚未見有應(yīng)用研究.本文在實驗室條件下研究了狹形小樁藻對豬場養(yǎng)殖污水的凈化效果及其細胞營養(yǎng)組成特點，以期為狹形小樁藻后續(xù)在污水凈化中的應(yīng)用積累資料.
2 材料與方法
2.1 試驗材料
試驗用豬場養(yǎng)殖污水取自浙江嘉興余新鎮(zhèn)敦好農(nóng)牧有限公司的養(yǎng)豬場.養(yǎng)殖污水經(jīng)過沼氣池厭氧發(fā)酵及露天氧化塘沉淀處理后，用于本試驗.試驗用原污水及其經(jīng)過高壓滅菌或有效氯消毒后的水質(zhì)指標(biāo)如表 1所示.
表1 試驗用豬場養(yǎng)殖污水的水質(zhì)狀況
本試驗所用狹形小樁藻取自上海海洋大學(xué)微藻種庫，藻種分離自一生活污水排污溝，采用f/2培養(yǎng)液逐級擴培后用于本試驗.
2.2 試驗方法 2.2.1 不同接種濃度下狹形小樁藻對高壓滅菌污水的處理效果
將預(yù)先擴培的同一批次的狹形小樁藻，離心收集藻細胞，然后將收集的細胞分別接種到經(jīng)高壓滅菌的豬場養(yǎng)殖污水中.設(shè)定3個接種密度：200×104，400×104，600×104 cells · mL-1.實驗在1 L的三角燒瓶中進行，每個處理3個平行.微藻在光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，溫度27 ℃，光照1800 lx，光照周期24 h/0 h(L : D).每天定時搖瓶，隔天用血球計數(shù)板計數(shù)藻細胞密度并測定培養(yǎng)水體中氮、磷變化情況.試驗持續(xù)23 d.試驗結(jié)束時離心收集藻細胞，分析細胞蛋白含量及脂肪酸組成.
2.2.2 污水預(yù)處理方法對狹形小樁藻去除氮磷效果的影響
在不同接種濃度試驗的基礎(chǔ)上，選擇600×104 cells · mL-1的接種濃度，比較狹形小樁藻在高壓滅菌的豬場養(yǎng)殖污水及有效氯消毒(200 ppm)并中和的豬場養(yǎng)殖污水中的生長及其對氮磷去除效果.其培養(yǎng)方法及檢測處理同2.2.1節(jié).
2.3 指標(biāo)檢測
用血球計數(shù)板測定藻細胞密度，并根據(jù)公式K =(lnNt-lnN0)· t-1計算相對生長率，其中，N0為培養(yǎng)初始藻細胞密度(cells · mL-1)，Nt為培養(yǎng)t d后的藻細胞密度(cells · mL-1)，t為培養(yǎng)時間(d).
用0.45μm濾膜過濾藻液，然后參照水和廢水監(jiān)測分析方法(第4版)測定濾液中氮磷水平.總氮測定采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法;氨態(tài)氮測定采用納氏試劑分光光度法;硝態(tài)氮測定采用紫外分光光度法;總磷測定采用鉬酸銨分光光度法.
氮磷去除率r的計算公式：
其中，C0和Ct分別為初始氮磷的濃度和培養(yǎng)t d后的濃度(mg · L-1).
藻細胞蛋白含量的測定參照福林-酚測蛋白法進行;藻細胞脂肪酸含量的測定參照進行;微藻脂肪酸甲酯的理論烷基值參照的方法進行計算.
2.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析
結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用PASW.Statistics.18.0軟件進行方差分析并作Duncan多重比較，p<0.05，表示差異顯著.
3 結(jié)果
3.1 不同處理組狹形小樁藻生長狀況
不同接種濃度下狹形小樁藻的生長如圖 1所示.在23 d的培養(yǎng)期間，200×104 cells · mL-1、400×104 cells · mL-1、600×104 cells · mL-1(滅菌)和600×104 cells · mL-1(消毒)組藻的相對生長率分別為0.120、0.104、0.092和0.097.經(jīng)方差分析可知，200×104 cells · mL-1組藻細胞相對生長率顯著高于其他組(p<0.05)，藻細胞密度由初始的210×104 cells · mL-1增長到3284×104 cells · mL-1.400×104 cells · mL-1組藻細胞相對生長率顯著高于600×104 cells · mL-1，其藻細胞密度由初始的419×104 cells · mL-1增長到4649×104 cells · mL-1.然而最終細胞培養(yǎng)密度以600×104 cells · mL-1(消毒)組最高，為5828×104 cells · mL-1，顯著高于其他組;600×104 cells · mL-1(滅菌)組次之，200×104 cells · mL-1組最終細胞培養(yǎng)密度最小.
圖 1 不同處理組狹形小樁藻在豬場養(yǎng)殖污水中的生長曲線
3.2 不同處理組狹形小樁藻對豬場養(yǎng)殖污水中總氮的去除效果
由圖 2可以看出，600×104 cells · mL-1(消毒)組狹形小樁藻對豬場養(yǎng)殖污水的總氮去除率最高，為90.05%，顯著高于其他各組(p<0.05)，試驗結(jié)束時水體總氮含量為2.69 mg · L-1.400×104 cells · mL-1組和600×104 cells · mL-1(滅菌)組的總氮去除率分別為55.54%和64.32%.200×104 cells · mL-1組的去除率為41.68%，試驗結(jié)束時水體總氮含量為18.11 mg · L-1.可以看出，600×104 cells · mL-1(消毒)組狹形小樁藻對豬場養(yǎng)殖污水中的總氮去除效果最好.
圖 2 不同處理組狹形小樁藻對豬場養(yǎng)殖污水中總氮的去除效果 (注：實線表示總氮去除率，虛線表示水體中總氮含量)
3.3 不同處理組狹形小樁藻對豬場養(yǎng)殖污水中氨態(tài)氮的去除效果
由圖 3以看出，各處理組的狹形小樁藻對豬場養(yǎng)殖污水的氨態(tài)氮的去除率均很高，在96%以上.經(jīng)23 d培養(yǎng)后，各處理組污水氨態(tài)氮的含量均降低為0.40 mg · L-1左右，符合地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的Ⅱ類水標(biāo)準(zhǔn)，說明狹形小樁藻對豬場養(yǎng)殖污水中的氨態(tài)氮有較好的去除效果.從圖 3還可知，600×104 cells · mL-1(消毒)組在接種第5天，水體氨態(tài)氮就達到了最大去除率，600×104 cells · mL-1(滅菌)組在第15天達到最大去除率，400×104 cells · mL-1組在第19天達到最大去除率，而200×104 cells · mL-1組在第23天達到最大去除率.表明污水中氨態(tài)氮的去除速率與狹形小樁藻的接種密度呈正相關(guān).
圖 3 不同處理組狹形小樁藻對豬場養(yǎng)殖污水中氨態(tài)氮的去除效果 (注：實線表示氨氮去除率，虛線表示水體中氨氮含量)
3.4 不同處理組狹形小樁藻對豬場養(yǎng)殖污水中硝態(tài)氮的去除效果
600×104 cells · mL-1(消毒)組狹形小樁藻對豬場養(yǎng)殖污水硝態(tài)氮去除率最高，為98.20%，顯著高于其他3組(p<0.05)，試驗結(jié)束時水體中硝態(tài)氮的含量僅為0.31 mg · L-1.200×104 cells · mL-1組狹形小樁藻對豬場養(yǎng)殖污水中的硝態(tài)氮的處理效果最差，去除率僅為3.98%，水中硝態(tài)氮的殘留量仍然達到14.22 mg · L-1(圖 4).
圖 4 不同處理組狹形小樁藻對豬場養(yǎng)殖污水中硝態(tài)氮的去除效果 (注：實線表示硝氮去除率，虛線表示水體中硝氮含量)
3.5 不同處理組狹形小樁藻對豬場養(yǎng)殖污水中總磷的去除效果
不同處理組狹形小樁藻對豬場養(yǎng)殖污水的總磷去除率都很高，均在90%以上(圖 5).試驗結(jié)束時，400×104 cells · mL-1組、600×104 cells · mL-1(滅菌)組和600×104 cells · mL-1(消毒)組水體中總磷含量降到0.1 mg · L-1左右，符合地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的Ⅱ類水標(biāo)準(zhǔn)，200×104 cells · mL-1組總磷含量降到0.18 mg · L-1，也達到地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的Ⅲ類水標(biāo)準(zhǔn).
圖 5 不同處理組狹形小樁藻對豬場養(yǎng)殖污水中總磷的去除效果 (注：實線表示總磷去除率，虛線表示水體中總磷含量)
3.6 利用豬場養(yǎng)殖污水培養(yǎng)的狹形小樁藻藻細胞蛋白含量
利用豬場養(yǎng)殖污水培養(yǎng)的各組狹形小樁藻的細胞蛋白含量無顯著差異(p>0.05)，600×104 cells · mL-1(消毒)組藻細胞蛋白含量稍低，為30.94%(表 2).
表2 利用豬場養(yǎng)殖污水培養(yǎng)的狹形小樁藻的細胞蛋白含量(干重)
3.7 利用豬場養(yǎng)殖污水培養(yǎng)的狹形小樁藻藻細胞脂肪酸組成
由表 3可以看出，16 : 0、16 : 4n3、18 : 1n9、18 : 3n3和18 : 4n3是狹形小樁藻的主要脂肪酸，尤其是亞麻酸(18 : 3n3)含量，在25.65%~31.13%之間.各處理組狹形小樁藻藻細胞中多不飽和脂肪酸(PUFA)含量均很高，在50%以上.在相同接種密度下，與高壓滅菌組污水相比，經(jīng)有效氯消毒污水培養(yǎng)的藻細胞中飽和脂肪酸(SFA)和單不飽和脂肪酸(MUFA)含量增加，PUFA含量減少.根據(jù)其脂肪酸組成，各組狹形小樁藻脂肪酸甲酯的理論烷基值CN介于44.72~47.06之間.
表3 利用豬場養(yǎng)殖污水培養(yǎng)的狹形小樁藻藻細胞脂肪酸含量
4 討論
本研究發(fā)現(xiàn)在經(jīng)高壓滅菌的污水中，狹形小樁藻的生長性能隨著藻細胞接種密度的升高而降低，但對污水中氮磷的去除率隨藻細胞接種密度的升高而升高，接種密度為600×104 cells · mL-1時對污水中總氮總磷的去除率較兩個低接種密度組高，這與許多學(xué)者研究的高接種密度的藻細胞去除氮磷營養(yǎng)物效率較低密度組好是一致的報道利用不同接種濃度的蛋白核小球藻和柵藻對沉淀的污水和活性污水進行處理，結(jié)果表明高接種密度的微藻對污水處理效果比低接種密度的好，在3 d內(nèi)對沉淀的污水的氨氮去除率分別達到91.5%和96.5%.這為以后處理豬場養(yǎng)殖污水提高微藻接種密度來提高對污水的凈化效率提供了有力依據(jù).
3種不同接種密度的狹形小樁藻對高壓滅菌污水的氨態(tài)氮去除率都較高，說明狹形小樁藻對豬場養(yǎng)殖污水的氨態(tài)氮有較好的利用率.Ip等研究表明氨氮濃度超過50 mg · L-1會抑制藻細胞的生長，本研究中氨氮濃度14 mg · L-1左右，沒有超過這個范圍，因此可以滿足藻細胞生長.經(jīng)過狹形小樁藻的處理，3組污水中的氨態(tài)氮濃度均降低到0.5 mg · L-1以下，達到了地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的Ⅱ類標(biāo)準(zhǔn)(GB3838—2002).從對氨態(tài)氮去除的時間來看，接種密度為600×104 cells · mL-1的藻細胞在第15天就將氨態(tài)氮降低到最低水平(0.34 mg · L-1)，接種密度為400×104 cells · mL-1的藻細胞在第19天將氨態(tài)氮降低到較低水平(0.60 mg · L-1)，說明了藻細胞接種密度越大，達到最大去除率的時間越短，進而說明提高微藻接種密度可提高對污水的凈化效率.Lau等對不同接種濃度下小球藻對初級城市污水的處理結(jié)果也表明，高接種濃度能提高小球藻對污水的凈化速度.
本研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)豬場養(yǎng)殖污水中氨態(tài)氮濃度降到較低水平后，狹形小樁藻對污水中硝態(tài)氮的去除效果才有明顯提高(圖 3，圖 4).表明所用的狹形小樁藻優(yōu)先利用水體中的氨態(tài)氮，當(dāng)氨態(tài)氮耗盡或降低至一極低水平時，才開始利用水體中硝態(tài)氮，這與Przytocka等研究結(jié)果是一致的.不同接種濃度下狹形小樁藻對豬場養(yǎng)殖污水中總磷的去除率都很高，去除率均在90%以上，經(jīng)微藻處理后的養(yǎng)殖污水中總磷的水平均降低到0.2 mg · L-1以下，達到了地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的Ⅱ-Ⅲ類標(biāo)準(zhǔn)(GB3838—2002).
本研究中所用的豬場養(yǎng)殖污水采用高壓滅菌和有效氯消毒(再用硫代硫酸鈉中和)兩種預(yù)處理方式.兩種預(yù)處理方式均對污水中的氮形態(tài)和水平產(chǎn)生一定變化.與原污水相比，經(jīng)高壓滅菌污水的總氮由35.5 mg · L-1降低為31.0 mg · L-1，氨態(tài)氮濃度由17.0 mg · L-1降至14.0 mg · L-1，而硝態(tài)氮濃度由14.0 mg · L-1升至15.0 mg · L-1.說明高壓滅菌過程中污水中的部分氨態(tài)氮有逸出，另有少部分轉(zhuǎn)變成硝態(tài)氮.而經(jīng)有效氯處理后的污水，總氮由35.5 mg · L-1降低為27.1 mg · L-1，氨態(tài)氮濃度由17.0 mg · L-1大幅下降9.4 mg · L-1，硝態(tài)氮濃度由14.0 mg · L-1升至17.2 mg · L-1.說明經(jīng)過次氯酸鈉處理后污水中有較多的氨態(tài)氮逸出或轉(zhuǎn)化成了硝態(tài)氮，這與有效氯的強氧化性及高pH有關(guān).
在相同的接種濃度600×104 cells · mL-1下，有效氯消毒組狹形小樁藻的生長及其對豬場養(yǎng)殖污水的凈化效果均比高壓滅菌組好，對豬場養(yǎng)殖污水的總氮和硝態(tài)氮去除率分別為90.05%和98.19%，顯著高于高壓滅菌組.這一方面可能與高壓滅菌處理的污水中總氮及氨態(tài)氮水平較有效氯消毒處理組高有關(guān)，另一方面也與微藻生長所需的某些生理活性物質(zhì)經(jīng)高壓滅菌后遭到破壞有關(guān).
本研究發(fā)現(xiàn)利用豬場養(yǎng)殖污水培養(yǎng)的狹形小樁藻的蛋白含量與接種密度無顯著相關(guān)性，表明試驗條件下接種密度不影響?zhàn)B殖狹形小樁藻的蛋白含量，各處理組藻細胞蛋白含量均在30%以上，達到蛋白源飼料標(biāo)準(zhǔn).由狹形小樁藻的脂肪酸組成分析可知，其藻細胞中含有豐富的亞麻酸(18 : 3n3)(表 3).王銘等研究表明，綠藻類的四列藻和小球藻的亞麻酸含量分別占總脂肪酸含量的19.70%和24.95%，而8種金藻門及硅藻門的種類亞麻酸含量均很低.蔣霞敏和鄭亦周研究發(fā)現(xiàn)小球藻、亞心形扁藻和鹽藻的亞麻酸含量分別占總脂肪酸含量的30.13%、25.57%和30.07%.亞麻酸是陸生動物及淡水魚類的必需脂肪酸，這是因為淡水魚類缺乏將油酸(18 : 1n9)轉(zhuǎn)化為亞麻酸所必須的Δ15 去飽和酶.淡水魚飼料中缺乏亞麻酸，將會降低其生長速度及抗感染脅迫的能力.由于狹形小樁藻細胞中含有豐富的PUFA，導(dǎo)致其脂肪酸甲酯的理論烷基值都較低.根據(jù)美國生物柴油標(biāo)準(zhǔn)，生物柴油烷基值最低不得低于47.因此，利用豬場養(yǎng)殖污水培養(yǎng)的狹形小樁藻不適合作為微藻生物柴油的原料，但可以作為水產(chǎn)動物的飼料蛋白源或飼料添加劑.具體參見污水寶商城資料或http://www.dongaorq.cn更多相關(guān)技術(shù)文檔。
5 結(jié)論
狹形小樁藻能在豬場養(yǎng)殖污水中生長，高的接種密度有利于對污水中氮磷的凈化，且狹形小樁藻優(yōu)先利用豬場養(yǎng)殖污水中的氨態(tài)氮后利用硝態(tài)氮.因此，可利用狹形小樁藻凈化豬場養(yǎng)殖污水并耦合生產(chǎn)富含亞麻酸等n-3系列多不飽和脂肪酸(n-3PUFA)的飼料添加劑或飼料蛋白源.
