1 前言(Introduction)

　　生物固氮是指固氮生物利用體內(nèi)的固氮酶將N2催化還原成NH3(Howarth et al.，1988a)的過(guò)程.它是海洋和湖泊等生態(tài)系統(tǒng)初級(jí)生產(chǎn)力的限制性因素，影響著C和N的生物地球循環(huán).固氮作用不僅出現(xiàn)在貧營(yíng)養(yǎng)的土壤、海洋、湖泊、河口和河流等生態(tài)系統(tǒng)中;還出現(xiàn)在氮營(yíng)養(yǎng)充足甚至富營(yíng)養(yǎng)的海洋和湖泊等水環(huán)境中.

　　固氮速率的測(cè)定方法主要有總氮變量法、15N同位素法、乙炔還原法(Beversdorf et al., 2013;Glass et al., 2010)等.這些方法在不同的環(huán)境介質(zhì)(土壤、水環(huán)境、生物等)的固氮速率中均被不同程度的廣泛使用，并反映出不同的優(yōu)缺點(diǎn).總氮變量法是直接測(cè)定系統(tǒng)N變量的方法，其操作和計(jì)算簡(jiǎn)單，但測(cè)量誤差大、靈敏度低、準(zhǔn)確度差、實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng);15N同位素法是測(cè)定固N(yùn)量較靈敏方法，靈敏度比總氮變量法高40~100倍左右，且直接采用15N標(biāo)記的氮?dú)?或溶解態(tài)氮?dú)?作為固氮過(guò)程底物，具有較高的可靠性，但其實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)、操作繁冗且須配備同位素和質(zhì)譜儀等，測(cè)定費(fèi)用高，更重要的是，由于15N2在水體中需要較長(zhǎng)時(shí)間的溶解平衡，如果測(cè)定過(guò)程時(shí)間較短，往往由于平衡不夠充分而導(dǎo)致固氮速率的低估.乙炔還原法(Acetylene Reduction Technique，簡(jiǎn)稱(chēng)ART)(Hardy et al., 1968;Stewart et al., 1967)是一種較經(jīng)典的測(cè)定方法，通過(guò)測(cè)定固氮生物體中的固氮酶催化C2H2還原成C2H4(Dilworth，1966;Rusness and Burris， 1970)的量來(lái)計(jì)算固氮生物催化N2還原成NH3量的一種間接測(cè)定固氮速率方法，其計(jì)算需要乙炔還原與氮?dú)膺�原的當(dāng)量系數(shù)，并通過(guò)當(dāng)量系數(shù)轉(zhuǎn)換成固氮速率.該方法具有試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、方便、耗費(fèi)少，高準(zhǔn)確度和精度，靈敏度比15N同位素法高103~104倍(Hardy et al., 1973)，且其產(chǎn)物C2H4穩(wěn)定，便于儲(chǔ)存，因而至今仍被廣泛用于各種水體、生物膜、沉積物等水環(huán)境固氮作用的研究中.

　　太湖富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題長(zhǎng)期受到關(guān)注，其根本原因是湖泊水體中N、P等營(yíng)養(yǎng)物的過(guò)量輸入.湖泊中N的外部來(lái)源主要包括河流輸入、面源輸入、大氣沉降和生物固氮等.前3種來(lái)源已有大量的的監(jiān)測(cè)和研究;但太湖水體生物固氮來(lái)源的研究和報(bào)道目前仍十分匱乏.McCarthy等(2003)在湖心區(qū)沉積物-水界面通量的研究中發(fā)現(xiàn)了水體向沉積物遷移的氮?dú)馔�量，推測(cè)該區(qū)域可能發(fā)生固氮作用，但仍缺乏直接證據(jù).已有許多湖泊的固氮研究表明，生物固氮是部分湖泊富營(yíng)養(yǎng)化過(guò)程中的重要氮源.水體的固氮作用，不僅會(huì)影響湖泊的氮收支平衡及污染物容量，還能對(duì)水體污染防治措施的有效性產(chǎn)生影響.

　　太湖，位于長(zhǎng)江中下游平原，是一個(gè)典型的大型淺水富營(yíng)養(yǎng)化湖泊，水域面積2338 km2，平均水深2 m，是我國(guó)第三大淺水湖泊(張路等，2004).太湖富營(yíng)養(yǎng)化機(jī)理和控制策略等迄今已有較多研究(崔廣柏等，2009;秦伯強(qiáng)等，2011)，但關(guān)于富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題解決方法中營(yíng)養(yǎng)鹽控制策略的有效性研究成果甚少.

　　本文擬通過(guò)原位模擬試驗(yàn)方法對(duì)太湖水體的固氮作用進(jìn)行研究，探索太湖水體的固氮作用的存在及其時(shí)空變化特征，為太湖氮平衡的構(gòu)建和完善、營(yíng)養(yǎng)鹽總量控制和削減提供科學(xué)依據(jù).

　　2 材料和方法

　　2.1 樣品的采集和處理

　　自2011年5月到2012年2月，選擇全湖33個(gè)樣點(diǎn)(圖 1)按季度(2011年5月(春季)、2011年8月(夏季)、2011年11月(秋季)、2012年2月(冬季))進(jìn)行固氮速率的測(cè)定.采樣時(shí)用GPS進(jìn)行定位，現(xiàn)場(chǎng)用便攜式多參數(shù)水質(zhì)分析儀(YSI)測(cè)定并記錄常規(guī)水質(zhì)參數(shù)、風(fēng)速風(fēng)向儀測(cè)定現(xiàn)場(chǎng)風(fēng)數(shù)據(jù).用5 L有機(jī)玻璃采水器采集0.6 m深度內(nèi)的混合水樣，根據(jù)水體中藍(lán)藻生物量的多寡對(duì)水樣進(jìn)行不同程度的預(yù)濃縮處理(25#浮游生物網(wǎng)(200目))，將原水樣和濃縮液保存于聚乙烯塑料瓶中.采樣當(dāng)日15點(diǎn)前完成采樣和水樣固氮速率的測(cè)定.

　　圖1 太湖樣點(diǎn)圖

　　2.2 研究方法

　　2.2.1 水體固氮作用測(cè)定

　　本文用ART法(Granhall and Lundgren， 1971;Stewart et al., 1967)對(duì)采集水樣進(jìn)行固氮速率的測(cè)定.固氮生物體內(nèi)的固氮酶既能將N2催化固定成NH3，也能催化C2H2還原成C2H4.C2H2和N2與固氮酶結(jié)合部位并不相同，兩者是固氮酶催化反應(yīng)的非競(jìng)爭(zhēng)性底物(Hwang et al., 1973)，因此用ART不但能準(zhǔn)確測(cè)定固氮速率，而且測(cè)定結(jié)果不受試驗(yàn)環(huán)境中N2的影響.操作過(guò)程簡(jiǎn)述如下：

　　取一定量濃縮(或原水)樣于培養(yǎng)瓶中，保持瓶?jī)?nèi)水體和頂空的體積比為5：1，合上膠塞，用注射器注入一定體積C2H2氣體(10%，V/V)，保持培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的C2H2分壓為10132.5 Pa(Granhall and Lundgren， 1971;Hardy et al., 1973)，在氣體注入口涂上硅橡膠防止漏氣.搖勻后將培養(yǎng)瓶懸掛放置在太湖湖泊生態(tài)系統(tǒng)研究站棧橋，控制水深為30 cm左右，以保持與樣點(diǎn)基本一致的溫度、光照和風(fēng)浪擾動(dòng)等.培養(yǎng)時(shí)間為2 h(Beversdorf et al., 2013;Stewart et al., 1967)，每個(gè)樣設(shè)3個(gè)平行.培養(yǎng)結(jié)束后，向培養(yǎng)瓶中抽取一定體積頂空氣體樣品轉(zhuǎn)移預(yù)先抽過(guò)真空的玻璃瓶中室溫保存，用氣相色譜儀(GC5970II，填充柱：Porapak N;FID檢測(cè)器)對(duì)氣體樣品進(jìn)行檢測(cè)分析。

　　2.2.2 固氮速率計(jì)算

　　固氮酶催化N2和C2H2還原的方程式可以表述為：

 

　　在提供產(chǎn)出1 mol NH3所需電子數(shù)的情況下，固氮酶會(huì)催化產(chǎn)出1.5 mol C2H4，則1.5是C2H4-NH3的理論當(dāng)量轉(zhuǎn)換系數(shù).盡管該系數(shù)在不同的生態(tài)系統(tǒng)中會(huì)存在一定差異(1.2~2.1)(Bergersen，1970;Hardy et al., 1973;Stewart et al., 1968)，但基本保持在理論值1.5附近.事實(shí)上，多數(shù)固氮作用的研究(Brooks et al., 1971;Teal et al., 1979)也都采用1.5作為兩者的轉(zhuǎn)換系數(shù).為了便于與不同生物固氮研究成果進(jìn)行比較，本研究采用1.5作為兩者的轉(zhuǎn)換系數(shù).

　　氣相色譜儀對(duì)氣體樣品的檢測(cè)采用保留時(shí)間進(jìn)行定性分析，峰高進(jìn)行定量分析.

　　固氮速率計(jì)算公式：

 

　　式中，Anf為固氮速率(ng · L-1 · h-1);P樣品、P空白為樣品、空白樣中的C2H4的量(μL);r為水樣濃縮比例;14為N摩爾質(zhì)量(g · mol-1);1.5為固氮速率轉(zhuǎn)換系數(shù);t為培養(yǎng)時(shí)間(h);V水為試驗(yàn)水樣體積(L).

　　3 結(jié)果

　　3.1 固氮作用的空間差異

　　太湖水體固氮速率表現(xiàn)出明顯的空間差異(表 1，圖 2，圖 3).固氮速率的全年最高值出現(xiàn)在梅梁灣(32號(hào)點(diǎn)，Anf=16.60 ng · L-1 · h-1);最低值出現(xiàn)在貢湖灣(13號(hào)點(diǎn)，Anf=0).梅梁灣和竺山灣是固氮速率較高的湖區(qū)，貢湖灣、湖心區(qū)和西岸湖區(qū)的固氮速率總體較低.

　　表1 太湖各樣點(diǎn)水體固氮速率年均值

　　圖2 太湖不同湖區(qū)固氮速率

　　圖3 太湖水體固氮速率

　　在春季，太湖西岸湖區(qū)(0.17 ng · L-1 · h-1)的固氮速率較高，而東岸湖區(qū)(0.08 ng · L-1 · h-1)的固氮速率較低.夏季太湖水體的最高固氮速率出現(xiàn)在北部湖區(qū)梅梁灣(14.64 ng · L-1 · h-1);竺山灣(2.86 ng · L-1 · h-1)、湖東岸(2.21 ng · L-1 · h-1)等湖區(qū)也表現(xiàn)較強(qiáng)的固氮作用，而其他水域如湖心區(qū)、貢湖灣等的固氮作用較弱.在秋季，位于北半湖區(qū)的竺山灣(0.55 ng · L-1 · h-1)和梅梁灣(0.13 ng · L-1 · h-1)水域的固氮速率較高，其他如湖心區(qū)、東西岸區(qū)等湖區(qū)的固氮速率較低.冬季太湖水體最大固氮速率湖區(qū)為西岸區(qū)(Anf=1.03×10-4 ng · L-1 · h-1)，其他湖區(qū)的固氮速率低于檢測(cè)限或者不存在固氮作用.

　　3.2 固氮作用的季節(jié)變化

　　太湖水體的固氮速率表現(xiàn)出明顯的季節(jié)差異(圖 3、圖 4).固氮速率從春季開(kāi)始逐漸增強(qiáng)，在夏季達(dá)到最高峰后經(jīng)秋季緩緩減弱，在冬季降到最低值.春季時(shí)，固氮作用較弱，Anf在0~0.41 ng · L-1 · h-1之間，均值為0.10 ng · L-1 · h-1(SD=0.092 ng · L-1 · h-1);夏季時(shí)，固氮速率顯著增加并達(dá)到全年的最高值，Anf在0~66.10 ng · L-1 · h-1之間，均值為5.88 ng · L-1 · h-1(SD=12.11 ng · L-1 · h-1)，夏季的固氮速率比春、秋季高1個(gè)數(shù)量級(jí)，比冬季高5個(gè)數(shù)量值.固氮速率在秋季逐漸降低，Anf在0~1.88 ng · L-1 · h-1之間，均值為0.14 ng · L-1 · h-1(SD=0.32 ng · L-1 · h-1)，稍高于春季.太湖水體在冬季基本不存在固氮作用，多數(shù)水體固氮速率極低，Anf在0~2.26×10-4 ng · L-1 · h-1之間，均值為5.62×10-5 ng · L-1 · h-1(SD=5.68×10-5 ng · L-1 · h-1).

　　圖4 不同季節(jié)下太湖水體的固氮速率

　　4 討論

　　4.1 太湖固氮速率時(shí)空差異原因

　　水生態(tài)系統(tǒng)中固氮生物的生物量、營(yíng)養(yǎng)、鹽度、光照、溫度、深度、微量元素等(Fu and Bell， 2003;Howarth et al., 1988a;Wetzel，1983)都是影響固氮作用的因素.先后有Drewes、Fogg等(Fogg，1942)發(fā)現(xiàn)魚(yú)腥藻(Ananbaena spp)和束絲藻(Aphanizomenon spp)等藍(lán)藻是淡水系統(tǒng)中的主要固氮生物(Capone and Carpenter， 1982;Gruber and Sarmiento， 1997).將太湖6個(gè)湖區(qū)4個(gè)季節(jié)的固氮速率與對(duì)應(yīng)浮游生物的生物量進(jìn)行相關(guān)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，湖區(qū)固氮速率與藍(lán)藻生物量存在顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.452，p<0.05)(Horne and Goldman， 1972).另一方面，由于同一次采樣時(shí)間內(nèi)，太湖湖區(qū)水體的溫度基本相同(全湖最大溫差僅2.69 ℃)，溫度不會(huì)顯著影響不同湖區(qū)的固氮速率.因此，我們可以推測(cè)固氮生物藍(lán)藻的生物量是導(dǎo)致太湖水體固氮速率空間差異的主要原因.此外，不同湖區(qū)間營(yíng)養(yǎng)鹽(Smith，1992)、風(fēng)浪擾動(dòng)等因素的差異也可能會(huì)在一定程度上強(qiáng)化固氮速率的空間差異.

　　從湖區(qū)固氮速率和水溫的散點(diǎn)圖(圖 5)可以發(fā)現(xiàn)：固氮速率隨水溫的增加呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，相關(guān)分析得出太湖水體固氮速率與其水溫(4~32 ℃)呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(p<0.01).溫度主要通過(guò)改變固氮微生物的新陳代謝和固氮酶的活性來(lái)影響固氮作用的強(qiáng)度(Wetzel，1983).一方面，溫度的適度增加能加快固氮生物的生長(zhǎng)(Canale and Vogel， 1974)，從而加強(qiáng)固氮作用(McQueen and Lean， 1987);另一方面，固氮酶活性會(huì)隨著溫度的升高而增加(Robarts and Zohary， 1987)，固氮作用隨之也會(huì)增強(qiáng).由于水體固氮速率和藍(lán)藻生物量之間的顯著相關(guān)關(guān)系和藍(lán)藻生物量的顯著季節(jié)性變化(夏高冬低)，盡管在我們的現(xiàn)場(chǎng)研究中得到的水體溫度與固氮速率之間的顯著相關(guān)性，也不能簡(jiǎn)單解釋成溫度對(duì)固氮速率的決定性作用，但其仍是導(dǎo)致太湖固氮速率夏高冬低季節(jié)性特征的一個(gè)重要原因.

　　圖5 不同湖區(qū)固氮速率與水溫散點(diǎn)圖

　　4.2 太湖水體固氮作用的貢獻(xiàn)

　　不論是不同湖區(qū)，還是不同季節(jié)，太湖水體都表現(xiàn)出一定強(qiáng)度的固氮作用(表 1，圖 3)，年均Anf=1.53 ng · L-1 · h-1.以太湖水體表層0.6 m的透光層作為太湖固氮作用發(fā)生層，14 h · d-1為日固氮作用時(shí)間(Stewart et al., 1971)，則可計(jì)算出太湖水體的年固氮量為10.73 t(即4.6 mg · m-2 · a-1).與太湖其他氮源(面源、河流輸入等)相比，太湖水體的固氮量甚少，對(duì)太湖水體氮負(fù)荷的輸入貢獻(xiàn)也甚低.

　　不同水生態(tài)系統(tǒng)中的水體生物固氮作用存在明顯差異(表 2).太湖水體固氮速率(4.6 mg · m-2 · a-1)比部分海洋(如Pacific Ocean：2.0 mg · m-2 · a-1)高 1倍，比貧營(yíng)養(yǎng)湖泊(如Lake Superior：0.3 mg · m-2 · a-1)高1個(gè)數(shù)量級(jí);但遠(yuǎn)低于富營(yíng)養(yǎng)化湖泊(0.2~9.2 g · m-2 · a-1)(如Rietvlei dam：9.2 g · m-2 · a-1).

　　表2 太湖水體與其他水系統(tǒng)的固氮作用比較

　　由于固氮藻在無(wú)光條件下也能利用呼吸作用提供的能量來(lái)進(jìn)行固氮作用(Horne，1979; Mullineaux et al., 1980)，而本研究選擇0.6 m透光層作為固氮作用發(fā)生層，14 h的固氮作用時(shí)間，在一定程度可能造成太湖水體固氮速率的低估.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.dongaorq.cn更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　4.3 水體固氮作用研究的意義

　　為了解決淡水湖泊的氮磷過(guò)剩導(dǎo)致的富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題，長(zhǎng)期以來(lái)一直有單獨(dú)控氮法(Howarth and Marino， 2006)、控磷法(Vollenweider，1976;Schindler，1977)和氮磷雙控法.從氮磷比考慮，單獨(dú)控氮(Howarth and Marino， 2006)，造成的氮限制，將可能出現(xiàn)適合固氮藍(lán)藻的生長(zhǎng)從而出現(xiàn)以固氮藍(lán)藻水華替代非固氮藍(lán)藻水華的現(xiàn)象，因此，單獨(dú)控氮可能并非富營(yíng)養(yǎng)化藍(lán)藻爆發(fā)的解決方法.許多湖泊營(yíng)養(yǎng)鹽控制的實(shí)踐證明：許多湖泊采用單獨(dú)控磷來(lái)解決富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題的方案都并不成功.因此，固氮速率的估算，不僅可以進(jìn)一步加深太湖氮的輸入輸出過(guò)程，也可為富營(yíng)養(yǎng)化湖泊治理及營(yíng)養(yǎng)鹽的控制策略提供參考.

　　5 結(jié)論

　　1)太湖水體的固氮速率存在明顯的空間特征.梅梁灣、竺山灣等北部湖區(qū)的固氮速率明顯高于湖心區(qū)、貢湖灣等其他湖區(qū).不同湖區(qū)水體中固氮微生物的生物量(p<0.05)是導(dǎo)致太湖不同湖區(qū)固氮速率差異的主要原因.

　　2)太湖水體固氮速率具有明顯的季節(jié)變化特征.固氮速率表現(xiàn)出夏季最高、春秋季次之、冬季最低的特點(diǎn).溫度通過(guò)改變固氮微生物的新陳代謝和固氮酶的活性來(lái)影響水體固氮作用的強(qiáng)弱，水溫是導(dǎo)致太湖水體固氮速率季節(jié)差異的主要原因(p<0.01).

　　3)太湖水體存在一定的固氮作用，固氮速率為1.53 ng · L-1 · h-1，遠(yuǎn)高于部分海洋和貧營(yíng)養(yǎng)湖泊，但遠(yuǎn)低于部分中、富營(yíng)養(yǎng)湖泊.太湖年固氮量為10.73 t(4.6 mg · m-2 · a-1).