1 引言
漆酶(EC1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶類，是重要的木質素纖維降解酶之一，最初被發現于漆樹漆液中，隨后發現某些高等真菌也能分泌該酶.由于漆酶廣泛的底物專一性，因此，其具備許多重要的生物學功能：在高等植物中具有降解木質部的功能;在大型真菌中與色素和子實體的形成及木質素的降解和分生孢子的致病性有關.染料廢水是含有染料的有色廢水，具有組成復雜、色度高、生物難降解等特點，已經成為危害水環境的主要污染源.漆酶可以對染料(如活性藍19、RB亮藍等)進行有效的脫色，因此，得到越來越多的關注和研究.根據染料結構可將染料分為蒽醌類染料、偶氮類染料、靛藍類染料和三苯甲烷類染料等.蒽醌類染料可以作為漆酶的底物被直接氧化，但有時也需要介體系統才能進行有效脫色.大多數偶氮類染料不能作為漆酶的直接底物，在漆酶/介體系統中，漆酶借助自由基反應形成酚類化合物，無需破壞偶氮鍵，因此，避免了形成有毒的芳香胺，更有利于控制環境污染，提高脫色效率.靛藍類染料是芳香族的還原性染料，因此，具有穩定的共軛結構，生物降解性較差，利用HBT、HOBT等介體系統也可以很好地完成脫色.部分三苯甲烷類染料可以在漆酶單獨作用下進行脫色，但脫色時間比較長，加入介體后可以明顯提高脫色效率.由于介體價格昂貴，因此，尋找無介體的漆酶催化染料脫色體系，或尋找新型廉價介體可以有效地降低染料廢水的處理成本.
本課題組前期研究發現，一株出芽短梗霉白化突變株Aureobasidium pullulans UVMU3-1胞外液具有常溫(30 ℃，28.5 6 U · L-1)和高溫漆酶活性(75 ℃，36.5 U · L-1)，產酶能力優于出發菌株A. pullulans NG.本研究對出芽短梗霉無色素突變株Aureobasidium pullulans UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質培養基進行優化，并研究其分子量大小、熱穩定性及對三苯甲烷類染料孔雀石綠和結晶紫的脫色作用，為該具有漆酶活性的物質的工業化生產和應用奠定理論基礎.
2 材料與方法
2.1 材料
2.1.1 供試菌株
出芽短梗霉A.pullulans UVMU3-1為本課題組誘變獲得的白化突變株.
2.1.2 主要試劑
50 mmol · L-1 愈創木酚(2-甲氧基苯酚)溶液，pH=2.4 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH=8.0 Tris-HCl緩沖液，染料孔雀石綠(MG)、結晶紫(CV)為實驗室分析純;其它試劑藥品也均為實驗室分析純.
2.1.3 培養基
固體培養基(PDA)：去皮土豆200 g · L-1、葡萄糖20.0 g · L-1、瓊脂20.0 g · L-1，pH自然;基礎產酶培養基(YND)：葡萄糖20.0 g · L-1、NaNO3 6.40 g · L-1、MgSO4 · 7H2O 0.50 g · L-1、酵母浸出粉0.20 g · L-1、KH2PO4 1 g · L-1，pH=6.0;優化產酶培養基：蔗糖 66.5 g · L-1、NaNO3 32 g · L-1、NaCl 1.08 g · L-1、酵母浸粉 0.2 g · L-1、KH2PO4 1 g · L-1，pH=6.0.
2.2 方法
2.2.1 搖瓶培養
挑取活化后的單菌落接種至50 mL液體YND培養基上，置于28 ℃、180 r · min-1搖床上振蕩培養2 d作種子液，將種子液(OD560=5.0)按1 ∶ 100接種量接種于裝有50 mL YND液體培養基的250 mL搖瓶中，于28 ℃、180 r · min-1水浴振蕩培養，7 d后收獲發酵液.
2.2.2 漆酶活性測定
將于28 ℃、180 r · min-1振蕩培養后的發酵菌液于4 ℃、10000 r · min-1下離心15 min，棄去沉淀所得上清液即為粗酶液.將500 μL的粗酶液和3 mL pH=2.4的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液混合，于75 ℃(30 ℃)保溫10 min，然后加入500 μL 50 mmol · L-1愈創木酚啟動反應.反應5 min后，用分光光度計測定在λ=465 nm處吸光值A465，每個處理做3個重復.用500 μL蒸餾水代替粗酶液作為空白對照.
酶活力的定義為：每分鐘氧化1 μmol愈創木酚所需要的酶量即為1個活力單位(U).酶活性計算公式為：U= 106 /ε × V總 /V酶 × A465 /t ，其中，V總和V酶 分別代表漆酶酶活測定反應體系的總體積及反應添加的酶液體積(mL);ε為摩爾吸光系數(L · mol-1 · cm-1).愈創木酚摩爾消光系數ε465=1.21×104 L · mol-1 · cm-1，則酶活U=132.23×A465.
2.2.3 單因素試驗
碳源：在YND基礎產酶培養基中以濃度為20 g · L-1的葡萄糖、蔗糖、半乳糖、淀粉、甘露醇和體積比2%的甘油作為碳源，28 ℃、180 r · min-1恒溫培養6 d，取粗酶液測定酶活.
氮源：在YND基礎產酶培養基中分別添加N元素終濃度為75.29 mmol · L-1的NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2SO4、NaNO3、尿素、牛肉膏、蛋白胨為氮源，在28 ℃、180 r · min-1下恒溫培養6 d，取粗酶液測定酶活.
無機鹽：基礎產酶培養基中分別添加NaCl、KCl、CaCl2、K2SO4、CuSO4、MnSO4、FeSO4 · H2O、ZnCl2、MgSO4 · 7H2O、Fe2(SO4)3，28 ℃、180 r · min-1恒溫培養6 d，取粗酶液測定酶活.
起始pH：調節基礎產酶培養基的起始pH值，28 ℃、180 r · min-1下恒溫培養6 d，取粗酶液測定酶活.
2.2.4 正交試驗
根據基礎產酶培養基單因素試驗結果，設計四因素、三水平、9組試驗對YND基礎產酶培養基進行優化(表 1).
表1 四因素三水平正交表
2.2.5 最適酶液量
以酶活單位U · L-1代表酶濃度，分別加入酶液終濃度為4.5、6、7.5、9、10.5、12 U · L-1的酶液，對終濃度20 mg · L-1的孔雀石綠染料溶液進行脫色，75 ℃水浴條件下反應，以蒸餾水代替孔雀石綠溶液作為空白對照，每隔20 min取一次樣，測定孔雀石綠溶液OD618變化，每個處理3個重復，取平均值.
2.2.6 孔雀石綠脫色作用
可見分光光度計掃描測定孔雀石綠在618 nm處具有最大吸收峰值，根據OD618值變化計算漆酶對孔雀石綠染料的脫色率.反應體系體積為4 mL，其中包括500 μL 孔雀石綠溶液，然后加入到3 mL pH=2.4的檸檬酸緩沖液中，使染料初始濃度達到20 mg · L-1，再加入500 μL粗酶液，酶液終濃度為7.5 U · L-1，以蒸餾水代替孔雀石綠溶液作為空白對照.兩組試驗分別測定常溫和高溫條件下胞外漆酶活性物質對孔雀石綠染料的脫色，常溫組在30 ℃條件下反應，高溫組在75 ℃水浴條件下反應，每隔5 min取一次樣品，測定OD618變化，按公式(1)換算脫色率(D)，每個處理3個重復，取平均值.
式中，A0為初始溶液的吸光度，A 為反應后溶液的吸光度.
2.2.7 結晶紫脫色作用
結晶紫初始濃度達到20 mg · L-1，測定OD557變化，反應體系和脫色率計算方法同2.2.6節.
2.2.8 UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質耐熱性
對28 ℃、180 r · min-1搖瓶培養7 d的UVMU3-1胞外粗酶液進行提取，將4 mL粗酶液置于10 mL離心管中，100 ℃沸水浴中分別煮沸15 min和30 min后吸取酶液測定酶活，以原粗酶液酶活作為100%，比較煮沸處理后樣品的酶活，算出相對酶活，確定漆酶活性物質熱穩定性，每個處理3個重復，取平均值.
2.2.9 UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質分子量確定
對28 ℃、180 r · min-1搖瓶培養7 d的UVMU3-1胞外粗酶液進行提取，取適量酶液放入截留量分別為10000、8000、6000~8000、3500、2000、1000、500~1000、100~500 D的透析袋中，再將透析袋放入10倍體積pH=8.0的Tris-HCl緩沖液中，常溫放置6 h后吸取透析袋內液與外液測定酶活，以原粗酶液酶活作為100%，每個處理3個重復，取平均值.
3 結果
3.1 UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質培養基優化 3.1.1 碳源對UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質的影響
在YND基礎產酶培養基中以濃度為20 g · L-1的葡萄糖、蔗糖、半乳糖、淀粉、甘露醇和體積比2%的甘油為碳源，28 ℃、180 r · min-1恒溫培養6 d，取粗酶液測定酶活.如圖 1a所示，蔗糖為碳源時產漆酶活力最高，達到21.95 U · L-1，因此，確定蔗糖為最佳碳源.蔗糖濃度為57.00 g · L-1時酶活最高，達到39.58 U · L-1(圖 1b)，因此，設置47.50、57.00、66.50 g · L-1為正交試驗蔗糖水平.
圖1 碳源對UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質的影響(a.不同碳源；b.蔗糖濃度)
3.1.2 氮源對UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質的影響
在基礎產酶培養基中分別添加NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2SO4、NaNO3、尿素、牛肉膏、蛋白胨，發現UVMU3-1利用NaNO3產漆酶活力最高(38.35 U · L-1)，因此，將最佳氮源確定為NaNO3(圖 2a).NaNO3濃度為38.40 g · L-1時酶活最高，達到55.76 U · L-1(圖 2b )，故設置正交試驗NaNO3水平為32.00、38.40、44.80 g · L-1.
圖2 氮源對UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質的影響(a.不同氮源；b.NaNO3濃度)
3.1.3 無機鹽對UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質的影響
UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質酶活結果顯示，CuSO4、FeSO4 · H2O、ZnCl2、MgSO4 · 7H2O、Fe2(SO4)3會抑制漆酶活性物質產生和分泌，K2SO4及MnSO4對漆酶活性無明顯影響.NaCl、CaCl2、KCl對UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質均有明顯的促進作用，其中以NaCl作為無機鹽時UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質的酶活力最高(49.28 U · L-1)，為UVMU3-1產耐熱性胞外 漆酶活性物質培養基最佳無機鹽(圖 3a).當NaCl濃度為1.20 g · L-1時，酶活最高可達到55.89 U · L-1(圖 3b)，后續試驗設置1.08、1.20、1.32 g · L-1為正交試驗NaCl的3個水平.
圖3 無機鹽對UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質的影響(a.不同無機鹽；b. NaCl濃度)
3.1.4 初始pH對UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質的影響
調節基礎產酶培養基的初始pH值，28 ℃、180 r · min-1下恒溫培養6 d，取粗酶液測定酶活，結果如圖 4所示.初始pH為7.0時UVMU3-1產漆酶活力最高，達到51.48 U · L-1.因此，設置起始pH為6.0、7.0、8.0為正交試驗起始pH值水平.
圖4 起始pH對UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質的影響
3.1.5 正交試驗進行培養條件優化
正交試驗結果表明，UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質最優水平組合為A3B2C1D1，即蔗糖66.50 g · L-1，NaNO3 38.40 g · L-1，NaCl 1.08 g · L-1，起始pH=6.0.極差分析比較發現，RD>RA>RC>RB，影響UVMU3-1菌株產耐熱性胞外漆酶活性物質能力的因素強弱依次為：起始pH>蔗糖>NaCl>NaNO3(表 2).
表2 正交試驗結果
3.1.6 培養條件優化后UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質酶活曲線
以優化前后的培養基在相同條件下對UVMU3-1進行培養，測定酶活隨時間變化曲線，結果見圖 5.優化后UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質周期顯著提前，第3 d酶活出現高峰值，達到57.92 U · L-1，同時，酶活隨著培養時間的增加而增加，培養7 d時酶活達到94.81 U · L-1
圖5 UVMU3-1高溫酶活曲線
3.2 UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質對三苯甲烷類染料脫色作用
3.2.1 酶濃度對脫色效果的影響
酶濃度與孔雀石綠脫色效果呈正向關系，酶濃度越高對其脫色效果越好，但當酶濃度達到7.5 U · L-1以上時，脫色效果差別不顯著(圖 6)，因此，選取酶濃度為7.5 U · L-1研究胞外耐熱性漆酶活性物質對三苯甲烷類染料脫色作用.
圖6 不同酶濃度對孔雀石綠脫色效果
3.2.2 UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質對三苯甲烷類染料脫色作用
粗酶液對孔雀石綠具有良好的脫色效果，7.5 U · L-1粗酶液與20 mg · L-1孔雀石綠在75 ℃反應5 min后，脫色率為76.3%，反應35 min后達到96.3%;而常溫條件下，反應35 min后脫色率僅達到23.2%(圖 7 a).7.5 U · L-1粗酶液與20 mg · L-1結晶紫75 ℃反應5 min后脫色率為77.5%;反應35 min后達到95.3%，是常溫脫色率的8.9倍(圖 7b ).
圖7 UVMU3-1胞外耐熱性漆酶活性物質對三苯甲烷類染料脫色作用(a.孔雀石綠；b.結晶紫)
3.3 UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質性質 3.3.1 UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質熱穩定性
如圖 8所示，將粗酶液沸水浴中煮沸15 min后高溫酶活殘留92.33%，煮沸30 min后高溫酶活殘留72.50%，結果說明，該耐熱性胞外漆酶活性物質具有良好的耐熱性.
圖8 UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質熱穩定性
3.3.2 UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質分子量
如圖 9所示，使用截留量大于1000 D透析袋時，酶活90%存在于透析外液，透析內液幾乎沒有;當透析袋截留量為1000、500~1000、100~500 D時，透析內液出現酶活，但透析外液的酶活依然占到85%左右，結果說明該高溫漆酶分子量小于1000 D，在0~1000 D之間.
圖9 UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質分子量
4 討論
Maalej-Kammoun等(2009)在研究中指出，使用栓菌漆酶對孔雀石綠脫色2 h后，脫色率為80%.從子囊菌Paraconiothyrium variabile中提取漆酶PvL，并研究了該耐熱性胞外漆酶活性物質對孔雀石綠染料溶液脫色效果，發現在酶濃度4 U · mL-1時，常溫條件下反應15 min后，脫色率達到68%，1 h后脫色率達到85%.UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質對三苯甲烷類染料在高溫條件下的脫色效果優于現有文獻道過的真菌胞外漆酶.并且由于三苯甲烷類染料不是漆酶的直接反應底物，大多數情況下需要添加某種介體才能達到不錯的脫色效果.同時，介體價格往往是比較昂貴的，這就大大提高了工業化脫色成本.但UVMU3-1產耐熱性胞外漆酶活性物質對孔雀石綠和結晶紫進行脫色時沒有添加任何一種介體，同時，在高溫短時間內可以對孔雀石綠和結晶紫幾乎完全脫色，這樣就降低了脫色成本，使其更具有工業化生產價值.
真菌漆酶對孔雀石綠或結晶紫等三苯甲烷類染料的脫色機理及脫色產物，到目前為止還沒有一個準確完整的定論.利用HPLC和HPLC-MS在絲狀真菌Cunninghamella elegan ATCC36112漆酶降解孔雀綠的反應物中，只檢測到孔雀綠和無色孔雀綠依次去甲基后的脫色反應產物(圖 10).國外有研究表明(Papinutti et al., 2004)，當孔雀綠分子側鏈上的甲基被破壞時，其在可見光的最大波長發生紅移，孔雀石綠的溶液從綠色變成淺藍色.其它研究報道表明，環境中的自由基可介導結晶紫的聚合;而劉友勛等(2008)的研究指出，孔雀石綠和結晶紫結構類似，同屬于三苯甲烷染料，可能漆酶介體系統對孔雀石綠的作用機制類似：漆酶氧化介體形成介體自由基，在自由基的介導作用下孔雀綠被聚合成黑色沉淀物，最后導致孔雀石綠溶液由綠色逐漸變成無色.具體參見污水寶商城資料或http://www.dongaorq.cn更多相關技術文檔。
圖10 絲狀真菌Cunninghamella elegan ATCC36112漆酶降解孔雀綠的代謝途徑
