1 引言

　　生物法污水處理是被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用的技術(shù)，此方法具有處理徹底、有機(jī)物降解率高、二次污染小、能耗低和運(yùn)行管理方便等優(yōu)點(diǎn)，但由于水溫影響到微生物的生長(zhǎng)和繁殖，使得溫度成為生物污水處理效率的限制因子(Namsivayam et al., 2011;Jin et al., 2005).我國(guó)絕大部分被污染的海洋、湖泊冬季平均溫度多在4 ℃以下，因此在生物污水處理中溫度是影響生物污水處理效果的一個(gè)重要因素.

　　低溫微生物指生活在低溫環(huán)境下的微生物.這類微生物可分為兩類.一類是必須生活在低溫條件下，在0 ℃可生長(zhǎng)繁殖，最適溫度不超過15 ℃，最高溫度不超過20 ℃的微生物，稱之為嗜冷菌(Psychrophiles);另一類是能在低溫條件下生長(zhǎng)，在0～5 ℃可生長(zhǎng)繁殖，最高生長(zhǎng)溫度可達(dá)20 ℃以上的微生物稱之為耐冷菌(Psychrotrophs)(辛秀明，1998;Whyte et al., 1996).

　　污水處理效率通常用污水中有機(jī)物的去除率表示，而化學(xué)需氧量(COD)是衡量水中有機(jī)物質(zhì)含量多少的指標(biāo)，其值越大，說明水體受有機(jī)物的污染越嚴(yán)重，因此，通常可以用 COD 的去除率表示污水處理效率的高低(Wu et al., 2011).污水生化處理的實(shí)質(zhì)是微生物所產(chǎn)生的多種酶催化一系列生物氧化還原反應(yīng)從而達(dá)到去除污水中有機(jī)物的目的.脫氫酶(DHA)能使被氧化的有機(jī)物氫原子活化并傳遞給特定的受氫體，因而其活性能反映處理工藝中活性微生物量及其對(duì)有機(jī)物的代謝能力(Yang et al., 2002).低溫菌的冷適應(yīng)機(jī)制之一是其體內(nèi)參與代謝的酶在低溫下仍具有高效催化活性.近年來，關(guān)于常溫條件下COD的去除率與微生物的脫氫酶活性相互關(guān)系的研究很多(Park and Lee， 2005)，而有關(guān)5 ℃以下的低溫環(huán)境的研究卻很少，因此，尋找一株在低溫和常溫環(huán)境下同時(shí)具有高效降解性的耐冷菌對(duì)污水處理具有重大意義.本項(xiàng)研究從低溫活性污泥中分離出適合低溫污水處理的高效耐冷菌，將該菌進(jìn)行分類鑒定，并通過對(duì)比該菌株在低溫(4 ℃)和常溫(25 ℃)條件下對(duì)污水中COD的去除率以及體系DHA活性，表明該菌株對(duì)低溫環(huán)境條件下的污水處理具有潛在的應(yīng)用價(jià)值

　　2 材料與方法

　　2.1 樣品采集

　　活性污泥取自青島李村河污水處理廠曝氣池.

　　2.2 模擬生活污水

　　COD為800 mg · L-1的模擬生活污水(崔麗等，2007)：葡萄糖 0.1700 g，可溶性淀粉 0.1600 g，CH3COONa 0.2330 g，NH4Cl 0.0255 g，蛋白胨 0.1580 g，牛肉膏 0.0600 g，(NH4)2SO4 0.028 4 g，KH2PO4 0.0700 g，Na2CO3 0.0600 g，pH 5.5~6.0，去離子水1.0 L.

　　COD為400 mg · L-1的模擬生活污水：葡萄糖 0.0850 g，可溶性淀粉 0.0800 g，CH3COONa 0.1165 g，NH4Cl 0.0255 g，蛋白胨 0.0790 g，牛肉膏 0.0300 g，(NH4)2SO4 0.0284 g，KH2PO4 0.0700 g，Na2CO3 0.0600 g，pH 5.5~6.0，去離子水1.0 L.

　　2.3 主要儀器與試劑

　　電泳儀、PCR儀購自Bio-RAD公司，紫外可見分光光度計(jì)購自島津公司，臺(tái)式冷凍振蕩器購自太倉華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司.

　　Taq聚合酶、pMD19-T載體、DNA Marker、T4連接酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，引物合成和DNA測(cè)序由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司完成，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純.

　　2.4 高效耐冷菌的篩選

　　將50 mL活性污泥樣品放入滅菌后的裝有小玻璃珠的250 mL錐形瓶?jī)?nèi)，加入50 mL無菌水，30 ℃100 r · min-1搖床振蕩1 h，使活性污泥里的微生物充分釋放出來.采用稀釋涂布平板法，將處理后的活性污泥制成10-3、10-4、10-5三個(gè)濃度梯度的活性污泥稀釋液，涂布到LB培養(yǎng)基上，4 ℃培養(yǎng)5~7 d，挑取具明顯生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)且形態(tài)、色澤不同的大型菌落，進(jìn)行平板劃線純化，反復(fù)進(jìn)行3次，同時(shí)用顯微鏡觀察菌落純度，直至獲得純培養(yǎng).

　　將種子液按7%的接種量接入模擬生活污水(接種之前要將種子液離心，棄上清，后用等體積的無菌水重懸、離心、棄上清以洗去殘留的LB液體培養(yǎng)基，重復(fù)洗3次即可，下同)，4 ℃搖床培養(yǎng)，150 r · min-1下培養(yǎng)96 h，裝液量為每100 mL/250 mL三角瓶;發(fā)酵液經(jīng)5000 r · min-1，25 min離心取上清液測(cè)定COD，計(jì)算COD的去除率，同時(shí)測(cè)定體系DHA活性.

　　2.5 高效耐冷菌的鑒定

　　參照文獻(xiàn)對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)觀察和生理生化試驗(yàn)(東秀珠和蔡妙英，2001).另外對(duì)菌株進(jìn)行16S rDNA鑒定，具體方法如下.直接用菌體作為模版，選用16S rDNA通用引物27f：(5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′)1492r：(5′-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3′)，擴(kuò)增體系(25 μL)：10×Taq buffer2.5 μL，Mg2+(25 mmol · l-1)2.0 μL，dNTP(2.5 mmol · l-1)2.0 μL，引物(25 pmol · μL -1)各0.5 μL，Taq酶 0.3 μL，ddH2O 17.2 μL.反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次，72 ℃終末延伸10 min，10 ℃保溫10 min.

　　PCR產(chǎn)物經(jīng)回收試劑盒純化，然后進(jìn)行T-A克隆，挑取陽性克隆子送南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序.測(cè)序結(jié)果提交NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對(duì)分析(Genbank序列登陸號(hào)KJ125513)，選取同源性較高的序列，利用MEGA5.2軟件，基于鄰接法(Neighbor Joining method)構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹.

　　2.6 不同因素對(duì)高效耐冷菌處理污水的影響

　　2.6.1 運(yùn)行時(shí)間對(duì)COD去除率的影響

　　裝液量為100 mL污水/250 mL三角瓶，投加耐冷菌后分別于4 ℃、25 ℃、150 r · min-1振蕩處理96 h，每隔12 h取1次樣，培養(yǎng)物經(jīng)5000 r · min-1，25 min離心取上清液測(cè)定COD，計(jì)算其在低溫、常溫下COD的去除率.

　　2.6.2 初始COD對(duì)COD去除率及體系DHA活性影響

　　7%的接種量將耐冷菌接種到初始COD分別為400 mg · L-1、800 mg · L-1的模擬生活污水中，分別于4 ℃、25 ℃搖床培養(yǎng)96 h，計(jì)算其在低溫、常溫下COD的去除率及DHA活性.

　　2.6.3 接種量對(duì)COD去除率及體系DHA活性影響

　　分別以3%、5%、7%、10%的比例投加耐冷菌，分別于4 ℃、25 ℃搖床培養(yǎng)96 h，計(jì)算其在低溫、常溫下COD的去除率及DHA活性.

　　2.6.4 初始pH對(duì)COD去除率及體系DHA活性影響

　　使用1 mol · L-1的H2SO4和1 mol · L-1的NaOH將模擬污水pH值分別調(diào)為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，投加耐冷菌后分別于4 ℃、25 ℃搖床培養(yǎng)96 h，計(jì)算其在低溫、常溫下COD的去除率及DHA活性.

　　2.7 測(cè)定項(xiàng)目及分析方法

　　COD：重鉻酸鉀法;DHA活性：氯化三苯基四氮唑(TTC)比色法(齊魯青等，2012; Li et al., 2012);測(cè)定溫度為污水降解溫度;實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，每次取3個(gè)重復(fù)樣，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取3個(gè)重復(fù)樣的平均值，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差分析(圖 3～圖 6中誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差).單因素和多因素方差分析(ANOVA)在SPSS16.0完成.

　　3 結(jié)果

　　3.1 高效耐冷菌的篩選

　　4 ℃條件下，從LB培養(yǎng)基分離到5株菌落形態(tài)大、生長(zhǎng)速度快的耐冷菌，依次命名為DW1～DW5.

　　模擬污水實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5株菌在低溫時(shí)對(duì)COD的去除率在30.4%～67.7%之間，其中菌株DW1的脫氫酶活性(以TF計(jì)，下同)和COD的去除率最高，其余的4株細(xì)菌的去除率都低于55.0%(表 1).由此可見菌株DW1對(duì)污水中COD的去除效果較好，因此選擇菌株DW1作為研究對(duì)象，用于后續(xù)研究.

表1 耐冷菌對(duì)COD的去除率及其脫氫酶活性

　　3.2 菌株DW1的鑒定

　　菌株DW1在LB培養(yǎng)基上的菌落及菌體形態(tài)見圖 1.菌株DW1菌落呈淺粉紅色，圓形、濕潤(rùn)，邊緣整齊.

 圖 1 DW1的菌落形態(tài)(a)以及光鏡下的菌體形態(tài)(b)

　　通過對(duì)菌株DW1進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增、克隆測(cè)序后得到大小為1498 bp的序列，系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示(見圖 2)DW1與Pseudomonas gessardii (NR_024928.1)聚于同一個(gè)分支上，序列相似性達(dá)99%，結(jié)合形態(tài)觀察和生理生化特性(表 2)，DW1初步鑒定為Pseudomonas sp..

 圖 2 基于16S rDNA序列菌株DW1的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹 

 表2 菌株DW1部分生理生化特性

　　3.3 菌株DW1處理模擬污水的影響因素

　　3.3.1 運(yùn)行時(shí)間對(duì)COD去除率的影響

　　低溫條件下，菌株DW1對(duì)污水中COD的去除率隨著運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng)增加(圖 3)，運(yùn)行60 h后，COD的去除率趨于穩(wěn)定，達(dá)到67%;常溫條件下，菌株DW1對(duì)污水中COD的去除率先迅速升高，運(yùn)行24 h去除率達(dá)到最大值73%，后出現(xiàn)小幅下降，最后趨于穩(wěn)定.通過菌株DW1在低溫和常溫對(duì)污水中COD去除率的比較，運(yùn)行36 h內(nèi)，菌株DW1在常溫對(duì)污水中COD的去除率明顯高于低溫;36 h后兩者趨于穩(wěn)定，且在常溫對(duì)污水中COD的去除率略高于低溫.

 圖 3 運(yùn)行時(shí)間對(duì)COD去除率的影響 

　　3.3.2 初始COD對(duì)COD去除率及體系DHA活性影響

　　菌株DW1對(duì)初始 COD 高濃度污水COD的去除率較高，COD的去除率與DHA活性正相關(guān)(圖 4).在低溫和常溫條件下，去除率分別為69.8%和76.2%; 同樣高濃度污水DHA酶活性也較高，在低溫和常溫分別為9.89 μg · mL-1 · h-1和12.13 μg · mL-1 · h-1. 因此，本研究中菌株DW1較適合初始 COD 負(fù)荷較高的污水處理.

 圖 4 初始COD對(duì)COD去除率及DHA活性的影響(注：不同小寫字母表示同一溫度下不同處理的COD去除率的差異顯著(p<0.05)，不同大寫字母表示同一溫度下不同處理的COD去除率的差異極顯著(p<0.01)，下同) 

　　3.3.3 接種量對(duì)COD去除率及體系DHA活性影響

　　低溫時(shí)，污水中COD去除率在65%左右，其中接種量為7%時(shí)最高，為69.9%(圖 5)，同時(shí)DHA活性介于6.5～11.0 μg · mL-1 · h-1之間，接種量為3%時(shí)，DHA活性最高，接種量為5%、7%時(shí)次之，接種量為10%時(shí)，DHA活性最低.常溫時(shí)，污水中COD去除率在75%左右，維持在較高水平，DHA活性介于8.3～15.2 μg · mL-1 · h-1之間，接種量為3%時(shí)，DHA活性最高，接種量為5%、7%時(shí)次之，接種量為10%時(shí)，DHA活性最低.

　　菌株DW1在接種量為7%時(shí)，COD的去除率最高，而接種量為3%時(shí)，DHA活性最高.推測(cè)原因?yàn)榻臃N量為3%時(shí)，運(yùn)行96 h細(xì)菌仍然處于對(duì)數(shù)期，DHA活性最高，但是由于細(xì)菌未達(dá)到最大生長(zhǎng)量，因此，COD去除率并未達(dá)到最高;接種量為5%時(shí)，運(yùn)行96 h細(xì)菌處于穩(wěn)定期，此時(shí)COD去除率達(dá)到最大.接種量為10%時(shí)，運(yùn)行96 h細(xì)菌處于衰亡期，因此，DHA活性和COD去除率均處于最低狀態(tài).

 圖 5 接種量對(duì)COD去除率及DHA活性的影響 

　　3.3.4 初始pH對(duì)COD去除率及體系DHA活性影響

　　如圖，pH對(duì)菌株的降解效能有明顯的影響.低溫時(shí)，污水pH值為7.0時(shí)，污水中COD去除率以及DHA活性最高，分別為71.2%、11.35 μg · mL-1 · h-1，pH為6.0、8.0時(shí)，COD去除率以及DHA活性次之，pH為5.0、9.0時(shí)，體系中COD去除率和DHA活性明顯降低，污水處理效果最差(圖 6).常溫時(shí)，污水中COD去除率和DHA活性的變化趨勢(shì)與低溫相同，pH為7.0時(shí)，COD去除率和DHA活性最高，分別為78.8%和15.11 μg · mL-1 · h-1;可見菌株DW1較適合初始pH為7.0的污水處理.

圖 6 不同初始pH對(duì)COD去除率及DHA活性的影響

　　4 討論

　　目前純培養(yǎng)微生物在低溫條件下對(duì)含有多種碳源的模擬污水COD的去除率都較低.姜安璽等(2002)采用耐冷復(fù)合菌群處理低溫生活污水，CODMn由單一菌群35%的去除率提高到復(fù)合菌群89%.徐成斌等(2014)分離得到一株以柴油為碳源的降解菌株Q21，該菌在15 ℃條件下運(yùn)行72 h時(shí)對(duì)柴油的降解率為71.5%.單一菌株對(duì)COD的去除率往往比混合菌群的低，原因是溫度在很大程度上影響著微生物的生理活動(dòng)，對(duì)微生物個(gè)體的生長(zhǎng)、繁殖、新陳代謝及種群分布和種群數(shù)量起著決定作用，從而影響了整個(gè)污水處理效率.混合菌群中微生物的種類較多，不同的微生物最適的碳源不同，因此在處理含有多種碳源的模擬污水時(shí)COD的去除率相對(duì)較高.本研究篩選出的菌株DW1在4 ℃條件下對(duì)含有多種碳源的模擬污水COD的去除率高達(dá)67.7%，同時(shí)，該菌在4 ℃和25 ℃條件下均具有較高的脫氫酶活性.

　　假單胞菌對(duì)低溫污水中的有機(jī)物具有高效降解率.賁岳等(2008)從4 ℃生活污水處理系統(tǒng)中篩選出 6 株耐冷菌，該混合菌群對(duì)中、低溫污水COD 的去除率可分別達(dá)到 80.9%和73.4%，其中一株為假單胞菌;徐巧等(2010)從土壤中篩選出一株高效耐冷菌黃假單胞菌，該菌株在5 ℃下對(duì)以葡萄糖為唯一碳源的模擬污水COD的去除率在90%以上.

　　如圖 3所示菌株DW1在低溫時(shí)COD去除率隨著時(shí)間的增加而增加，96 h達(dá)到最高67%;但是在常溫時(shí)COD去除率在培養(yǎng) 24 h 達(dá)到最高，73%，在36 h時(shí)略有下降，推測(cè)可能是運(yùn)行36h時(shí)，菌種微生物發(fā)生了自溶現(xiàn)象，導(dǎo)致 COD去除率有所降低.隨后，菌株DW1對(duì)COD去除率達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài).導(dǎo)致菌株DW1菌體自溶的原因可能有以下兩個(gè)(李雪芝等，2005)：①隨著時(shí)間的推移菌株本身對(duì)廢水污染物的降解能力變得較差，而時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)致使吸附到菌體上的物質(zhì)脫吸，或由于不適應(yīng)環(huán)境而死亡的菌體自溶或菌株的分泌物所致;②微生物對(duì)碳源不斷利用，某種碳源的消失會(huì)導(dǎo)致微生物的不適應(yīng)，出現(xiàn)部分菌體自溶，隨著微生物逐漸適應(yīng)環(huán)境，COD去除率也開始升高.

　　培養(yǎng)時(shí)間是影響COD去除率的重要影響因子.周圍等(2012)分離篩選到一株具有高效降解苯環(huán)化合物的菌株P(guān)M8，30 ℃條件下，菌株P(guān)M8在36 h時(shí)對(duì)酒廠廢水CODCr去除率較低(<55%)，72 h時(shí)菌株P(guān)M8對(duì)酒廠廢水COD去除率為83.68%，接近于國(guó)家對(duì)污水排放的三級(jí)排放標(biāo)準(zhǔn);黃華(2012)通過馴化培養(yǎng)得到降解黃藥生產(chǎn)廢水的混合細(xì)菌，該混合降解菌在30 ℃時(shí)對(duì)配制丁基黃藥模擬廢水、0#柴油、藥劑廠黃藥車間廢水中CODCr去除率隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加，80 h時(shí)對(duì)配制丁基黃藥模擬廢水、0#柴油CODCr去除率分別是70%、35%，10 d后對(duì)藥劑廠黃藥車間廢水中CODcr去除率為78%.本實(shí)驗(yàn)分離到的菌株DW1在低溫和常溫條件下，對(duì)COD為800 mg · L-1的多種碳源模擬污水COD去除率分別達(dá)到67%、73%，去除效果明顯好于國(guó)內(nèi)報(bào)道的COD降解菌株.

　　菌株DW1適合初始 COD 負(fù)荷較高的污水處理.原因可能是當(dāng)進(jìn)水中COD濃度較高時(shí)，污水處理系統(tǒng)中的營(yíng)養(yǎng)水平會(huì)直接影響微生物的代謝，營(yíng)養(yǎng)水平較高時(shí)，能保證微生物正常增殖使生物量增多，高的生物量進(jìn)而使DHA活性更高，對(duì)有機(jī)物的降解率增大(Li et al., 2007).因此，菌株DW1對(duì)高濃度有機(jī)污水具有一定的應(yīng)用前景.同時(shí)，COD的去除率與DHA活性正相關(guān)，原因是廢水生化處理的實(shí)質(zhì)是微生物所產(chǎn)生的多種酶催化一系列生物氧化還原反應(yīng)從而達(dá)到去除污水中有機(jī)物的目的，其中，DHA能使被氧化的有機(jī)物氫原子活化并傳遞給特定的受氫體，因而其活性能反映處理工藝中活性微生物量及其對(duì)有機(jī)物的代謝能力(Margesin and Schinner， 1997).具體參見污水寶商城資料或http://www.dongaorq.cn更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　該菌株適合處理中性污水.pH影響COD 的去除率主要是因?yàn)閜H的改變影響了DHA的活性，而pH影響酶活力的原因可能有以下幾個(gè)方面：過酸或過堿可以使酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，引起酶構(gòu)象的改變，酶活性的喪失;當(dāng)pH改變不很劇烈時(shí)，酶雖未變性，但活力受到影響;pH能夠影響維持酶分子空間結(jié)構(gòu)的有關(guān)基團(tuán)解離，從而影響酶活性部位的構(gòu)象，進(jìn)而影響酶的活性(Dutta and Banecrjee， 2006).