厭氧污泥是多種厭氧微生物形成的復雜聚集體，不同處理工藝內(nèi)污泥中微生物群落的研究成為廢水處理反應(yīng)器的研究熱點. 反應(yīng)器內(nèi)微生物的群落結(jié)構(gòu)的變化及生態(tài)演替受生態(tài)因子如溫度[1, 2]、 pH[2]、 氧化還原電位[3]、 反應(yīng)器進水成分[4]、 進水碳硫比[5,6]等的影響; 同時，微生物種群的分布[10]、 不同微生物種群之間存在的協(xié)同[11]和競爭制約[12]生態(tài)學效應(yīng)等，直接影響著反應(yīng)器的處理效果.
厭氧污泥的馴化是UASB 等厭氧反應(yīng)器運行的關(guān)鍵，對厭氧污泥馴化過程中微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)的變化及群落演替的研究具有重要的意義. 近年來不依賴純培養(yǎng)的分子生物學的方法發(fā)展迅速，也得到廣泛的應(yīng)用[13]，其中利用PCR-DGGE來研究未培養(yǎng)或不能培養(yǎng)的微生物，能夠提供群落中優(yōu)勢種類信息和同時分析多個樣品，適合于監(jiān)測或調(diào)查種群的時空變化，自從1993年被Muyzer等[14]引入微生物生態(tài)學研究以來，已廣泛應(yīng)用于分析活性污泥[15]、 生物濾池[16]、 生物膜[17]、 土壤[18]、 底泥[19]、 水體[20]等各種環(huán)境中生物多樣性、 種群演替等方面. 本研究采用變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技術(shù)，通過不依賴分離培養(yǎng)的核酸信息對處理高濃度硫酸鹽有機廢水UASB反應(yīng)器污泥馴化過程中微生物群落的變化進行了分析，以期為工藝優(yōu)化和揭示厭氧污泥中硫酸鹽生物處理機制提供科學依據(jù).
1 材料與方法
1.1 硫酸鹽還原反應(yīng)器污泥的馴化
采用UASB為硫酸鹽還原反應(yīng)器，容積為19.4 L. 接種污泥來源于某污水處理廠ABR的厭氧污泥和河涌底泥的混合污泥，以人工配水進行污泥馴化. 配水成分包含葡萄糖5 g ·L-1，酵母抽提物0.2 g ·L-1，Na2SO4 1.7 g ·L-1，MgSO4 0.03 g ·L-1，CaCl2 0.01 g ·L-1，KH2PO4 0.25 g ·L-1，NH4Cl 0.1 g ·L-1，NaHCO3 2 g ·L-1，(NH4)2CO3 0.1 g ·L-1，進水pH約為7.0.
反應(yīng)器污泥馴化采用固定進水濃度，逐漸縮短水力停留時間的方法以提高反應(yīng)器硫酸鹽負荷. 整個馴化過程歷時240 d，按水力停留時間的不同分為4個馴化階段，其中第0~150 d為第1階段，水力停留時間為80 h; 第150~180 d為第2階段，水力停留時間為60 h; 第180~210 d為第3階段，水力停留時間為48 h; 第210~240 d為第4階段，水力停留時間為24 h.
1.2 采樣
本研究共采集污泥樣品7個，自反應(yīng)器污泥馴化的4個不同階段，分別于馴化開始的第30、 60、 120、 150、 180、 210和240 d采用滅菌的離心管采集污泥樣品，樣品依次標記為A、 B、 C、 D、 E、 F和G. 所采集的樣品直接用于基因組DNA的提取或凍存-80℃冰箱中待用，并測定MLVSS. 此外，定期采集反應(yīng)器進出水水樣，測定其中COD和硫酸鹽含量的變化.
1.3 理化分析方法
MLVSS、 COD、 硫酸鹽采用文獻[21]的方法進行測定.
1.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析微生物群落變化 1.4.1 細菌基因組總DNA的提取與純化
取5 g污泥樣品，采用Zhou等[22]的方法進行總DNA提取. 所得DNA初提液采用天根公司的DNA純化試劑盒進行純化.
1.4.2 PCR擴增及變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析
以純化后的細菌基因組總DNA為模板，采用細菌通用引物27F與1492R擴增以得到全長16S rDNA; 再以該擴增產(chǎn)物為模板，采用對大多數(shù)細菌和古生菌的16S rDNA基因V3區(qū)具有特異性的引物對GC-341F和534R[23]進行擴增.
PCR反應(yīng)在MyCycler (Bio-Rad)上進行，50 μL反應(yīng)體系為50 ng的模板、 20 pmol正反向引物、 200 μmol ·L-1 dNTP、 5 μL的10×PCR buffer (不含MgCl2)、 1.5 mmol ·L-1的MgCl2、 1 U的ExTaq DNA聚合酶和適量的雙蒸水. 反應(yīng)程序: 94℃ 4 min; 94℃ 45 s，55℃ 1 min，72℃ 45 s，30次循環(huán); 72℃ 10 min.
采用D-code基因突變檢測系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories Inc.USA)對 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物進行DGGE分離. 采用8%聚丙烯酰胺凝膠，變性劑范圍為35%~55%(100%的變性劑定義為7 mol ·L-1尿素和40%去離子甲酰胺)，在1×TAE(40 mmol ·L-1 Tris，20 mmol ·L-1乙酸，1 mmol ·L-1 EDTA，pH 7.4)中，60℃、150 V電泳6 h，用Goldenview染液染色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照.
采用Quantity One軟件對DGGE圖譜進行分析，對各泳道的條帶數(shù)目、 位置及亮度，不同樣品間細菌群落相似度用Dice系數(shù)計算，生成相似度矩陣.根據(jù)圖譜中不同條帶的光密度值,采用公式(1)和(2)計算微生物群落的Shannon-Wiener指數(shù).
式中，ai為泳道中i條帶的光密度值，pi為i條帶光密度值占該泳道中所有條帶總光密度值的百分數(shù)，H為微生物群落的Shannon-Wiener指數(shù).
采用SPSS軟件對馴化污泥化過程中反應(yīng)器COD及硫酸鹽去除效率、 微生物群落Shannon-Wiener指數(shù)等參數(shù)的變化進行相關(guān)性分析，選擇Pearson相關(guān)分析選項，軟件自動完成.
1.4.3 切膠測序及系統(tǒng)發(fā)育分析
對DGGE圖譜上的優(yōu)勢條帶進行切膠回收，以V3區(qū)引物(不帶GC夾)采用相同程序進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后采用PGM-T載體克隆至E.coli Top10后送交上海生物工程技術(shù)公司測序. 將測序結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫Blast搜索出相似性高的序列，利用Clustal X軟件進行多序列比對，通過Mega 5構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.
2 結(jié)果與討論
2.1 微生物群落多樣性及反應(yīng)器處理效率變化
為考察厭氧污泥馴化過程中群落多樣性的變化情況，采集反應(yīng)器馴化不同時期的污泥樣品，對其進行微生物總DNA提取，并采用試劑盒對DNA初提液進行純化，并以此為模板，采用巢式擴增，先用引物對27F/1492R 擴增得到污泥中微生物全長16S rDNA，再以此為模板，采用引物對341/534擴增得到微生物16S rDNA V3可變區(qū)基因，通過變性梯度凝膠電泳(DGGE)進行分析，不同泳道分別代表反應(yīng)器馴化不同天數(shù)時所取反應(yīng)器泥樣. 污泥馴化不同時期微生物群落變性梯度凝膠電泳圖譜分析如圖 1所示. 結(jié)果表明，重復電泳的結(jié)果非常相似，重復間的相似性達99%，7個不同時期的污泥樣品中微生物群落電泳圖譜中條帶的位置和數(shù)量不同，電泳條帶呈現(xiàn)較明顯的變化,顯示反應(yīng)器污泥馴化的不同時期，隨著反應(yīng)器的污泥馴化，污泥樣品DGGE電泳圖譜中條帶數(shù)量增多，微生物群落結(jié)構(gòu)和種群數(shù)量存在明顯的演替過程. 既有一些相同的微生物種群，如條帶1、 4、 7、 8、 9等，雖然亮度有所變化，但存在于整個馴化過程中; 也有一些種群(條帶)逐漸消亡或者減弱的,而一些種群(條帶)逐級出現(xiàn)或增強; 也有一些樣品各自獨有的種群，如第150 d樣品的條帶3; 另外還有相鄰階段共有的條帶，如第180 d和第210 d樣品的條帶13.
圖 1 污泥馴化不同階段的變性梯度凝膠電泳(DGGE)圖譜
采用凝膠分析軟件Quantity One 對反應(yīng)器馴化不同時期污泥樣品電泳圖譜相似度進行分析，分析結(jié)果見表 1. 結(jié)果顯示，反應(yīng)器馴化相鄰階段時期，污泥中微生物群落相似度均在30%以上，其中樣品D與樣品E，以及樣品F與樣品G之間相似度均為57%左右，表明反應(yīng)器馴化的第150~180 d、 第210~240 d這2個階段污泥中微生物群落變化較小. 而從不同時期反應(yīng)器處理效率(圖 2)可知，恰好這2個階段是反應(yīng)器硫酸鹽處理效率高效和穩(wěn)定的時期，去除率達90%~99%.
表 1 反應(yīng)器馴化不同時期污泥樣品DGGE圖譜相似度
為了解馴化過程中反應(yīng)器處理效率與污泥中微生物群落多樣性指數(shù)變化的關(guān)系，采用SPSS軟件，對反應(yīng)器馴化時間、 COD與硫酸鹽負荷及其去除效果、 污泥濃度、 污泥中微生物群落多樣性指數(shù)進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表 2.
結(jié)合圖 2和表 2來分析，可見反應(yīng)器硫酸鹽及COD去除率與馴化時間、污泥濃度、污泥中微生物群落多樣性指數(shù)呈明顯的正相關(guān). 王愛杰等[24]在產(chǎn)酸脫硫反應(yīng)器研究中發(fā)現(xiàn)，在不同的群落演替階段,每個種群的代謝活性有一定差別,表現(xiàn)為COD 去除率、 SO2-4去除率的差異. 而本研究中隨著污泥馴化的進行，微生物群落生物多樣性得以提高，當微生物群落Shannon指數(shù)大于3.45、 污泥濃度大于40 g ·L-1時，硫酸鹽去除率穩(wěn)定在95%左右，這說明反應(yīng)器污泥馴化成熟，處理系統(tǒng)中各菌群處于良好的協(xié)同狀態(tài).
圖 2 污泥馴化不同時期反應(yīng)器處理效率及微生物群落多樣性變化的關(guān)系
表 2 各參數(shù)相關(guān)性分析 1)
2.2 污泥中微生物系統(tǒng)發(fā)育分析
為了進一步分析微生物群落結(jié)構(gòu)中的優(yōu)勢菌株和污泥中微生物的系統(tǒng)發(fā)育,對電泳圖譜中較亮條帶進行切割回收后，采用T載體克隆并測序進行系統(tǒng)發(fā)育分析見圖 3.
圖 3 基于DGGE條帶16S rDNA序列的不同泥樣細菌系統(tǒng)發(fā)育樹
結(jié)合圖 1和圖 3可知，反應(yīng)器污泥中微生物群落中主要包含4大類群，其中Firmicutes占總數(shù)的50.0%,Proteobacteria占總數(shù)的28.6%，Deinococcus-Thermus占總數(shù)的14.3%,Chloroflexi占總數(shù)的7.1%.
污泥馴化過程中出現(xiàn)大量屬于Firmicutes的發(fā)酵產(chǎn)酸菌，如條帶1、4、7、8、9、10、14. 發(fā)酵產(chǎn)酸細菌能夠?qū)⒋蠓肿拥牡孜?如蔗糖、 葡萄糖和果糖等)轉(zhuǎn)化為乙酸、乙醇、氫氣、甲醇和甲酸等易被SRB利用的物質(zhì);在為SRB提供底物,緩沖堿度變化,維持系統(tǒng)適合的代謝環(huán)境等方面起著決定作用[24]. 本研究中的Firmicutes細菌均屬于梭菌屬Clostridium sp.，其中大部分菌群如條帶1、4、7、8、9所代表的菌群在反應(yīng)器馴化的4個階段中均可監(jiān)測到，為微生物群落中的優(yōu)勢菌屬. Clostridium嚴格厭氧，能夠產(chǎn)NH3H2S、H2,具有固氮、 發(fā)酵糖類產(chǎn)乙酸乳酸等功能[25]. Kaksonen等[26]在硫酸鹽還原反應(yīng)器中曾分離得到Clostridium 菌株. 此外，任南琪等[27]在硫酸鹽還原反應(yīng)器中也監(jiān)測到Clostridium 的某些菌種隨硫酸鹽去除率的升高得以富集，在反應(yīng)器中占優(yōu)勢. 有研究表明，隨著不同種類的Clostridium屬細菌的出現(xiàn)，其代謝產(chǎn)生大量發(fā)酵終產(chǎn)物作為硫酸鹽還原過程的作用底物，從而影響硫酸鹽還原菌群的豐度變化[28]，由此造成硫酸鹽還原菌群與Clostridia菌群呈平行的動態(tài)變化[29]. 本研究中Clostridium細菌在所監(jiān)測的微生物群落中所占百分數(shù)為50.0%，并且隨著反應(yīng)器硫酸鹽負荷的提高，屬于該屬的某些種類細菌相繼出現(xiàn)或消亡，由此推測該屬菌群在本反應(yīng)器的硫酸鹽還原過程中起著重要的作用.
Chloroflexi 、Geobacter、Geopsychrobacter是廢水厭氧處理系統(tǒng)中的常見菌[30]，在本研究的污泥中也存在. 條帶3包含的序列屬于Chloroflexi，在反應(yīng)器污泥馴化過程中(第150 d)曾成為優(yōu)勢菌群，但后來隨著反應(yīng)器污泥的進一步馴化而消失. 顆粒污泥中經(jīng)常監(jiān)測到Chloroflexi 細菌，Roest 等[31]認為污泥中的Chloroflexi細菌可能直接或間接參與丁酸鹽的降解. 條帶5包含的序列屬于變形菌門中的Geobacter sp.，自反應(yīng)器馴化的第30 d后開始成為反應(yīng)器中的優(yōu)勢菌群之一，馴化至第150 d后，條帶亮度增強. Geobacter為厭氧菌，能夠氧化有機物為CO2，以鐵氧化物作為電子受體，被用于去除廢水中有機及金屬污染物[32]. 近年來在環(huán)境修復的研究中也發(fā)現(xiàn)該類菌的存在[33]. 條帶12、 13包含的序列屬于Geopsychrobacter sp.,其中，條帶12在第60 d條亮度最強，在馴化的污泥過程中亮度減弱或消失，條帶13在污泥馴化的第150~210 d內(nèi)占優(yōu)勢，該屬的某些細菌具有還原元素硫及Mn(Ⅳ),并氧化乙酸鹽、 琥珀酸鹽、 丙酸鹽的功能[34].
本研究在污泥馴化的第1及第2階段(第0~180 d)硫酸鹽還原菌屬均未占優(yōu)勢，但在馴化的最后2個階段(第210～240 d)監(jiān)測到Desulfovibrio sp. (條帶11)占優(yōu)勢. Desulfovibrio sp.是革蘭氏陰性菌，為快速生長的硫酸鹽還原菌，能夠部分氧化某些有機物為乙酸鹽和CO2 [35]，并利用氫為能源，以H+為電子受體，還原硫酸鹽為硫化物[36]. 本研究中僅監(jiān)測到這一類硫酸鹽還原菌群，是由于人工配水馴化，底物單一的原因. 此外，Desulfovibrio占優(yōu)勢的2個階段，反應(yīng)器硫酸鹽去除效率最高，為95%以上，可見Desulfovibrio 的數(shù)量與硫酸鹽去除率間存在明顯的正相關(guān)，因此該菌屬的數(shù)量與活性是影響反應(yīng)器硫酸鹽去除效率的重要因素. 這些結(jié)果與任南琪等[27]的研究結(jié)果一致.
此外，條帶2、 6所包含的序列屬于異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)，它們在微生物生態(tài)系統(tǒng)中所起的作用尚不明確，還有待進一步探索.具體參見污水寶商城資料或http://www.dongaorq.cn更多相關(guān)技術(shù)文檔。
3 結(jié)論
(1) 反應(yīng)器污泥馴化過程中，微生物群落生物多樣性與反應(yīng)器硫酸鹽及COD去除率呈明顯的正相關(guān)關(guān)系. 當微生物群落Shannon指數(shù)大于3.45、 污泥濃度大于40 g ·L-1時，硫酸鹽去除率穩(wěn)定在95%左右，處理系統(tǒng)中各菌群處于良好的協(xié)同狀態(tài).
(2)反應(yīng)器污泥中微生物群落主要包含F(xiàn)irmicutes、 Proteobacteria、Deinococcus-Thermus、Chloroflexi 4大類群,分別占總數(shù)的50.0%、28.6%、 14.3%和7.1%. 隨著反應(yīng)器污泥的馴化，污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)和種群數(shù)量存在明顯的演替過程. 其中厭氧發(fā)酵細菌Clostridium sp.在馴化全過程中均占優(yōu)勢，但優(yōu)勢菌群的種類發(fā)生變化; 厭氧細菌Chloroflexi sp.在反應(yīng)器馴化污泥第150 d曾成為優(yōu)勢菌群，但后來隨著反應(yīng)器污泥的進一步馴化而消失; 厭氧細菌Geobacter sp. 自反應(yīng)器馴化的第30 d后開始成為反應(yīng)器中的優(yōu)勢菌群之一，馴化至第150 d后，成為優(yōu)勢菌群; 厭氧細菌Geopsychrobacter sp.在污泥馴化過程中相繼出現(xiàn)或消亡; Desulfovibrio sp.在污泥馴化的最后2個階段占優(yōu)勢.
