近些年來, 隨著納米材料的產量及應用范圍的日益擴大, 納米顆粒進入環境后對人類健康及生態系統具有的潛在風險也備受關注.這其中, 納米TiO2作為產量最大的納米材料之一, 因其獨特的物化特性, 在化妝品制造、半導體工業及水處理行業中都有廣泛地應用.因而也有越來越多的學者著手研究納米TiO2的生物危害. Simonin等發現納米TiO2能顯著影響硝化菌及反硝化古菌的活性及豐度, 而亞硝酸鹽氧化菌的活性則基本不受納米TiO2投加量的影響. Leung等在比較納米TiO2和納米ZnO對E. coli的毒性作用時發現納米TiO2對E. coli的毒性更強, 并認為這主要是由于納米TiO2能顯著抑制細胞膜上與清除超氧自由基(ROS)相關的抗氧化蛋白酶的正調控. Liu等則發現納米TiO2能破壞小球藻的光合膜結構, 進而導致藻細胞凋亡. Gu等在評估人臍靜脈內皮細胞在對納米TiO2暴露的響應時發現納米TiO2并不會導致內質網應激現象, 即納米TiO2產生的ROS對人體細胞的氧化還原平衡尚不能造成顯著危害.上述結論盡管對納米TiO2對生物體是否具有抑制作用尚不能達成一致, 但足以說明不同生物體對納米TiO2的暴露具有不同的響應.

　　作為納米顆粒進入天然環境的最后“屏障”, 已有納米TiO2在污水處理系統中檢出的報道, 這些納米顆粒95%以上都會被活性污泥吸附并截留, 這將導致活性污泥中的Ti含量可能要比進入高幾個數量級.因此, 研究納米TiO2對各活性污泥處理工藝中的微生物的影響是十分必要的.鑒于納米TiO2在日化行業的大量使用, 研究適于處理日化工業廢水的厭氧顆粒污泥處理工藝對納米TiO2暴露的響應尤為迫切.特別是在納米TiO2持續暴露下產甲烷菌群與其它功能菌群關系的變化, 將有助于深入認識納米顆粒對厭氧處理系統的影響, 并對納米顆粒污染物的排放控制具有重要意義.然而, 目前現有研究多關注于短期暴露下納米TiO2對厭氧微生物的影響, 缺乏開展長期暴露的響應研究.

　　因此, 本研究通過比較納米TiO2急性及長期持續暴露下對厭氧顆粒污泥體系影響的異同, 具體分析了納米TiO2對厭氧反應器運行穩定性的累積效應及其在反應器內的歸趨, 結合厭氧顆粒污泥微生物種群結構的變化, 以揭示納米TiO2對厭氧顆粒污泥微生物的抑制機制, 以期為應對厭氧污水處理體系中納米TiO2的生態風險提供理論支持和參考依據.

　　1 材料與方法 1.1 厭氧顆粒污泥及納米TiO2的特性

　　試驗所用厭氧顆粒污泥來自于處理大豆蛋白廢水的EGSB反應器, 并在小試ASBR反應器中采用模擬廢水馴化一個月, 此時污泥最大比產甲烷活性為(1.08±0.03)g·(g·d)-1.經分析污泥中Ti的背景值(以VSS計, 下同)為(1.7±0.3)mg·g-1.

　　其中, 模擬廢水中的主要成分有：葡萄糖(7 000 mg·L-1)、碳源及磷源(500 mg·L-1NH4Cl、26 mg·L-1 K2HPO4·3H2O、酵母浸粉及胰蛋白胨各0.25 mg·L-1)、pH緩沖劑以及參考文獻礦物質培養基配置的微量元素液.

　　納米TiO2購自Sigma-Aldrich公司, 純度>99.5%, 平均粒徑為25 nm, 并用超純水制備2 g·L-1的納米TiO2貯備液, 在4℃下儲存.對儲備液中納米TiO2形貌的觀察結果如圖 1所示.可見, 納米TiO2顆粒以團聚體形式存在, 其尺寸約為(19.2±9.5)nm, 與MSDS描述基本一致.

圖 1 TEM下納米TiO2形貌圖

　　1.2 短期暴露試驗

　　考慮到目前納米TiO2在環境中的累積量及其持續擴大的使用范圍必將導致更多的納米TiO2向環境中釋放[8], 短期暴露試驗選用了5、30、150 mg·g-1這3種劑量來研究短期暴露下納米TiO2對厭氧顆粒污泥各代謝階段的影響.納米TiO2對產酸階段和產甲烷階段的影響分別用末端發酵產物(VFAs)濃度及總產烷量占對照組相同參數的相對百分含量來確定.產酸階段影響試驗以葡萄糖(2 000 mg·L-1)為碳源, 同時加入30 μL BES抑制產甲烷菌活性.分別將馴化好的顆粒污泥(2 g·L-1)、培養液及一定量的納米TiO2儲備液共40 mL加入150 mL血清瓶后, 氮氣吹脫5 min后用膠塞密封, 置于35℃±1℃的恒溫搖床(110 r·min-1避光培養, 2 d后測定各血清瓶中VFAs的濃度.產甲烷階段影響試驗與產酸階段影響試驗的過程基本相同, 但以乙酸鈉(2 000 mg·L-1)為碳源且不加入BES, 8 d內固定時間間隔測定甲烷產量.累計產烷量試驗與產甲烷階段影響試驗的過程基本相同但采用葡萄糖(2 000 mg·L-1)為碳源.

　　1.3 長期暴露試驗

　　長期暴露試驗在兩個完全相同、有效容積為2.5 L的ASBR反應器(R1和R2)內進行.進水成分同上文模擬廢水, 反應器水力停留時間為48 h.每24 h運行一個周期, 具體運行參數如下：進水10 min、沉降15 min、排水10 min, 其余為厭氧消化反應時間.加入納米TiO2前, R1和R2先運行足夠長時間直至兩者出水參數差距在10%以下, 此時, 兩反應器內的污泥濃度約為6 g·L-1.隨后, 由蠕動泵隨進水向R2反應器內打入納米TiO2溶液(5 mg·L-1), R1則作為對照.長期暴露試驗共進行90 d.

　　通過每日測定pH值、VFAs的含量和成分、生物氣產量和成分、出水中納米TiO2及Ti4+的濃度來監測反應器運行效果.

　　1.4 熒光原位雜交(FISH)

　　本研究采用4種寡核苷酸熒光探針對厭氧顆粒污泥中特定的微生物種群進行定量分析, 探針信息見表 1.樣品的預處理則參考了文獻[14, 15]的方法.

　　表 1 FISH中用到的熒光探針

　　為確定上述微生物的相對豐度, 將樣品繼續進行DAPI染色.在FV10i激光共聚焦顯微鏡下進行觀察, 將雜交呈陽性的細胞與同視野下總活細胞數的比值定為該類微生物的相對豐度.

　　1.5 其它分析方法

　　COD、SS、VSS及pH等的測定都采用標準方法.生物氣及VFAs的含量及成分采用氣相色譜法測定.出水及污泥經預處理后[7], 其中的Ti元素采用電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP-OES)測定.

　　長期暴露試驗結束后, 從R1及R2反應器底部隨機采集10批厭氧顆粒污泥樣品, 參照Alphenaar等[18]的方法對污泥進行預處理后, 在掃描電鏡(SEM)下觀察污泥對納米TiO2的吸附及污泥形貌的變化, 并利用X射線能譜儀(EDX)對樣品進行元素成分分析.

　　2 結果與討論 2.1 納米TiO2對厭氧顆粒污泥產甲烷過程的短期影響

　　簡單底物的厭氧消化主要經過產酸階段和產甲烷階段兩個過程, 因此, 本文首先分別研究了在不同劑量納米TiO2的短期暴露下, 厭氧產酸階段VFAs及產甲烷階段總產烷量的影響, 結果見圖 2.從中可見, 即使納米TiO2的劑量達到150 mg·g-1, 各VFAs產量及產烷量都與對照組沒有明顯差別(P>0.05), 說明高劑量納米TiO2的短期暴露對厭氧顆粒污泥中微生物的代謝不會產生顯著抑制. Gonzalez-Estrella等的試驗結果也同樣證實了高達1500 mg·L-1的納米TiO2的短期暴露對厭氧消化過程不會產生抑制作用.這一現象可能緣于兩方面的原因：首先, 厭氧顆粒污泥對各種化學物質的沖擊負荷都具有非常好的抵抗能力, 它致密的結構和良好的沉降性能可大大減少包裹在胞外聚合物(EPS)內部的產酸菌及產甲烷菌與進水中化學物質的接觸幾率; 此外, 納米TiO2的急性毒性一般被認為主要來自于其在氧氣及光照存在時所釋放的ROS, ROS能擾亂生物細胞內的新陳代謝, 損傷細胞抗氧化功能進而破壞胞內脂類、蛋白質、多糖及DNA等物質; 而本試驗均是在無氧的暗環境下進行的, 極大限制了ROS的產量, 這也是納米TiO2對厭氧消化過程具有低急性毒性更重要的原因.而上述試驗結果對采用厭氧顆粒污泥工藝的城市污水廠應對高納米TiO2進水沖擊時也具有一定指導意義, 即如果及時采取處理措施, 納米TiO2進水沖擊負荷不會對系統穩定性產生明顯影響.

(a)產酸階段; (b)產甲烷階段

圖 2 納米TiO2短期暴露對厭氧顆粒污泥產酸階段及產甲烷階段的影響

　　盡管上述試驗證明, 納米TiO2對產酸階段及產甲烷階段這兩個獨立過程沒有明顯影響, 但實際厭氧消化過程中上述兩階段是相互融合彼此協調的.因此, 通過累積產烷量隨時間的變化情況考察了納米TiO2對完整的厭氧消化產烷過程的影響, 結果見圖 3.可見, 無論是單獨考慮產烷過程還是厭氧消化完整過程, 納米TiO2對最終產烷量都沒有明顯影響, 但值得注意的是, 150 mg·g-1的納米TiO2使累積產烷量在第2 d即明顯滯后于其它試驗組及對照組(P<0.05), 直到第6 d之后產烷量才與其它試驗組接近.這說明, 盡管高劑量納米TiO2的短期暴露不會損害產甲烷菌的代謝能力, 但可使其產烷速率減慢, 結合納米TiO2短期暴露同樣未對產酸菌代謝能力產生明顯抑制的結論(圖 2), 可推斷產烷速率的暫時性下降主要是傳質速率的降低, 即高劑量納米TiO2阻礙了厭氧顆粒污泥中微生物維持原本的代謝速率, 這可能是由于大量納米TiO2堆積在顆粒污泥表面占據了污泥表面的活性點位, 從而阻礙了營養物質向顆粒污泥內部的擴散.

*表示與對照組有明顯差異

圖 3 納米TiO2對累積產甲烷量的影響

　　2.2 納米TiO2對厭氧顆粒污泥產甲烷過程的長期影響

　　盡管短期暴露試驗說明, 納米TiO2沖擊負荷不會厭氧顆粒污泥中的微生物產生明顯抑制作用, 但上述結論并不一定適用于解釋納米TiO2對持續運行的厭氧污水處理系統的累積影響.因此, 為了考察納米TiO2對的長期影響, 本研究連續監測了厭氧顆粒污泥反應器在納米TiO2長期暴露下的運行情況, 結果如圖 4所示.

圖 4 納米TiO2對厭氧顆粒污泥反應器運行穩定性的長期影響

　　納米TiO2的長期作用使得R2反應器內的VFAs呈現出不同的變化趨勢.乙酸是唯一能被產甲烷菌作為底物直接利用的VFAs, 因此, R2反應器內乙酸濃度與R1接近且都保持了較低的水平暗示了兩個反應器內的產甲烷菌都能夠有效地代謝乙酸.換句話說, 與短期暴露試驗結果相近, 納米TiO2的長期作用對產甲烷菌的影響并不明顯.運行35 d后R2反應器內的丙酸濃度開始高于R1反應器且差距持續拉大, 說明R2反應器內丙酸氧化菌群(即產乙酸菌)生長受抑制, 這一般被認為是厭氧反應器運行不穩定的標志之一, 這也說明產乙酸菌對納米TiO2的長期暴露要比產甲烷菌更加敏感.但R2反應器內丁酸積累直到運行50 d后才出現且直至試驗結束也沒有超過75mg·L-1, 似乎暗示著食丁酸產乙酸菌的代謝受納米TiO2的影響并不像食丙酸產乙酸菌那樣明顯. Collins等和Schmidt等的研究結果同樣證實了食丁酸產乙酸菌在不良環境沖擊下代謝速率要高于食丙酸產乙酸菌, 因為氧化丁酸的過程中能產生更多的能量且食丁酸產乙酸菌對化學物質沖擊的適應能力更強.反應器運行超過一個月后才出現丙酸和丁酸積累也說明, 用短期暴露試驗來研究納米顆粒對厭氧體系的長期累積效應是具有一定局限性的.

　　經過90 d的運行, R2反應器內的產氣量和甲烷產率分別下降了30.70%和14.01%, 且產氣量的下降(第24 d)明顯早于甲烷產率的下降(第51 d), 即納米TiO2對CO2和H2產量的抑制相較于CH4不僅更早而且更顯著, 這表明納米TiO2對產酸菌具有更顯著的抑制作用, 這一現象也與圖 4中VFAs的試驗結果一致.

　　鑒于短期及長期暴露試驗都證明了納米TiO2對產烷過程影響不明顯, 考慮到本試驗條件下基本限制了納米TiO2生成ROS及納米TiO2極低的溶解度[7], 即排除了ROS或金屬離子釋放導致的抑制作用, 再結合上述“納米TiO2長期暴露對產酸菌比對產甲烷菌的抑制更明顯”的試驗結果, 可推斷納米TiO2對厭氧顆粒污泥的抑制機制主要發生在顆粒污泥外層, 是一種“物理遮蔽”作用.一般認為, 厭氧顆粒污泥內的功能菌群是層狀分布的, 即外層主要為產酸菌而內層則分布著產甲烷菌[9].鑒于本試驗中納米TiO2的團聚體尺寸超過了66 nm(圖 1), 只可能被截留在顆粒污泥表面或外層, 因此只有位于外層的產酸菌有機會接觸到納米TiO2, 而逐漸被顆粒污泥所吸附的納米TiO2則可能通過占據活性點位、降低污泥與基質的接觸面積或者阻塞物質代謝通道等方式在產酸菌與液相間建立起一道物理屏障阻礙產酸菌對營養物質的攝入.此時, 顆粒污泥的層狀結構具有雙重作用, 一方面納米TiO2通過改變外層產酸菌附近的微環境條件干擾了產酸菌的正常代謝; 另一方面, 外層產酸菌為處于顆粒污泥內部的產甲烷菌提供了保護屏障以遠離因納米TiO2長期暴露導致的外界不良環境.

　　2.3 納米TiO2在厭氧反應器內的歸趨

　　為確定納米TiO2在厭氧反應器內的歸趨, 對R2反應器出水中的化合態(TiO2)及離子態(Ti4+)的Ti含量進行了測定, 結果如圖 5所示.

水平線表示測試指標平均含量

圖 5 出水中納米TiO2及溶解性Ti4+的濃度

　　由圖 5(a)結果可見, 出水中TiO2的平均含量只有0.632 mg·L-1, 說明絕大多數納米TiO2都被厭氧顆粒污泥截留在了反應器內. Gómez-Rivera等[25]和Lombi等在研究納米顆粒在污水處理構筑物中的歸趨時同樣發現絕大多數納米顆粒會被活性污泥所截留.但隨著運行時間的延長, 出水中TiO2的含量有增高的趨勢.這可能與納米TiO2的團聚特性和R2反應器內微環境條件隨暴露時間延長有所變化有關.有研究表明, 液相中的有機物成分能明顯改變納米顆粒的團聚行為.因此, R2反應器內VFAs的積累不僅是納米TiO2長期暴露的結果, 同時也能反作用于納米TiO2的團聚、遷移及沉降行為.由于納米TiO2吸附了更多的有機酸, 使得顆粒之間的靜電斥力和空間位阻增大, 進而阻礙了顆粒的聚集, 增強了納米TiO2在液相中的穩定性[28].另一方面, VFAs的積累將導致pH值有所下降, 從而使液相pH值更加遠離納米TiO2的等電點, 范德華引力降低而靜電斥力增加, 納米顆粒的聚集體尺寸減小, 從而進一步增強了納米TiO2隨出水遷移的能力.

　　圖 5(b)表明納米TiO2的溶解度極低, 納米TiO2的溶解行為與暴露時間無關, 也證實了之前的猜測, 納米TiO2對厭氧顆粒污泥的抑制作用與Ti4+釋放無關, 這也與之前的多項研究結果一致.

　　2.4 納米TiO2長期暴露下厭氧顆粒污泥形貌及種群動態的變化

　　SEM-EDS分析可直觀反映納米TiO2是否可被厭氧顆粒污泥所截留.長期暴露試驗結束后, R2反應器內的顆粒污泥樣品SEM圖像[圖 6(a)]顯示了顆粒污泥表面沉積了多個顆粒團聚體, 而EDS分析證實所觀察到的顆粒物即為TiO2.掃描電鏡圖像還反映出納米TiO2長期暴露后顆粒污泥形貌的變化. R1反應器內的污泥樣品表面均勻覆蓋了EPS, 且大量的具有產酸菌典型形態的絲狀、棒狀及不規則球狀細菌被包裹在EPS內[圖 7(a)].而R2反應器的污泥樣品出現了局部EPS剝落, 細菌直接暴露在了外部, 表明顆粒污泥外層結構受損[圖 7(b)], 這也間接證明了上文“納米TiO2的長期暴露會對位于顆粒污泥外層產酸菌產生一定抑制作用”的結論.

圖 6 納米TiO2長期暴露后厭氧顆粒污泥表面的掃描電鏡及能譜分析圖

(a)、(b)分別代表R1及R2反應器內顆粒污泥形貌

圖 7 納米TiO2長期暴露下厭氧顆粒污泥形貌的變化

　　為考察納米TiO2長期暴露對厭氧顆粒污泥微生物的種群結構的影響, 本研究中分別采用不同的特異性探針對兩反應器內顆粒污泥中的真細菌、古細菌、產甲烷絲菌和產甲烷八疊球菌進行檢測, 以確定其相對數量關系, 結果如表 2所示.

　　表 2 納米TiO2對厭氧顆粒污泥微生物種群結構的長期影響/%

　　經過90 d的納米TiO2暴露后, R2反應器內顆粒污泥中的總活細胞、真細菌及古菌含量沒有明顯變化, 說明納米TiO2長期暴露對產酸菌及產甲烷菌都沒有明顯的致死效應, 側面證實了前述“厭氧條件下納米TiO2的抑制作用主要來自于物理遮蔽效應”的推論.

　　甲烷絲狀菌和甲烷八疊球菌是最主要嗜乙酸產甲烷菌, 鑒于厭氧體系內70%以上的甲烷都來自于嗜乙酸產甲烷菌, 因此在正常運行的厭氧顆粒污泥反應器內, 這兩種產甲烷菌一般占優勢地位.納米TiO2的長期暴露使產甲烷古菌的種群結構和相對豐度發生了比較明顯的變化：甲烷絲狀菌減少了19.4%, 而甲烷八疊球菌的含量則大幅增加了115.6%.可見納米TiO2使得顆粒污泥內的微環境更適于甲烷八疊球菌的生長.這也可以從這兩種產甲烷菌不同的生理生態特性角度解釋.盡管R2反應器內的乙酸濃度更低, 更適于具有高基質親和性的甲烷絲狀菌生長, 但須注意的是, 乙酸濃度的減少不僅是嗜乙酸產甲烷菌代謝的結果, 同樣也是產乙酸菌代謝受抑的表現.而甲烷絲狀菌能利用的底物只有乙酸, 因此當乙酸濃度不足時, 甲烷絲狀菌的生長會受到一定限制, 而甲烷八疊球菌可利用的基質種類更多, 在某一底物濃度不足時可轉而利用其它底物生長, 更強的底物適應能力保證了其能在產乙酸菌受抑制時仍維持正常生長.從顆粒污泥本身的結構來講, 由于納米TiO2是從顆粒污泥外部干擾菌群正常代謝的, 因此顆粒污泥有減小其比表面積來減少與納米TiO2接觸的趨勢, 而甲烷八疊球菌能比甲烷絲狀菌分泌出更多的EPS, 因此甲烷八疊球菌為主的厭氧顆粒污泥結構更加密實, 具有更小的孔隙度, 能有效地將納米顆粒摒除在污泥外部.不僅如此, EPS也能補償納米TiO2所占據的活性點位, 并藉由這些活性點位來運輸底物, 彌補產酸菌代謝受抑造成的EPS分泌量不足[圖 7(b)].

　　3 結論

　　(1) 低于150 mg·g-1納米TiO2的短期暴露對厭氧顆粒污泥的產酸階段及產甲烷階段的代謝產物總量沒有明顯影響, 但納米TiO2的沖擊負荷會減慢產烷速率.具體參見污水寶商城資料或http://www.dongaorq.cn更多相關技術文檔。

　　(2) 納米TiO2的長期持續暴露對厭氧顆粒污泥反應器的運行穩定性有負面影響, 出水指標顯示產酸菌的代謝受抑比產甲烷更明顯, 納米TiO2對厭氧顆粒污泥的抑制機制是“物理遮蔽”作用與顆粒污泥的層狀結構共同作用的結果, 污泥外層的產酸菌為內部的產甲烷菌提供了有效的保護.

　　(3) 出水中TiO2的平均含量只有0.632 mg·L-1, 絕大多數納米TiO2都被截留在了反應器中, 納米TiO2的團聚特性和反應器內微環境條件的變化能夠影響納米TiO2的歸趨.

　　(4) 納米TiO2的長期持續暴露能夠破壞污泥表面覆蓋的EPS; 盡管納米TiO2對厭氧顆粒污泥中的各功能菌群沒有明顯的致死效應, 但能夠改變顆粒污泥中產甲烷菌的群落結構.