城市污水管網(wǎng)是一個(gè)收集、 運(yùn)輸城市污水的系統(tǒng)，是城市水利基建的重要組成部分[1]. 然而，污水在管網(wǎng)內(nèi)的運(yùn)輸過(guò)程中水質(zhì)發(fā)生了變化，生化需氧量(BOD)、 化學(xué)需氧量(COD)會(huì)有不同程度的變化[2~6]，溶解性有機(jī)碳(DOC)也存在著降低的現(xiàn)象[7~9]. 同時(shí)，在污水運(yùn)輸過(guò)程中，還發(fā)現(xiàn)管網(wǎng)的管壁上有生物膜的形成[10~12]，由此人們開(kāi)始關(guān)注污水管網(wǎng)中微生物對(duì)水質(zhì)的改變作用.

　　在城市污水管網(wǎng)中，由于污水中含有揮發(fā)性脂肪酸(VFA)等物質(zhì)，為產(chǎn)甲烷過(guò)程提供了物質(zhì)基礎(chǔ)[13~15]. 先前研究發(fā)現(xiàn)，在管網(wǎng)中，確實(shí)有CH4的產(chǎn)生[16~18]. 管網(wǎng)中CH4的產(chǎn)生對(duì)管網(wǎng)的運(yùn)行管理和污水處理帶來(lái)極大的隱患. CH4是一種溫室氣體，管網(wǎng)中的CH4排放到空氣當(dāng)中會(huì)加劇溫室效應(yīng)[19, 20]; 當(dāng)管網(wǎng)內(nèi)CH4濃度超過(guò)5%時(shí)有爆炸的危險(xiǎn)[21, 22]; 管網(wǎng)內(nèi)CH4的產(chǎn)生會(huì)帶走一部分COD，這不利于后續(xù)污水處理廠的生物脫氮除磷的過(guò)程[23, 24]，因此管網(wǎng)中CH4的產(chǎn)生是值得關(guān)注的問(wèn)題. CH4的產(chǎn)生與管網(wǎng)中的產(chǎn)甲烷菌有關(guān)，因此研究管網(wǎng)中的產(chǎn)甲烷菌也具有重要意義. 然而，目前對(duì)管網(wǎng)內(nèi)產(chǎn)甲烷菌的演替規(guī)律了解甚少.

　　基于此，本文通過(guò)建立一套1 200 m管道系統(tǒng)，對(duì)污水管網(wǎng)內(nèi)CH4沿程變化及產(chǎn)甲烷菌的分布特性進(jìn)行研究，并探明了產(chǎn)甲烷菌可利用基質(zhì)與產(chǎn)甲烷菌分布之間的關(guān)系.

　　1 材料與方法

　　1.1 實(shí)驗(yàn)條件和原水水質(zhì)

　　反應(yīng)器為城市污水模擬管網(wǎng)反應(yīng)器[25]，以西安市城市污水作為原水，在室溫下運(yùn)行，實(shí)驗(yàn)溫度為(25±2)℃，pH為7.2±0.3，密封性良好. 管網(wǎng)沿程的溶解氧(DO)為(0.3±0.05)mg ·L-1，沿程變化不大，總體變化趨勢(shì)為沿程降低，且由于管網(wǎng)始端和末端暴露在空氣中，溶解氧相對(duì)含量較高，溶解氧沿程變化如圖 1所示.

　　圖 1 管網(wǎng)沿程中溶解氧的變化

　　在反應(yīng)器連續(xù)運(yùn)行期間，通過(guò)控制管網(wǎng)坡度為5‰和污水充滿(mǎn)度0.6，來(lái)使污水流速為0.6m ·s-1，水力停留時(shí)間為1h. 污水依靠重力進(jìn)入模擬管段. 在反應(yīng)器連續(xù)運(yùn)行期間，原水的水質(zhì)狀況如表 1所示.

 

　　表 1 城市污水管網(wǎng)中的水質(zhì)特性

　　1.2 取樣方法

　　在800 m的管網(wǎng)系統(tǒng)中選取8個(gè)取樣點(diǎn)，其中選取原水作為0 m處的取樣點(diǎn)，然后一次在分別選取30、 100、 200、 400、 600、 800、 1 000和1 200 m處作為剩余的8個(gè)取樣點(diǎn)進(jìn)行水質(zhì)分析，分析指標(biāo)包括COD、 氨氮(NH+4-N)、 總氮(TN)、 總磷(TP)等常規(guī)指標(biāo)及發(fā)酵產(chǎn)物. 對(duì)于生物分析所需要的生物膜樣品采集，以30、 100、 200、 400、 600、 800、 1 000和1 200 m作為生物膜取樣點(diǎn). 首先將8個(gè)位置的管段兩端的活結(jié)松開(kāi)，取下管段，將管段里的有機(jī)玻璃條取出，用無(wú)菌棉簽將適量的生物膜從有機(jī)玻璃載體上刮入一次性培養(yǎng)皿中并將培養(yǎng)皿蓋好，然后立即放入裝有干冰的保溫盒并送至實(shí)驗(yàn)室-20℃保存.

　　1.3 分析方法

　　1.3.1 乙酸分析

　　水樣分析之前用3%的磷酸將水樣的pH調(diào)節(jié)到4左右，再將水樣用0.45 μm濾膜過(guò)濾. 分析儀器為GC-2014氣相色譜儀(日本島津). 氫火焰離子化檢測(cè)器，色譜柱為DB-FFAP(30 m×0.5 μm×0.32 mm). 升溫程序： 初始柱溫100℃保持2 min，以10℃ ·min-1的速度升至120℃保持2 min，再以6℃ ·min-1升至200℃保持2 min. 進(jìn)樣口溫度200℃，檢測(cè)器溫度230℃，進(jìn)樣量1 μL. N2作為載氣和補(bǔ)償氣，速率均為20mL ·min-1. H2速率為35mL ·min-1，空氣為350mL ·min-1.

　　1.3.2 甲醇分析

　　測(cè)定甲醇和乙醇的濃度選用方法為氣相色譜法，進(jìn)樣方式為頂空進(jìn)樣. 分析儀器為GC-2014氣相色譜儀(日本島津)，色譜柱為CB-5(30 m×0.5 μm×0.32 mm)，F(xiàn)ID檢測(cè)器，并配有AOC-5000頂空自動(dòng)進(jìn)樣器. 升溫程序： 50℃保持5 min，以5℃ ·min-1的速度升至100℃，保持2 min，以5℃ ·min-1的升溫速度升至200℃. 進(jìn)樣口溫度為200℃，檢測(cè)器溫度為280℃; 載氣流量為5.0mL ·min-1; 分流比2 ∶1. 頂空自動(dòng)進(jìn)樣器條件： 加熱平衡溫度為80℃，加熱平衡時(shí)間30 min; 取樣針溫度為90℃; 進(jìn)樣體積1.0 mL.

　　1.3.3 甲酸分析

　　分析儀器選用LC2010AHT液相色譜儀(日本島津)，色譜柱為Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)，紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)設(shè)置為210 nm. 流動(dòng)相為0.02mol ·L-1 KH2PO4 ∶甲醇(體積比為95 ∶5)，用磷酸調(diào)節(jié)pH到2. 流速設(shè)置為1.0mL ·min-1，柱溫30℃，進(jìn)樣體積10 μL.

　　1.3.4 甲胺分析

　　甲胺濃度采用液相色譜法進(jìn)行測(cè)定. 上機(jī)測(cè)樣之前對(duì)樣品進(jìn)行PITC衍生化處理，并用C18柱進(jìn)行固相萃取. 分析儀器選用LC2010AHT液相色譜儀(日本島津)，色譜柱為Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)，紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)設(shè)置為240 nm. 流動(dòng)相為乙腈 ∶水(體積比為30 ∶70)，流速設(shè)置為1.0mL ·min-1，柱溫30℃，進(jìn)樣體積10 μL.

　　1.3.5 CH4分析

　　CH4的測(cè)定選用氣相色譜法，分析儀器為GC-2014氣相色譜儀(日本島津). 檢測(cè)器為熱導(dǎo)檢測(cè)器(TCD)，色譜柱型號(hào)為T(mén)DX-01填充柱. 柱溫設(shè)置為100℃，保持10 min. N2作為尾氣，流速為10.0mL ·min-1. Ar作為載氣，流速為48mL ·min-1. 使用標(biāo)準(zhǔn)氣體混合氣校準(zhǔn)，其組分為37% CO2、 4% N2、 0.802% H2以及CH4.

　　1.3.6 其他水質(zhì)分析

　　實(shí)驗(yàn)中COD、 NH+4-N、 TN和TP的測(cè)定采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法.

　　1.3.7 DNA提取和PCR擴(kuò)增

　　采用Power Soil DNA提取試劑盒(MO Biomedical,U.S.)對(duì)生物膜樣本中的DNA進(jìn)行提取，提取方法按照試劑盒制造商提供的方法使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行. 對(duì)于產(chǎn)甲烷菌基因片段的擴(kuò)增，選用特異性引物MLf 5′- GGTGGTGTMGGATTCACACARTA YGCWACAGC-3′和MLr 5′- TTCATTGCRTAGTTW GGRTAGTT- 3′[26]. PCR反應(yīng)體系(20 μL)： 5×FastPfu Buffer 4 μL，dNTPs 2 μL，引物各0.8 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，加無(wú)菌水至20 μL. PCR條件： 95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物.

　　1.3.8 產(chǎn)甲烷菌454高通量測(cè)序

　　用AeyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫，并用2%瓊脂糖電泳檢測(cè). 參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合. 用Roche GS FLX Titanium emPCR試劑盒對(duì)混合物進(jìn)行emPCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的混合物按照454平臺(tái)的標(biāo)準(zhǔn)方法，在Roche 454 GS FLX+Titanium平臺(tái)上進(jìn)行上機(jī)測(cè)序.

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 管網(wǎng)系統(tǒng)中CH4氣體的產(chǎn)生

　　圖 2中展現(xiàn)了管網(wǎng)中CH4的含量的變化趨勢(shì)，結(jié)果表明CH4含量較低均在3%以下，遠(yuǎn)小于50%，所以管網(wǎng)內(nèi)甲烷化程度較低[27]. 從中可以看出，CH4在管網(wǎng)中的變化規(guī)律是沿程增加的. 在0~30 m處，沒(méi)有CH4的產(chǎn)生，這可能由于在管網(wǎng)始端，污水中溶解氧含量較高，不適合產(chǎn)甲烷菌富集生長(zhǎng)，此外污水中的有機(jī)物質(zhì)以大分子有機(jī)物為主，這些大分子有機(jī)物質(zhì)無(wú)法被產(chǎn)甲烷菌直接利用. 隨著管網(wǎng)沿程距離的不斷增加，管道內(nèi)CH4的含量也不斷升高，在1 200 m處達(dá)到最大值，其含量為2.75%. CH4含量沿程升高，這是由于管道內(nèi)的水解發(fā)酵過(guò)程使得大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為VFA(乙酸)等小分子物質(zhì)，產(chǎn)甲烷菌得以不斷利用乙酸等可利用基質(zhì)，使得CH4在管網(wǎng)中不斷產(chǎn)生并得到積累，故管網(wǎng)中的CH4含量隨之升高.

　　圖 2 管網(wǎng)沿程中CH4含量的變化

　　2.2 管網(wǎng)系統(tǒng)中產(chǎn)甲烷菌的沿程分布特性 2.2.1 管網(wǎng)系統(tǒng)中產(chǎn)甲烷菌的構(gòu)成及多樣性分布

　　表 2反映了管網(wǎng)中產(chǎn)甲烷菌的構(gòu)成及其相對(duì)豐度情況，從中可以看出，管網(wǎng)中檢測(cè)到的產(chǎn)甲烷菌共有9種，其中甲烷八疊球菌屬、 廣古菌門(mén)中的菌屬、 甲烷桿菌科中的菌屬和古菌門(mén)中的菌屬在管網(wǎng)中始終存在.

 

　　表 2 管網(wǎng)中產(chǎn)甲烷菌的構(gòu)成1)/%

　　圖 3展現(xiàn)了管網(wǎng)沿程產(chǎn)甲烷菌的多樣性變化. Shannon指數(shù)是表征物種多樣性的指標(biāo)[28]，因此在圖 3中是通過(guò)Shannon指數(shù)來(lái)反映產(chǎn)甲烷菌的多樣性變化. 由于在管網(wǎng)初始端30 m處的生物膜樣本中沒(méi)有生成有效序列，即在30 m處沒(méi)有檢測(cè)到產(chǎn)甲烷菌，故30 m處不存在產(chǎn)甲烷菌，這可以很好地解釋圖 2中30 m處沒(méi)有CH4的生成. 從中可以看出，100~600 m之間Shannon指數(shù)沿程降低，由100 m處的2.7降低至600 m處的1.58，600~800 m處的Shannon指數(shù)保持穩(wěn)定，說(shuō)明管網(wǎng)800 m之前產(chǎn)甲烷菌的多樣性沿程降低，且在600~800 m之間保持穩(wěn)定; 在管網(wǎng)1 000 m處，Shannon指數(shù)突然升高，此后一直保持穩(wěn)定，Shannon指數(shù)穩(wěn)定在2.2左右，說(shuō)明管網(wǎng)末端多樣性較為豐富且保持穩(wěn)定.

　　圖 3 產(chǎn)甲烷菌多樣性在管網(wǎng)中的沿程變化

　　2.2.2 管網(wǎng)系統(tǒng)中產(chǎn)甲烷菌菌群結(jié)構(gòu)分析

　　圖 4所示的是產(chǎn)甲烷菌的熱圖分析，是在屬水平下進(jìn)行的分析，不同的顏色代表了不同的相對(duì)豐度值，藍(lán)色相對(duì)豐度最低，紅色相對(duì)豐度最高，圖頂?shù)姆种П硎玖藰颖局�間的結(jié)構(gòu)相似性. 由于30 m沒(méi)有產(chǎn)甲烷菌，因此管網(wǎng)30 m處的樣本不參與熱圖分析. 圖 4中聚類(lèi)結(jié)果表明，管網(wǎng)100~1 200 m中的產(chǎn)甲烷菌群落結(jié)構(gòu)共分為兩大類(lèi)，其中200~800 m為一類(lèi)，100、 1 000和1 200 m為一類(lèi). 200~800 m這一類(lèi)中，600 m和800 m中的群落結(jié)構(gòu)最為相近，而在100、 1 000和1 200 m的這一類(lèi)中，以1 000 m和1 200 m的群落結(jié)構(gòu)最為相似; 在800 m和1 000 m這一相鄰位置處，群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的改變，說(shuō)明在該處存在著產(chǎn)甲烷菌的演替現(xiàn)象. 同時(shí)，根據(jù)圖中的顏色分布可以看出，在管網(wǎng)中的優(yōu)勢(shì)菌群有甲烷八疊球菌屬、 廣古菌門(mén)中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬，其中甲烷八疊球菌屬和廣古菌門(mén)中的菌屬為主要優(yōu)勢(shì)菌群.

　　圖 4 產(chǎn)甲烷菌聚類(lèi)(熱圖)分析

　　2.2.3 產(chǎn)甲烷菌的菌屬演替過(guò)程

　　優(yōu)勢(shì)菌群是一個(gè)群落中的主要構(gòu)成部分，基于1.2.2節(jié)的結(jié)果對(duì)管網(wǎng)中的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行進(jìn)一步的分析. 圖 5反映了管網(wǎng)中優(yōu)勢(shì)產(chǎn)甲烷菌相對(duì)豐度的沿程變化，結(jié)果表明，甲烷八疊球菌屬、 廣古菌門(mén)中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬，這3種產(chǎn)甲烷菌相對(duì)豐度變化規(guī)律較為明顯. 在管網(wǎng)30 m處，3種菌屬都不存在，在管網(wǎng)100~800 m范圍內(nèi)，甲烷八疊球菌屬的相對(duì)豐度在3種優(yōu)勢(shì)菌屬中最高，且隨著管網(wǎng)距離的增加相對(duì)豐度也不斷增加，與之相反，廣古菌門(mén)中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬在管網(wǎng)100~800 m的范圍內(nèi)相對(duì)豐度的沿程變化趨勢(shì)與甲烷八疊球菌屬?lài)?yán)格相反，它們的相對(duì)豐度在管網(wǎng)中沿程降低，其中甲烷桿菌科中的菌屬在600~800 m之間失去優(yōu)勢(shì)地位，相對(duì)豐度均在0.7%以下; 在管網(wǎng)1 000~1 200 m范圍內(nèi)，甲烷八疊球菌屬的相對(duì)豐度降低并保持穩(wěn)定，廣古菌門(mén)中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬相對(duì)豐度升高并保持穩(wěn)定，其中廣古菌門(mén)中的菌屬)超過(guò)甲烷八疊球菌屬成為3種菌屬中相對(duì)豐度最高的菌屬. 從圖 5中可以看出，600 m和800 m、 1 000 m和1 200 m的優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度變化不大，這與圖 4中的群落結(jié)構(gòu)分析可以很好地對(duì)應(yīng)起來(lái)，也說(shuō)明了群落中的優(yōu)勢(shì)菌屬的構(gòu)成基本反映了群落結(jié)構(gòu)的構(gòu)成情況. 同時(shí)，在800~1 000 m的過(guò)程中，3種產(chǎn)甲烷菌的相對(duì)豐度、 優(yōu)勢(shì)地位和變化趨勢(shì)都發(fā)生了改變，說(shuō)明在該管網(wǎng)范圍內(nèi)，產(chǎn)甲烷菌群中菌屬發(fā)生了演替過(guò)程，即在該處廣古菌門(mén)中的菌屬取代了甲烷八疊球菌屬成為第一優(yōu)勢(shì)菌屬.

　　圖 5 優(yōu)勢(shì)產(chǎn)甲烷菌相對(duì)豐度在管網(wǎng)中的沿程變化

　　2.3 產(chǎn)甲烷菌可利用基質(zhì)的變化規(guī)律

　　圖 6反映了產(chǎn)甲烷菌可利用基質(zhì)的變化情況. 管道中存在的產(chǎn)甲烷菌可利用基質(zhì)有甲酸、 甲醇、 甲胺、 乙酸(“三甲一乙”)和H2，其中乙酸的含量最高，而甲胺的含量極低. 由于H2是氣相產(chǎn)物且在管網(wǎng)中的含量很低，本文對(duì)H2不做過(guò)多論述. “三甲一乙”這4種基質(zhì)在管網(wǎng)中的變化規(guī)律基本一致，均呈現(xiàn)出先增加后降低的變化趨勢(shì).

　　圖 6 管網(wǎng)中產(chǎn)甲烷菌可以用基質(zhì)的沿程變化

　　乙酸在整個(gè)管網(wǎng)中含量最高，在管網(wǎng)0~600 m沿程增加并在600 m處達(dá)到最大值8.67mg ·L-1，并在600~800 m處保持穩(wěn)定，而后開(kāi)始沿程逐漸下降; 甲酸在管網(wǎng)0~400 m沿程增加并在400 m處達(dá)到最大值3.64mg ·L-1，而后開(kāi)始沿程降低; 甲醇在30 m處達(dá)到最大值2.17mg ·L-1后開(kāi)始沿程降低; 而甲胺在整個(gè)管網(wǎng)中的含量之中保持在很低的水平且濃度不超過(guò)0.015mg ·L-1，在800 m處含量最高0.011mg ·L-1. 這4種基質(zhì)在管網(wǎng)中均存在含量降低的現(xiàn)象，說(shuō)明這4種基質(zhì)在管網(wǎng)中都被產(chǎn)甲烷菌利用生成CH4. 在管網(wǎng)中，乙酸是含量最高的產(chǎn)甲烷可利用基質(zhì)，即產(chǎn)甲烷菌可以利用的乙酸多，且根據(jù)厭氧三階段理論，在發(fā)酵產(chǎn)甲烷過(guò)程中72%的CH4主要來(lái)自于乙酸[29]，說(shuō)明在管網(wǎng)中產(chǎn)甲烷菌主要利用乙酸. 管網(wǎng)中0~800 m處甲烷八疊球菌屬相對(duì)豐度最高，主要利用乙酸生成CH4[30, 31]，甲烷八疊球菌屬的相對(duì)豐度在該范圍內(nèi)沿程增加，這很好地解釋了在0~800 m乙酸含量的變化情況，且600~800 m乙酸含量保持穩(wěn)定，而甲烷八疊球菌屬的相對(duì)豐度也保持穩(wěn)定; 管網(wǎng)800 m處以后，乙酸含量下降，且微生物代謝過(guò)程中使得某些中間產(chǎn)物富集，這對(duì)甲烷八疊球菌屬而言，環(huán)境開(kāi)始變得惡劣，這就使得其在該環(huán)境下處于不利的地位，競(jìng)爭(zhēng)能力下降，從而相對(duì)豐度下降，廣古菌門(mén)中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬在該環(huán)境下競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)增強(qiáng)，相對(duì)豐度增加. 具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.dongaorq.cn更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　3 結(jié)論

　　(1)城市污水管網(wǎng)中生成CH4的量較低，管網(wǎng)中甲烷化程度較低. 在管網(wǎng)初始端沒(méi)有CH4的產(chǎn)生，而后隨著管網(wǎng)距離的增加，CH4在管網(wǎng)中呈現(xiàn)出了逐漸增加的變化趨勢(shì).

　　(2)城市污水管網(wǎng)中產(chǎn)甲烷菌主要包含，甲烷八疊球菌屬、 廣古菌門(mén)中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬這3種. 產(chǎn)甲烷菌的群落結(jié)構(gòu)在800~1 000 m發(fā)生了明顯的改變，在管網(wǎng)該范圍內(nèi)發(fā)生了廣古菌門(mén)中的菌屬取代甲烷八疊球菌屬成為第一優(yōu)勢(shì)菌屬的演替過(guò)程.

　　(3)城市污水管網(wǎng)中產(chǎn)甲烷菌可利用基質(zhì)“三甲一乙”中乙酸含量最高，甲胺含量始終維持在極低的水平. 這些物質(zhì)在管網(wǎng)中均呈現(xiàn)出了先增加后降低的變化趨勢(shì)，其中乙酸在600~800 m含量維持穩(wěn)定. 由于不同產(chǎn)甲烷菌屬適應(yīng)的物質(zhì)條件和環(huán)境條件不同，因此這些物質(zhì)條件和環(huán)境條件的改變，使得產(chǎn)甲烷菌在管網(wǎng)中的分布發(fā)生了改變.（來(lái)源及作者：西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院 孫光溪 金鵬康 宋吉娜 王先寶 楊柯瑤）