隨著水體富營(yíng)養(yǎng)化問題日益突出，氮素污染的防治越來越受到人們的重視。目前污水脫氮處理方法主要有化學(xué)法、生化法及生物物理-物化組合工藝。其中生物脫氮以其經(jīng)濟(jì)、高效、無殘留污染的優(yōu)點(diǎn)，成為污水脫氮的主要手段。但是，傳統(tǒng)的生物脫氮分硝化和反硝化等不同過程，要求在2個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行，故建設(shè)成本高，而且反硝化部分還需要投加大量碳源。
近年來，隨著具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化特性菌株的發(fā)現(xiàn)，利用異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌研發(fā)污水脫氮技術(shù)已成為研究熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)硝化微生物相比，異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌具有更高的細(xì)胞生長(zhǎng)速率，并且實(shí)現(xiàn)了在同一個(gè)反應(yīng)器中同步完成硝化和反硝化反應(yīng)，同時(shí)將氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為含氮?dú)怏w。而且，在硝化和反硝化過程中分別產(chǎn)生的酸和堿能相互中和，從而相對(duì)維持水體酸堿平衡，減少pH調(diào)節(jié)成本。此外，一些特殊異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌甚至還具備耐受高氨氮、高鹽度、低溫和低C/N的特性。目前已發(fā)現(xiàn)的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌主要有產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)等。然而，由于異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌在養(yǎng)殖廢水中存在脫氮效果穩(wěn)定性差、環(huán)境適應(yīng)力和競(jìng)爭(zhēng)力弱等問題，故實(shí)際應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖廢水的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌較少。為此，本研究從南昌縣一中型養(yǎng)豬廠曝氣池篩選出一株脫氮性能較好的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株YZ-12，經(jīng)過16SrRNA基因序列分析鑒定菌株種屬，分析了優(yōu)化菌株脫氮條件，并將該菌株應(yīng)用于養(yǎng)豬廢水脫氮實(shí)驗(yàn)，以期為豬場(chǎng)養(yǎng)殖廢水提供脫氮效果優(yōu)良、環(huán)境適應(yīng)力和競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)的微生物菌劑。
1、材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
篩選樣品采自南昌縣一中型養(yǎng)豬廠曝氣池；細(xì)菌DNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)OmegaBio-Tek公司，PCR聚合酶購(gòu)自TOYOBO公司，27F/1492R引物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.2 培養(yǎng)基
富集培養(yǎng)基的成分為：1g胰蛋白胨，0.5g酵母膏，0.1gKNO3，1L蒸餾水，pH為7.2。BTB初篩培養(yǎng)基：8.5gC4H4Na2O4∙6H2O，1gKNO3，1gMgSO4∙7H2O，1gKH2PO4，0.05gFeSO4∙7H2O，0.2gCaCl2∙2H2O，20g瓊脂，1mL1%溴百里酚藍(lán)，1L蒸餾水，pH為7.0~7.3。硝化培養(yǎng)基的成分為：11gC4H4Na2O4∙6H2O，6.7gNa2HPO4∙12H2O，1.5gNH4Cl，1gKH2PO4，0.1gMgSO4∙7H2O，2mL微量元素溶液，1L蒸餾水，pH為7.0~7.3。反硝化培養(yǎng)基的成分為：13gC4H4Na2O4∙6H2O，7.9gNa2HPO4∙12H2O，3gKNO3，1.5gKH2PO4，0.1gMgSO4∙7H2O，2mL微量元素溶液，1L蒸餾水，pH為7.0~7.3。微量元素溶液的成分為：50gEDTA，7.28gCaCl2∙2H2O，5gFeSO4∙7H2O，3.92gZnSO4∙7H2O，2.06gMnCl2∙4H2O，1.61gCoCl2∙6H2O，1.57gCuSO4∙5H2O，1.1g(NH4)6Mo7O24∙4H2O，1L蒸餾水，pH為6.0。
1.3 異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的篩選及鑒定
取10mL養(yǎng)殖廢水，加入到裝有90mL無菌富集培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30℃、120r∙min-1恒溫培養(yǎng)24h，取5mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接，重復(fù)富集3次。將富集液進(jìn)行梯度稀釋(10-4~10-7)，取0.2mL涂布于BTB初篩培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至出現(xiàn)明顯的單菌落。挑取變藍(lán)單菌落，經(jīng)多次劃線純化后于4℃冰箱中保存。
將保存的菌株分別接種于無菌富集培養(yǎng)基中，在30℃、120r∙min-1下恒溫培養(yǎng)24h，按3%接種量分別加到硝化培養(yǎng)基和反硝化培養(yǎng)基中，在30℃、120r∙min-1下恒溫培養(yǎng)48h，取培養(yǎng)液檢測(cè)NH4+-N、NO3--N、NO2--N濃度，從而篩選出具有較好脫氮性能的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌。
采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取菌株基因組的樣品，利用27F/1492R引物對(duì)樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增，用Sanger法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，采用雙向引物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接處理。
1.4 菌株的脫氮性能研究
1)菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。菌株于富集培養(yǎng)基中活化后，按3%接種量分別接種于硝化培養(yǎng)基和反硝化培養(yǎng)基中，在30℃、120r∙min-1下恒溫培養(yǎng)54h，每3h檢測(cè)培養(yǎng)液OD600值，每6h檢測(cè)NH4+-N、NO3--N、NO2--N的質(zhì)量濃度。
2)菌株的脫氮條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。考察了碳源、氮濃度、C/N、pH、鹽度5種單因素對(duì)菌株脫氮效果的影響。其中，碳源分別為葡萄糖、蔗糖、乙酸鈉、甲醇和丁二酸鈉；NH4+-N質(zhì)量濃度分別為50、100、150、200和250mg·L-1；NO3--N質(zhì)量濃度分別為400、450、500、550和600mg·L-1；C/N分別為2.5、5、10、15和20；pH分別為5、6、7、8和9；鹽度分別為10、20、30、40和50g·L-1。30℃、120r∙min-1恒溫培養(yǎng)72h，每24h取樣檢測(cè)培養(yǎng)液OD600值及NH4+-N、NO3--N、NO2--N質(zhì)量濃度。
1.5 菌株在養(yǎng)殖廢水中的應(yīng)用
供試樣品為曝氣池的水泡糞污水，采集自南昌縣一中型養(yǎng)豬廠污水處理站好氧池。經(jīng)檢測(cè)，養(yǎng)殖廢水樣品中COD為2031mg·L-1，NH4+-N質(zhì)量濃度為362mg·L-1，NO3--N質(zhì)量濃度為23.8mg·L-1，pH為7.8。
用蔗糖將養(yǎng)殖廢水C/N調(diào)節(jié)為10，并進(jìn)行以下3種處理：1)121℃滅菌30min，按5%接種量接入菌株YZ-12懸液；2)不滅菌，按5%接種量接入菌株YZ-12懸液；3)不滅菌，按5%接種量接入無菌水。在30℃，120r∙min-1恒溫培養(yǎng)48h，每24h取樣檢測(cè)NH4+-N、NO3--N、NO2--N質(zhì)量濃度，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。
1.6 分析方法
NH4+-N使用納氏試劑分光光度法測(cè)定；NO3--N、NO2--N使用離子色譜法測(cè)定；OD600使用光電比濁法測(cè)定；COD使用重鉻酸鹽法測(cè)定；pH使用上海雷磁PHSJ-3FpH計(jì)測(cè)定。
2、結(jié)果與討論
2.1 異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的篩選及鑒定
從養(yǎng)殖廢水中共篩選出15株細(xì)菌，脫氮效果如圖1所示。其中12號(hào)菌株(YZ-12)對(duì)氨氮去除率為60.52%，對(duì)硝態(tài)氮去除率為93.39%，其脫氮效果最佳，故將其用于后續(xù)的脫氮實(shí)驗(yàn)。
提取菌株YZ-12的DNA，使用細(xì)菌16S通用引物進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果得到的seq文件中的序列信息，輸入NCBI數(shù)據(jù)中的Blast比對(duì)系統(tǒng)中，搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中相似的序列，得到序列比對(duì)結(jié)果。菌株YZ-12與Klebsiellaoxytoca strain相似度最高，同源性為100%，采用Mega7.0軟件構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。
2.2 菌株YZ-12的脫氮性能研究
1)菌株YZ-12生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。由圖3可以看出，菌株YZ-12的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為12~30h，穩(wěn)定期為30~48h，48h后進(jìn)入衰亡期。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，氨氮被快速去除，NH4+-N由326mg·L-1下降至156mg·L-1，氨氮去除率為52.15%。在此脫氨過程中，硝態(tài)氮有少量產(chǎn)生后又去除，亞硝態(tài)氮幾乎未檢出，這與AN等、陳猛等的研究結(jié)果類似。由于初始氨氮質(zhì)量濃度較高，與鄒艷艷等的研究結(jié)果相比，氨氮去除率下降明顯，但氨氮去除量明顯增加。在0~24h，NO3--N由415mg·L-1下降至0.215mg·L-1，硝態(tài)氮去除率為99.95%，同時(shí)NO2--N不斷積累，最高達(dá)到356mg·L-1。這與楊靜丹等的研究結(jié)果類似，碳源和碳氮比可能對(duì)NO2--N積累均有影響。
2)碳源對(duì)菌株YZ-12脫氮效果的影響。異養(yǎng)硝化-好氧反硝化是氧化還原反應(yīng)，不同的碳源具有不同的氧化還原電位，所以會(huì)產(chǎn)生不同的脫氮效果。由圖4可以看出，以葡萄糖、蔗糖、丁二酸鈉為碳源進(jìn)行異養(yǎng)硝化時(shí)，菌株均能正常生長(zhǎng)，OD600值達(dá)到1.9以上，氨氮去除率最大分別為30%、42.86%、42.57%。此時(shí)，菌株無法利用甲醇為碳源，幾乎不生長(zhǎng)，以乙酸鈉為碳源進(jìn)行異養(yǎng)硝化時(shí)，菌株生長(zhǎng)也受到抑制。因此，與甲醇、乙酸鈉、葡萄糖等碳源相比，蔗糖、丁二酸鈉作為異養(yǎng)硝化的碳源更具優(yōu)勢(shì)。
由圖5可知，以葡萄糖、蔗糖、丁二酸鈉、乙酸鈉為碳源進(jìn)行好氧反硝化時(shí)，菌株能正常生長(zhǎng)，72h時(shí)NO3--N去除率均達(dá)到99%。其中，以葡萄糖、蔗糖為碳源時(shí)，24h時(shí)NO3--N去除率達(dá)到99%。但以葡萄糖、丁二酸鈉、乙酸鈉為碳源時(shí)，NO2--N有明顯累積，而以蔗糖為碳源時(shí)NO2--N幾乎未檢出。綜合選擇，蔗糖作為好氧反硝化碳源更具優(yōu)勢(shì)。這與LIU等的研究結(jié)果一致。
3)初始氨氮質(zhì)量濃度對(duì)菌株YZ-12脫氮效果的影響。不同廢水含氮量不同，配置不同初始氮濃度培養(yǎng)液，研究菌株的脫氮效果。由圖6可以看出，菌株YZ-12的異養(yǎng)硝化主要在24~48h，這是菌株生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期，這24h內(nèi)平均NH4+-N去除速率分別為1.10、2.86、3.90、4.06、4.17mg·(L·h)-1。當(dāng)初始氨氮質(zhì)量濃度為150~250mg·L-1時(shí)，其NH4+-N去除速率趨于穩(wěn)定；當(dāng)初始氨氮質(zhì)量濃度為50mg·L-1時(shí)，菌株YZ-12因?yàn)榈床蛔悖绊懢纳L(zhǎng)，從而影響了NH4+-N去除速率。高游離氨濃度廢水對(duì)異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌具有毒性，當(dāng)NH4+-N為150、200、250mg·L-1時(shí)，其氨氮去除率分別為86.64%、67.02%、53.81%，與NH4+-N為100mg·L-1時(shí)96.81%的去除率相比，差異顯著。
硝態(tài)氮質(zhì)量濃度對(duì)YZ-12好氧反硝化的影響如圖7所示。菌株YZ-12的好氧反硝化主要發(fā)生在0~48h，當(dāng)初始硝態(tài)氮質(zhì)量濃度為400~450mg·L-1時(shí)，在0~24h的NO3--N去除速率分別為16.56、16.43mg·(L·h)-1；當(dāng)初始硝態(tài)氮質(zhì)量濃度升高至500~600mg·L-1時(shí)，在0~24h的NO3--N去除速率分別下降至8.96、6.50、4.71mg·(L·h)-1，同時(shí)還有部分亞硝態(tài)氮積累。這可能因高濃度硝態(tài)氮對(duì)菌株的好氧反硝化作用起到了抑制作用。
4)碳氮比對(duì)菌株YZ-12脫氮效果的影響。不同碳氮比對(duì)菌株YZ-12脫氮的影響如圖8和圖9所示。在C/N為2.5和5的硝化培養(yǎng)液中，菌株生長(zhǎng)緩慢，NH4+-N去除率不高，分別為40.00%和62.84%。這是因?yàn)榈?/span>C/N影響微生物酶活性，從而影響脫氮率及菌株的生長(zhǎng)。當(dāng)C/N為10、15、20時(shí)，NH4+-N均在48h后降至10mg·L-1以下，菌株生長(zhǎng)良好。所以，菌株YZ-12異養(yǎng)硝化最佳C/N為10~20。
對(duì)于菌株好氧反硝化而言，當(dāng)C/N在2.5~20時(shí)，菌株均能良好生長(zhǎng)，且C/N越高，菌株生長(zhǎng)越好。當(dāng)C/N為5~20時(shí)，培養(yǎng)24h后其NO3--N去除率為99.6%。在C/N=10時(shí)，NO2--N有明顯累積，后又去除；但當(dāng)C/N=5時(shí)，NO3--N均轉(zhuǎn)化為NO2-N；當(dāng)C/N=2.5時(shí)，NO3--N也慢慢轉(zhuǎn)化為NO2--N，未能去除。綜合考慮，菌株YZ-12最佳好養(yǎng)反硝化C/N為10~20。這符合大多數(shù)異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌最佳C/N范圍(6~20)。
5)pH對(duì)菌株YZ-12脫氮效果的影響。不同pH對(duì)菌株YZ-12脫氮的影響如圖10和圖11所示。在pH為5~9的硝化培養(yǎng)液中，菌株均能正常生長(zhǎng)。菌株在pH為7、8、9的培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h，NH4+-N去除率均為98%以上。但在酸性條件下NH4+-N去除率有所下降，在pH為5和6時(shí)，NH4+-N最大去除率分別為62.00%和78.53%。這說明菌株YZ-12更適合處理中性及偏堿性廢水，這與胡杰等獲得的結(jié)果相近。
酸性環(huán)境不僅影響菌株YZ-12降解硝態(tài)氮效果，同時(shí)還會(huì)影響菌株生長(zhǎng)。菌株在pH為7、8、9的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，NO3--N的去除率均在99%以上，且生長(zhǎng)良好；但pH為7時(shí)，則有62.7mg·L-1的NO2--N積累。有研究表明，反硝化酶在中性或微堿性環(huán)境中活性更高，在偏酸性條件下其活性受到抑制，導(dǎo)致脫氮效果下降，這與本研究結(jié)果一致。
6)鹽度對(duì)菌株YZ-12脫氮效果的影響。部分異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌具有耐鹽性。由圖12可以看出，鹽度對(duì)硝化作用影響顯著，在鹽度為10g·L-1和20g·L-1的異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，菌株YZ-12能夠正常生長(zhǎng)，NH4+-N去除率最大分別為99.02%和66.70%；當(dāng)鹽度為30g·L-1時(shí)，菌株在48h適應(yīng)高鹽環(huán)境后開始生長(zhǎng)，NH4+-N在72h時(shí)去除率為23%。這說明菌株具有一定的耐鹽性。當(dāng)鹽度≥40g·L-1時(shí)，高鹽環(huán)境會(huì)破壞細(xì)菌細(xì)胞，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)及代謝過程，導(dǎo)致菌株無法大量繁殖。
鹽度對(duì)YZ-12好氧反硝化的影響如圖13所示。當(dāng)鹽度≥40g·L-1時(shí)，菌株也無法在反硝化培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；鹽度≤30g·L-1時(shí)，菌株具有良好的反硝化能力，培養(yǎng)48h后，NO3--N去除率均達(dá)到99%，同時(shí)僅有部分亞硝態(tài)氮積累。這說明菌株YZ-12屬于耐鹽菌，具有處理高鹽硝態(tài)氮廢水的能力。
2.3 菌株YZ-12在養(yǎng)殖廢水中的脫氮效果
由圖14可以看出，不同的處理方式下脫氮效果亦不同。不加菌液的養(yǎng)殖廢水中的微生物在合適的C/N條件下，NH4+-N和NO3--N的去除率分別為71.82%和55.46%。這說明養(yǎng)殖廢水中本身存在脫氮菌，在適宜生長(zhǎng)條件下可以起到部分脫氮作用。不滅菌加5%菌液處理的養(yǎng)殖廢水NH4+-N和NO3--N的去除率分別為88.54%和96.0%。這說明加入5%的YZ-12菌液后，YZ-12在養(yǎng)殖廢水中競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)，能夠提升脫氮效果，但受到其他菌種的影響。滅菌加5%菌液處理的養(yǎng)殖廢水NH4+-N和NO3--N的去除率分別為95.15%和99.69%。該處理的NH4+-N去除率高于陳猛等實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與陳均利等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，說明菌株YZ-12在不受其它菌株影響時(shí)，對(duì)養(yǎng)殖廢水具有更好的脫氮效果。
3、 結(jié)論
1)從養(yǎng)豬廠污水處理站曝氣池篩選出一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株Klebsiellaoxytoca YZ-12，該菌株具有較好的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力，同時(shí)還具有一定的耐鹽性，能夠獨(dú)立完成脫氮全部過程。
2)菌株YZ-12最適脫氮條件為C/N=10、pH=7、鹽度≤10g·L-1、NH4+-N質(zhì)量濃度≤150mg·L-1、NO3--N質(zhì)量濃度≤450mg·L-1、碳源為蔗糖。
3)調(diào)節(jié)養(yǎng)殖廢水C/N后加入5%YZ-12菌株對(duì)其進(jìn)行脫氮處理，48h后NH4+-N去除率達(dá)95.15%，NO3--N去除率達(dá)99.69%。這說明該菌株脫氮性能好且在養(yǎng)殖廢水中具有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力和適應(yīng)力。（來源：江西中江環(huán)保集團(tuán)股份有限公司，贛江新區(qū)高濃度有機(jī)廢水污染控制工程技術(shù)研究中心）
