好氧顆粒污泥（AGS）技術起源于20世紀90年代，被認為是最具發展前景的污水處理工藝之一。與傳統活性污泥相比，AGS具有規則的形態、緊實的結構、良好的沉降性能以及高濃度生物量，能承受高強度的有機有毒廢水沖擊。碳氮負荷及其比值（C/N）是影響AGS形成和穩定運行的重要因素。一般來說，較高的C/N（7.5~30）有利于異養菌快速生長，形成蓬松絮體和大顆粒；而較低的C/N（2~5）則會形成以慢速生長菌為主的穩定致密小顆粒。Luo等人研究發現C/N由4降至1時，AGS的物理特性、硝化性能和胞外聚合物（EPS）含量均會下降，微生物群落發生顯著變化，進而導致顆粒解體。在實際應用中存在著大量低C/N同時碳氮負荷波動大的廢水，如藥廠、垃圾填埋場、化肥廠和石化行業廢水等，利用好氧顆粒污泥技術處理該類廢水還需進一步深入實踐。
目前有研究提出通過調整操作條件，在系統進入曝氣階段前設置前置缺氧段來提高碳源不足時的反硝化效率。同時，顆粒內部能夠形成缺氧層，定植更多反硝化菌，提高好氧顆粒污泥系統的穩定性。Kocaturk等人研究發現，在曝氣前引入缺氧段能夠通過改變C/N調節硝化菌及異養菌之間的種群分布，在C/N為7.5的條件下好氧顆粒污泥對COD的去除率可達75%~90%，TN去除率高達90%以上。Chen等人通過交替厭氧/好氧結合分步進水模式，在C/N為5和3的條件下，均能實現超過90%的氮去除效率。值得注意的是，缺氧段的泥水混合效果會影響AGS特性和污染物去除效率。但目前關于缺氧段泥水混合程度對AGS穩定性影響的研究結果不一致，因此，缺氧段泥水混合效果對AGS的影響機理還需進一步探究。
基于此，接種好氧顆粒污泥后處理不同C/N的廢水，通過在缺氧段施加和不施加外循環操作，考察AGS長期運行過程中污泥形態特征、污染物去除性能、EPS含量和組成、微生物菌落結構的變化，探究系統缺氧段混合效果對AGS穩定性的影響機理，以期為好氧顆粒污泥技術的應用提供參考。
1、材料與方法
1.1 實驗材料
接種好氧顆粒污泥是在低C/N（碳氮負荷為400/100mg/L）下培養并冷藏放置近6個月的顆粒污泥，MLSS為2.61g/L，MLVSS為2.41g/L，污泥體積指數（SVI30）為100mL/g。
1.2 實驗裝置與操作條件
實驗采用圓柱形有機玻璃材質SBR反應器，內徑為5cm，有效高度為100cm，有效高徑比（H/D）為20，有效工作體積為2L。反應器從底部進水，中部排水，體積交換率為50%。每周期為4h，每天運行6個周期。單周期運行方式為進水5min、缺氧55min、曝氣170min、沉降5min、排水5min，由時間控制開關自動控制。在好氧段，由設置在反應器底部的曝氣石曝氣，曝氣流量控制在1.2L/min（即表面氣速約為1cm/s），水力停留時間（HRT）為8h。缺氧段開啟外循環操作時，使用蠕動泵將反應器上層廢水通過外部軟管輸送至反應器底部。蠕動泵流量控制在60mL/min，使顆粒污泥層膨脹高度控制在一定范圍，避免顆粒污泥揚起被循環帶走。
1.3 廢水水質
系統進水為人工模擬廢水。碳源為含量60%的工業乙酸鈉，氮源為硫酸銨，磷源為磷酸二氫鉀，通過投加碳酸氫鈉調控pH在7.5左右。其他的營養液和微量元素包括：KH2PO4為22.5mg/L，CaCl2·2H2O為12.5mg/L，MgSO4·7H2O為15mg/L，FeSO4·7H2O為10mg/L，MnCl2·4H2O為0.12mg/L，ZnSO4·7H2O為0.12mg/L，CuSO4·5H2O為0.03mg/L，（NH4）6Mo7O24·4H2O為0.05mg/L，NiCl2·6H2O為0.1mg/L，CoCl2·6H2O為0.1mg/L，AlCl3·6H2O為0.05mg/L，H3BO3為0.05mg/L。不同時期的進水碳氮負荷提升情況如表1所示。
1.4 分析項目與測試方法
COD、氨氮、亞硝態氮、硝態氮采用哈希DR3900紫外可見光度計測定。SVI、MLSS、MLVSS等按照美國APHA標準方法進行測定。好氧顆粒污泥的表觀形態采用奧林巴斯XTL-300型光學顯微鏡觀察，顆粒粒徑使用馬爾文2000型激光粒度儀測定。
胞外聚合物（EPS）分為疏松層EPS（LB-EPS）和緊密層EPS（TB-EPS），采用水熱提取法分別提取。EPS含量為蛋白質（PN）和多糖（PS）含量之和，PN采用考馬斯亮藍法測定，以牛血清白蛋白為標準樣品；PS采用蒽酮-硫酸比色法測定，以葡萄糖為標準樣品。
1.5 顆粒污泥微生物群落分析
在系統運行的不同時間段取出污泥樣品20mL，于8000r/min離心15min后收集沉淀污泥，保存于-80℃冰箱中備用。使用PowerSoil®DNA分離試劑盒提取樣本DNA，以Qubit2.0DNA試劑盒測量其純度和濃度。使用27F/1492R引物組對細菌16SrDNA基因的V1-V9區進行擴增，將最終的反應產物進行AMpurePBBeads純化后置于SequelⅡ測序儀上進行上機測序。以Silva為參考數據庫，使用樸素貝葉斯分類器對OTUs代表序列進行分類學注釋，得到物種分類學信息，統計樣本在不同分類水平上的群落結構。利用QIIME軟件計算各樣品的Ace、Chao1及Shannon指數。
2、結果與討論
2.1 好氧顆粒污泥特性
2.1.1 好氧顆粒污泥的形態特征
圖1是不同時期污泥的電鏡照片（除接種污泥和第220天的圖像比例尺為1倍，其余圖像皆為5倍）。接種時好氧顆粒污泥呈黃褐色，表觀結構相對完整，說明冷藏儲存對顆粒的物理結構完整性影響不大。在階段Ⅱ碳氮負荷提升至400/50mg/L時，顆粒形態結構依然能夠維持。在階段Ⅲ提升碳氮負荷至400/80mg/L，缺氧段開始加入外循環操作，此時系統內開始出現絮體與顆粒共存狀態。這種現象可以解釋為外循環操作提高了缺氧段的反硝化作用，上一周期殘留的硝態氮還原產生的氣態氮，對顆粒結構造成了一定的沖擊，導致顆粒結構分散，顆粒表面出現一定的絮體細菌。盡管如此，好氧顆粒污泥的沉降性能并沒有受到明顯影響。說明此時的AGS已較好地適應了高氨氮環境，微生物群落已趨于穩定。在階段Ⅳ提升碳氮負荷至400/100mg/L，污泥形態以絮體和粒徑較小的顆粒為主，系統的沉降性能產生劇烈波動。這主要是因為進水氨氮負荷進一步提升，致使反硝化過程產生了更多的氣態氮，對原有顆粒結構造成了更為嚴重的沖擊，部分顆粒發生了破碎。但是，此階段并沒有觀察到絲狀菌生長，說明好氧顆粒僅物理結構受到影響，而其穩定性受到的影響不大。在階段Ⅴ提升碳氮負荷至600/150mg/L，并且缺氧段停止了外循環操作，系統內開始形成明顯的大顆粒污泥，同時顆粒的密實程度顯著下降，穩定性受到沖擊。在第220天，由于好氧顆粒沉降性能和氨氮去除性能惡化等原因，系統終止運行。
2.1.2 好氧顆粒污泥濃度和沉降性能
系統污泥濃度隨時間的變化如圖2（a）所示。在階段Ⅰ，MLSS在第16天降至最低2.27g/L，MLVSS在第19天降至最低1.71g/L，MLVSS/MLSS降至0.69。這是因為低溫長期儲存的顆粒污泥結構疏松，剛加入到系統時，活性低、沉降性能差的污泥被大量排出系統。污泥活性逐漸回升之后，污泥濃度也隨之提高，在階段Ⅱ末MLSS和MLVSS分別達到3.78和3.10g/L，MLVSS/MLSS提升至0.82。進入到階段Ⅲ和Ⅳ后，由于施加外循環的缺氧段混合效果大大提高，系統反硝化效果提升而產生的大量氣態氮黏附在顆粒污泥上，導致污泥沉降性能下降，外排流失，MLSS、MLVSS隨之明顯下降，最低降至1.44和0.68g/L，MLVSS/MLSS最低降至0.47。之后，系統逐漸適應較高的進水氨氮負荷條件，MLSS、MLVSS及MLVSS/MLSS在階段Ⅳ的中后期開始增長。進入到階段Ⅴ后，由于關閉缺氧段外循環，MLSS、MLVSS及MLVSS/MLSS呈現出先穩定后上升再急劇下降狀態。這種現象可以解釋為：經過前階段長期運行后，顆粒污泥已經具有較強的物理和生物結構，所以在該階段初期，雖然外循環停止，系統的MLSS、MLVSS仍能維持相對穩定。但是，后期由于污泥長期處于高碳氮負荷且缺氧條件不佳，其菌群結構受到極大影響，穩定性逐漸變差并大量排出系統，最終導致MLSS、MLVSS降低。
反應器的SVI30和SVI30/SVI5隨時間的變化如圖2（b）所示。在階段Ⅰ反應器的SVI30由100mL/g逐步下降，在第23天降至60mL/g，說明冷藏顆粒污泥沉降性能恢復較快。在階段Ⅱ，反應器的平均SVI30基本維持在53mL/g左右。在階段Ⅲ和Ⅳ添加了外循環操作后，反硝化過程產生的大量氣態氮對污泥沉降性能造成影響，尤其是階段Ⅳ的SVI30在100~200mL/g之間波動。在階段Ⅴ，系統SVI30由100mL/g增加至170mL/g。從系統啟動到階段Ⅲ結束SVI30/SVI5都穩定在1左右，這表明系統顆粒污泥一直處于顆粒完全形成的狀態。在階段Ⅳ和階段Ⅴ，SVI30變化導致SVI30/SVI5波動，此時顆粒污泥形態發生劇烈變化，沉降性能惡化，顆粒結構瓦解。
2.1.3 好氧顆粒污泥的粒徑分布
好氧顆粒污泥的粒徑分布曲線見圖3。接種顆粒污泥的平均粒徑為672μm。這是因為在4℃低溫下存儲時，顆粒污泥長期處于饑餓狀態，顆粒內部的EPS被當作營養物質消耗，使得顆粒間的黏結性能下降，開始向四周擴散所致。啟動運行之后，顆粒的粒徑逐漸減小，在階段Ⅱ末測得平均粒徑為206μm，此時系統內主要為細小的顆粒。在階段Ⅲ和Ⅳ加入外循環后，平均粒徑減小至144μm，這主要歸因于前置缺氧段進行的反硝化作用產生的氣態氮沖擊，導致顆粒結構破碎。在階段Ⅴ顆粒逐漸向蓬松態轉變，顆粒粒徑增大至791μm。
2.2 好氧顆粒污泥的污染物去除性能
2.2.1 COD去除性能
運行期間AGS對COD的去除效果見圖4。
在階段Ⅰ初期，反應器對COD的去除效果并不理想，特別是第16天去除率最低至68%。說明冷藏后的顆粒污泥活性較低，需要一定恢復周期。隨著污泥活性的逐步恢復，至該階段末COD去除率提升至90%。在階段Ⅱ~Ⅴ，好氧顆粒污泥始終保持良好的COD去除性能，去除率均達到了95%以上。這表明碳氮負荷的提升和缺氧段是否設置外循環對系統去除COD影響不大。
2.2.2 NH4+-N去除性能
系統對氨氮的去除性能如圖5所示。在階段Ⅰ系統對NH4+-N的去除率較低，這與冷藏顆粒污泥的硝化菌活性低有關。至該階段末期，硝化菌的活性完全恢復，NH4+-N去除率達到了98%。在階段Ⅱ雖然提升了碳氮負荷，但是碳氮比仍處于比較適宜顆粒污泥生長的范圍，因此NH4+-N去除率達到了99%以上。在階段Ⅲ再次提高NH4+-N負荷至80mg/L，C/N為5，NH4+-N的去除率仍能達到99%以上。這可能是因為啟動了外循環裝置，系統在前置缺氧段進行了充分泥水混合，使得反硝化菌與硝化菌活性都較高。在階段Ⅳ，NH4+-N負荷進一步增加至100mg/L時，在初期和中期氨氮去除率有幾次波動，但大部分情況下都維持在99%。表明好氧顆粒污泥在該負荷沖擊下具有良好的適應性，而去除率波動可能與污泥沉淀性能下降導致的濃度降低有關。在階段Ⅴ系統負荷進一步增加至600/150mg/L，同時缺氧段停止了外循環。在該階段初期，基于好氧顆粒在前階段獲得的較高硝化活性，使得系統的NH4+-N平均去除率維持在99%以上。但運行近3周后去除率迅速下降，在第193天降至77.54%，運行末期降至33.87%。
2.2.3 TN去除性能
在階段Ⅰ，NO2--N產生一定累積，產生的NO3--N少，導致TN去除率很低。表明此時的系統完全硝化能力較差。系統運行至階段Ⅰ末，雖然氨氮負荷增加，但NO2--N降低至1mg/L，NO3--N濃度升至30.8mg/L，TN平均去除率逐漸提升至21%。說明硝化菌活性恢復，系統反硝化能力有所增強。在階段Ⅲ開始增加外循環操作后，雖然氨氮負荷大幅提升至80mg/L，TN去除率在前期波動后不但沒有降低，反而提升至30%。在階段Ⅳ進一步提升氨氮負荷，TN去除率進一步提升至57%。在階段Ⅲ和Ⅳ，NO2--N基本沒有積累，說明增加外循環可以使好氧顆粒污泥在前置缺氧段有效進行反硝化反應，提高了對TN的去除率。在階段Ⅴ碳氮負荷進一步增加至600/150mg/L時，由于取消了外循環，NO2--N達到了19.6mg/L，反硝化效率大大降低，在后期去除率急劇下降至5%。
2.3 胞外聚合物含量分析
胞外聚合物對于微生物聚集、好氧顆粒污泥的形成和結構穩定均具有重要作用。經過長期的冷藏存儲好氧顆粒污泥中的PN會作為能源物質被消耗，其濃度逐漸下降。在培養過程中，在LB-EPS中始終沒有檢測到PN，PS含量則由接種時的0.62mg/g降至第二階段結束時的0.11mg/g（第61天）。而后在階段Ⅳ和Ⅴ多糖含量持續增加，在第155天和第219天分別達到2.02、5.91mg/g。這可能是由于在階段Ⅳ好氧顆粒污泥為對抗施加外循環后產生的過量含氮氣體沖擊，分泌更多的PS來維持自身穩定；而在階段Ⅴ停止外循環操作后顆粒結構被破壞。此現象說明好氧顆粒結構不穩定時，可能會大量分泌LB-EPS幫助顆粒恢復結構。同時，可以推測高碳氮負荷下停止外循環會弱化顆粒結構，導致LB-EPS大量分泌。
B-EPS大量分泌。對于TB-EPS而言，0、61、155、219d的PS含量分別為12.55、15.21、16.10、12.65mg/g，PN含量為4.02、12.76、18.15、19.47mg/g，對應的PN/PS為0.32、0.84、1.13、1.54。可見，接種污泥的EPS內層PN含量也處于較低水平，而在階段Ⅲ~Ⅴ其含量逐步增加。據報道，TB-EPS中的PN與顆粒的疏水性直接相關，是維持顆粒結構穩定的重要因素。由此可知，好氧顆粒污泥受到沖擊時可能會在TBEPS中產生大量PN。同時，TB-EPS中的PS含量始終維持在較高水平。Tay等認為TB-EPS中β-多糖可提高微生物間的黏附力，強化AGS結構穩定性。因此TB-EPS中的PS可能在顆粒結構不穩定時對維持好氧顆粒污泥自身穩定也起到重要作用。Martinez等認為，高PN/PS的顆粒沉降性能較差，而較低的PN/PS則有利于改善細胞表面的疏水性，使得AGS趨于穩定。在階段Ⅲ~Ⅴ，緊密層的PN/PS呈逐漸上升趨勢，這主要是由于其PN含量快速增加所致。隨著PN/PS的升高，顆粒的沉淀性能在這三個階段逐漸變差。不過，在階段Ⅲ和Ⅳ，雖然沉淀性能有所下降，但顆粒結構并未受到明顯影響。然而到了階段Ⅴ，由于外循環操作停止，顆粒穩定性出現變差的情況。
2.4 好氧顆粒污泥的微生物群落結構變化
2.4.1 微生物群落的多樣性
系統微生物在不同碳氮負荷下的α多樣性指數見表2。OTUs是微生物樣品序列按照序列間的距離進行聚類分析的結果，用來指示特定微生物群落中的不同種類或分類單元。由表2可知，接種顆粒污泥的OTUs為121，在階段Ⅰ降至101，可能是系統中沉降性能差的污泥絮體攜帶出系統所致。此后，在階段Ⅱ至階段Ⅳ前期，OTUs都維持在較低水平。在階段Ⅳ后期OTUs增加至127，說明缺氧段增加外循環操作可以在一定程度上提高微生物種類數量。在階段Ⅴ末期，系統OTUs降至111，說明細菌群落種類數量降低。
Chao1、Ace指數代表微生物群落的豐富度，數值越大表示其物種總數越多。好氧顆粒污泥的Chao1和Ace變化趨勢基本與OTUs一致。Shannon指數是一種衡量生物群落多樣性的統計指標，其值越大則微生物多樣性越高。由表2可知，接種好氧顆粒污泥的微生物多樣性最高，在投入系統后，先逐漸下降后又有所回升。這表明好氧顆粒污泥中的微生物在經過淘汰篩選并逐漸適應環境后，多樣性大大增加。在階段Ⅴ系統雖然開始崩潰，但顆粒微生物的多樣性并沒有明顯下降。這說明僅通過生物多樣性指標并不能判定顆粒是否完全穩定。
2.4.2 微生物群落結構的演變
不同碳氮負荷下系統門和屬水平微生物相對豐度變化見圖7。在門水平上，不同碳氮負荷下好氧顆粒污泥微生物的群落組成基本沒有變化，均以Proteobacteria（變形菌門）和Bacteroidetes（擬桿菌門）為主。有研究表明，Proteobacteria和Bacteroidetes具有較強的COD和氨氮降解能力，兩者有利于維持系統良好的處理性能。同時，在接種污泥中還存在Firmicutes（厚壁菌門），Firmicutes中的芽孢桿菌具有抵抗外界有害因子的能力，且能夠促進硝化作用及維持系統穩定運行。據報道，Firmicutes很容易受到水力剪切力的影響而排出系統，這是其在運行中豐度大幅下降的原因。
由圖7（b）可知，接種好氧顆粒污泥在屬水平上的微生物種群較為豐富，基本是以uncultured_bacterium_f_Chitinophagadeae、Rubrivivax（紅長命菌屬）、Chryseobacterium（金黃桿菌）和Ferruginibacter為主。Chitinophagadeae能分解和利用多糖作為碳和能量來源。Rubrivivax可在黑暗條件下進行化能自養生長，也可利用各種有機化合物進行好氧化能異養生長。Chryseobacterium能在低溫環境生長，是一種好氧異養菌，常常伴隨著顆粒的不穩定出現。Ferruginibacter為DPAO，能利用硝酸鹽作為電子供體，具有厭氧釋磷和好氧吸磷的功能。
系統運行13d后，形成了以Dechloromonas（脫氯單胞菌）、Pseudoxanthomonas（假黃單胞菌）為主的細菌群落，同時Thauera（陶厄氏菌）和Pseudomonas（假單胞菌屬）開始少量出現。其中，占比最大的Dechloromonas（57%）是一種反硝化聚磷菌，屬于慢速生長菌，能夠在缺氧環境中利用內部儲存的多聚磷酸鹽作為能量來源釋放磷，并利用硝酸鹽作為電子受體進行反硝化。占比第二的假黃單胞菌（16%）是好氧反硝化聚磷菌，能夠利用NO3--N和NO2--N進行好氧反硝化。其他少量出現的菌屬中，Thauera（3%）是好氧顆粒污泥系統常見菌，屬于分泌EPS功能屬。它能夠在厭氧條件下降解芳香族化合物，并利用細胞內儲存的碳源進行反硝化。Pseudomonas（2%）也是典型的反硝化菌，能夠進一步將NO3--N和NO2--N轉化為氣態氮。這些菌屬都屬于慢速反硝化菌，其占比多可以控制顆粒粒徑，使顆粒結構密實，增加穩定性。
在階段Ⅱ末期（第55天），好氧顆粒結構完全恢復，系統逐漸形成了以Thauera（80%）為主導優勢菌屬的菌落結構。在階段Ⅲ和Ⅳ，對反應器施加外循環操作，系統中Thauera仍為絕對優勢菌屬，但呈現出隨著階段運行占比逐漸降低的趨勢。其中，在階段Ⅳ前期Thauera占比為68%（第100天），后期降為25%（第157天）。而且，隨著階段Ⅳ后期菌屬多樣性的增加，Rhodobacter（紅細菌屬）和Dechloromonas成為次優勢菌屬，占比分別為17%和9%。其中，Rhodobacter是一種反硝化細菌，可以在光照及缺氧條件下進行硝酸鹽的還原。由此可以看出，額外施加的外循環使得缺氧段泥水得以充分混合，大大提高了反硝化效率，系統形成以多種慢速生長的反硝化脫氮菌為優勢菌屬的群落結構，大大提高了好氧顆粒污泥結構和功能的穩定性。
在階段Ⅴ，AGS結構惡化，主要優勢菌屬為Thauera、Acidovorax、Chryseobacterium、Pseudomonas、Pseudoxanthomonas和Rhodobacter。相對于第157天好氧顆粒污泥穩定性較強時期的菌屬結構，Thauera和Rhodobacter相對豐度明顯降低，占比分別降至16%和4%。這說明關閉外循環后，缺氧環境混合效果的降低抑制了反硝化菌生長，使其豐度降低。與此同時，Acidovorax（16%）和Chryseobacterium（9%）相對豐度明顯增加。Acidovorax是顆粒污泥體系中比較常見的乙酰基高絲氨酸內酯（AHLs）產生菌，有助于增加顆粒污泥表面的疏水性，提高顆粒的穩定性。其相對豐度增加可能是顆粒結構變差的應激反應。同時，當好氧顆粒污泥系統出現局部結構破壞或微生物受損時，Chryseobacterium侵入并大量繁殖，進一步加重顆粒污泥的不穩定。在階段Ⅴ其占比增加，預示著顆粒結構已經被破壞。
3、結論
①設置外循環操作對好氧顆粒污泥的COD去除性能影響不大，但能大大提高對TN的去除性能。
②在受到沖擊時，好氧顆粒污泥TB-EPS中的PN和PS含量大量增加，提高了好氧顆粒污泥的疏水性和黏附力，強化了其結構。
③設置外循環操作更有利于慢速生長的缺氧反硝化脫氮菌屬的形成和發展，菌落豐富度增加，多樣性提高。
④在低碳氮比和較高碳氮負荷條件下通過施加外循操作提高泥水混合效果，可以增強系統反硝化能力，有效維持好氧顆粒污泥的穩定性。（來源：昆明理工大學環境科學與工程學院云南省土壤固碳與污染控制重點實驗室）
