污水回用是解決我國水資源短缺的主要途徑，消毒是保證污水回用衛生學安全的主要工藝，紫外消毒具有廣譜的殺菌作用，且較少形成消毒副產物[1, 2]，生態風險小，已經成為污水回用的常用消毒方法. 紫外消毒的作用機理是在波長為200-300 nm的紫外線照射下，微生物DNA分子上的胸腺嘧啶形成嘧啶二聚體，抑制了基因的轉錄和翻譯過程[3]，從而殺死細胞. 目前，污水回用紫外消毒的研究主要集中在水質對消毒效果的影響[4]，而紫外消毒對微生物的作用主要集中在飲用水處理方面[5, 6]. 污水中微生物濃度相對較高，含有多種病原菌包括沙門氏菌、 分枝桿菌、 軍團菌等[7]，此外二級出水中化學污染物的濃度相對較高，成分相對復雜[4]，因此紫外消毒對水中微生物的影響與飲用水不同. 目前，水環境細菌的檢測仍以培養法為主. 無法較好地指示活性菌的存在，qPCR技術能夠較好地指示細菌的存在，但無法區分活性菌與非活性菌，高估了樣品中活性病原菌的濃度進而無法很好地評估污水回用的風險[8]. RNA半衰期較短，在非活性菌內會快速降解而在活性體內穩定存在，可以很好地指示活性菌的存在. 有學者建立的基于RNA的Q-RT-PCR技術能快速、 靈敏地檢測活性菌[9]. 已有研究中，通過揭示二級出水中微生物(特別是病原菌)群落結構，進而考察紫外消毒對污水回用中主要活性病原菌存在情況的研究較少.
鑒于此，本研究首先采用454焦磷酸測序技術，分析二級出水中微生物(特別是病原菌)群落結構特性，揭示二級出水中常見的幾種病原菌; 然后采用培養法、 qPCR及Q-RT-PCR方法考察了紫外消毒對該污水廠二級除水中指示菌(大腸桿菌)和病原菌(沙門氏菌、 分枝桿菌)的去除特性，以期為污水回用中病原菌的去除工藝提供一些參考，保障污水回用的衛生學安全.
1 材料與方法
1.1 樣品采集及實驗設置
本研究樣品采自南方某生活污水處理廠二級出水，該廠采用傳統活性污泥法，二級處理采用空氣曝氣活性污泥法，該廠進水與出水的水質參數情況如表 1所示. 二級出水的取樣體積為5 L. 樣品取好后放置于采樣箱(內置冰塊)中，于2 h內運回實驗室，1 L水樣用于群落結構分析. 共采樣5次.
表 1 本實驗用再生水的水質參數
紫外消毒對病原菌的影響在實驗室進行. 紫外輻射采用超凈臺中的紫外燈管(蘇信凈化設備生產廠，產品型號：YJ 1320)進行. 經紫外輻射計測定，本研究采用的紫外燈管對實驗中水樣放置區域的紫外照射強度均勻. 實驗中采用校準的紫外輻射計對玻璃杯處的紫外強度為 0.1mW ·cm-2. 將1.5 L水樣倒入2L燒杯中，放入磁性轉子，將燒杯放在磁力攪拌器上，打開超凈臺的紫外燈，使得水樣接受紫外照射. 實驗所需的紫外線劑量(mJ ·cm-2)=紫外線強度(mW ·cm-2)×照射時間(s).
《城鎮給排水紫外線消毒設備》標準(GB/T 19857-2005)規定：城鎮生活飲用水的技術標準為40 mJ ·cm-2，中水回用的技術標準為80 mJ ·cm-2，城鎮污水的技術標準為15 mJ ·cm-2(一級B標準)，城鎮污水的技術標準為20 mJ ·cm-2(一級A標準). 紫外線消毒設備應用于城市雜用水、 景觀環境用水時，應分別達到GB-T 18920和GB-T 50335中的衛生學指標要求. 再生水作為景觀環境用水時糞大腸菌群要求小于200 CFU ·L-1. 本研究中，設定紫外線劑量20、 40、 60、 80 mJ ·cm-2時，分別用培養法檢測糞大腸菌群的濃度水平，考察不同紫外劑量對本樣品中微生物的去除水平，以選擇合適的紫外劑量.
經選擇，考慮經濟成本，最終設定紫外線劑量為60mJ ·cm-2，即照射時間為10 min. 照射后在黑暗條件下放置12 h. 本實驗在室溫環境下進行，反應終止后采用培養法和qPCR及Q-RT-PCR檢測消毒前后大腸桿菌、 沙門氏菌及分枝桿菌的濃度.
1.2 二級出水中微生物多樣性分析
1.2.1 DNA的提取
將1L水樣經醋酸纖維素濾膜過濾，將過濾下的物質于濾膜一同轉入15 mL無菌離心管中，加入10 mL滅菌后的PBS在漩渦振蕩器上洗脫過濾截留的顆粒物. 將濾膜取出，離心管置于4℃離心10 min，轉速設為10 000 r ·min-1(日立,型號：CF16RN). 棄去上清液，將底部物質轉移到2 mL離心管中，于4℃離心5 min，轉速為12 000 r ·min-1. 棄去上清液，管內留500 μL液體進行DNA的提取. DNA提取采用FastDNA@ Spin Kit for Soil(MP Biomedicals，產品編號：6560200)試劑盒，具體操作過程按說明書進行. 最后得到DNA體積為50 μL.對得到的DNA進行純化，采用Universal DNA 純化回收試劑盒(天根，產品編號：DP214). 提取后的DNA用于454焦磷酸測序.
1.2.2 PCR擴增
PCR擴增區域為細菌16S rRNA的V1-V3區，擴增長度為500 bp. 上游引物為：27F：5′- 融合 A-標簽-CA接頭-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，下游引物為：533R：5′- 融合 B-TC 接頭-TTACCGCGG CTGCTGGCAC-3′. 為了區分同一體系中的不同樣品，在引物前端加入一個10 bp的標簽. PCR反應體系為50 μL：5×FastPfu Buffer 10 μL; 2.5 μmol ·L-1 dNTPs 5 μL; 5 μmol ·L-1上下游引物2 μL; FastPfu Polymerase 1 μL; DNA模板100-200 ng; 其余用雙蒸水補足50 μL. PCR擴增反應程序為：先95℃ 2 min; 然后進行30個循環(95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s),最后72℃ 10 min. 將PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳在500 bp位置處檢測到條帶，將PCR產物用TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction凝膠回收試劑盒(TaKaRa，產品號：9762)回收PCR產物. 采用分光光度計測定DNA的濃度及質量(Nanodrop-2000c).
1.2.3 454文庫構建和測序
應用高通量測序平臺GS 454 FLX Titanium(美國Roche公司)對標記的PCR產物進行測序. 測序完成后對所得序列進行處理，處理原則如下：①檢測標簽的完整性，棄去標簽不完整的序列(即使只有一個堿基對發生錯誤); ②棄去片段長度低于200 bp的序列; ③去除尾部質量數低于20的末端序列; ④保證每個樣品系列中80%以上堿基的序列質量數大于20[10].
1.2.4 測序結果分析及分類學分析
對1.2.3節得到的有效序列比對至SILVA數據庫的16S rRNA序列上，去除目標區域以外的序列. 利用mothur軟件，根據每組中的重復序列，去除嵌合體序列，通過對RDP數據庫中的PDS序列進行比對，排除葉綠體、 線粒體、 古細菌、 真核序列的干擾. 根據序列的相似性，將之歸為多個OUT. 選擇相似水平為0.03的進行后續分析,構建稀疏曲線. 利用mothur軟件計算樣本的Chao豐度指數，Shannon多樣性指數，Simpson多樣性指數，覆蓋度指數及Pielou均勻度指數.
1.3 細菌的檢測 本研究中選擇常用的指示菌大腸桿菌作為目標指示菌. 對測序結果進行分析，最終選擇沙門氏菌和分枝桿菌作為待檢測的病原菌. 分別采用培養法、 qPCR及Q-RT-PCR方法檢測水樣中細菌的濃度水平.
1.3.1 培養法
大腸桿菌、 沙門氏菌及分枝桿菌的培養法檢測參考文獻[11]進行.
1.3.2 DNA提取
消毒前病原菌的分析采用1.2.1節提取得到的DNA. 消毒后濃縮1L待測樣品，提取過程按照1.2.1節進行.
1.3.3 qPCR
(1)qPCR引物及探針的選擇
本研究中大腸桿菌和分枝桿菌的qPCR檢測采用SYBR® Green qPCR. 采用Taqman® qPCR定量檢測沙門氏菌. 所采用的目的基因和相應引物序列見表 2.
表 2 定量PCR采用的目的基因和相應引物序列
(2)qPCR標準品的制備
標準品采用質粒標準品，制作方法參見文獻[15]，制備含有uidA、 invA和hsp65基因的質粒DNA.
大腸桿菌標準品構建過程中采用大腸桿菌和與uidA基因相應的引物，沙門氏菌和與invA基因相應的引物，分枝桿菌標準品的構建采用分枝桿菌和hsp65基因相應的引物，目標基因經PCR擴增之后將特異性產物連接入pCR 2.1-TOPO載體(Invitrogen) 中，經過酶切鑒定測序分析和質粒提取等步驟獲得大腸桿菌DNA標準品. 采用核酸蛋白儀測量DNA的濃度. 將得到的質粒DNA按10倍梯度稀釋，制得qPCR標準品.
(3)qPCR測定
大腸桿菌及分枝桿菌qPCR(TaKaRa，Code：DRR041A)反應體系為(20 μL)：SYBR® Premix Ex TaqTM 10 μL，上下游引物各0.5 μL(終濃度0.25 μmol ·L-1)，DNA(標準品或樣品)5 μL，雙蒸水4 μL. 沙門細菌qPCR(TaKaRa，Code：DRR039A)反應體系為(25 μL)：Premix Ex TaqTM 12.5 μL，上下游引物各2.5 μL(終濃度1.0 μmol ·L-1)，Taqman® 熒光探針1 μL(終濃度0.25 μmol ·L-1)，DNA(標準品或樣品)5 μL，雙蒸水1.5 μL補足體積至25 μL.
大腸桿菌反應程序如下：1個循環：95℃，1 min; 40個循環：95℃，20 s; 60℃，20 s; 72℃，15 s(收集熒光); 熔解曲線的過程為：95℃，1 min，從60℃開始每30 s溫度升高0.5℃，總共進行71個循環，結束溫度為95℃，反應結束之后4℃保存.
沙門氏菌反應程序如下：1個循環：95℃，10 min; 40個循環：95℃，20 s; 60℃，30 s; 72℃，25 s(收集熒光); 不設置熔解曲線，反應結束之后4℃保存.
分枝桿菌反應程序如下：1個循環：94℃，1 min; 40個循環：94℃，60 s; 60℃，60 s; 72℃ 60 s(收集熒光); 熔解曲線過程為同大腸桿菌.
每次定量PCR反應都設空白對照(以相同體積的雙蒸水取代DNA)，每次測定設2個平行樣.
1.3.4 Q-RT-PCR
Q-RT-PCR標準品的制備參考文獻[7].
樣品的濃縮參照1.2.1. RNA的提取采用Fast RNA® Pro Soil-Direct Kit(MP Biomedical，產品編 號：116070050).
2 結果與討論 2.1 二級出水中微生物群落結構組成 2.1.1 微生物多樣性分析
通過對5個批次樣品16S rRNA基因文庫進行焦磷酸測序，經修剪去雜后，共獲得1 128、 1 299、 1 292、 1 019和1 462條優化序列，序列平均長度為545 bp. 將優化序列截齊后與SILVA比對后進行聚類，在97%相似性下分別獲得252、 264、 375、 315和554 OTUs，稀疏曲線如圖 1所示. 從中可知，當測序數量超過1 000時，仍有新的OUT可被測出. 稀疏曲線隨測序序列增加趨向平坦，表明本研究樣本取樣量合理. 表 3列出了α多樣性分析各樣品的多樣性指數.
圖 1 二級出水樣品的稀疏曲線
表 3 二級出水中微生物物種豐富度和多樣性評價
對測序結果進行門的組成進行分析(對5個樣品的測得結果進行累計，當細菌門比例小于1%時，劃入其他類別)，分析結果如圖 2所示. 相似性為97%時，樣品中共檢測到21個門，包括酸桿菌門、 放線菌門、 、 擬桿菌門、 綠彎菌門、 藍細菌門、 Deinococcus-Thermus、 厚壁菌門、 梭桿菌門、 Gemmatimonadete、 硝化螺旋菌門、 浮霉菌門、 變形菌門、 螺旋菌門、 互養菌門(Synergistetes)和疣微菌門. 樣品中有794條序列不能被分入已知菌門，這些細菌可能是未知菌種.
圖 2 樣品中細菌群落結構門比例組成
由圖 2可知，樣品中包括藍細菌門、 擬桿菌門、 厚壁菌門、 變形菌門這4個主要門及未定菌(OD1)和其它未分類菌. Ye等[16]在研究香港一座采用活性污泥法的污水廠微生物群落結構中發現，污水廠二級出水中變形菌門是最主要的細菌群. Lee等[17]在研究首爾不同污水廠進水及活性污泥的微生物群落結構中同樣也發現，變形菌門、 擬桿菌門及厚壁菌門是依次最主要的3個細菌群. Shu等[18]在研究陜西6座污水處理廠(包括工業污水處理廠及市政污水處 理廠)厭氧消化污泥的微生物群落結構中，也得到了同樣的結論，變形菌門、 擬桿菌門、綠彎菌門及厚壁菌門是依次主要的4個細菌群. 本研究得到的結論與這些研究結果相一致.
對兩個主要門變形菌門和擬桿菌門進行進一步分析，結果如圖 3所示.
由圖 3(a)可知，變形菌門(Proteobacteria)主要由α-、 β-和γ-Proteobacteria這3個主要亞綱組成，分別為23.9%、 43.5%和12.9%. 值得注意的是β-Proteobacteria亞綱包含許多種類的致病菌，在本研究中也檢測到. 由圖 3(b)可知，擬桿菌門(Bacteroidetes)主要由Flavobacteria、 Sphingobacteria和Bacteroidia這3個主要綱組成，分別為79.5%、 11.6%和2.5%. 上述研究結果與Hu等[10]的研究結果相一致.
圖 3 樣品中細菌群落結構綱水平比例組成
2.1.2 主要病原菌解析
病原菌的去除是保障污水回用衛生學安全的重要組成. 綜合國內外研究病原菌分類[19, 20]，本研究共發現11種病原菌(表 4)，其中梭菌屬、 弓形桿菌屬和分支桿菌的含量較高，此外常見的病原菌埃希氏菌和志賀氏菌和軍團菌也均檢測到. 弓形桿菌屬是革蘭氏陰性螺旋形微生物，屬于彎曲桿菌科[21]，會引起腹瀉、 腹痛等癥狀. 對一些消毒劑(如紫外消毒)的耐受性較強，在深度處理過程中較難去除[22]. 分枝桿菌屬大部分種類是機會致病菌，可能會引起系列人類感染疾病(如支原體肺炎)[23]. 分枝桿菌是革蘭氏陽性菌，其特殊的生理性能(包括生長緩慢、 細胞膜較厚、 疏水性的細胞膜)使得其對各種消毒劑具有較好的抗性[24]. 此外，該細菌可以寄生于阿米巴蟲身上，進一步增強了他們的耐消毒性[25]. 在污水回用中需采用別的處理方法(如膜處理等)進行去除. 梭菌屬是革蘭氏陽性菌，在污水處理廠中普遍存在[19]，會引起破傷風等各類疾病. 梭菌屬為專性厭氧微生物，能形成孢子，使其對氧化性消毒劑具有極強的耐受性[26]. 但是，梭菌屬對紫外消毒則較為敏感[27, 28]，這主要由于紫外消毒并不是通過氧化作用破外細胞結構，而是直接導致核酸突變，阻礙其復制和轉錄，封鎖及阻礙蛋白質的合成同時產生的自由基可引起光電離，最終導致微生物死亡[29, 30]. 不同病原菌的生理特性不同，在深度處理過程中應結合不同病原菌的生理特性設置處理來去除污水中的病原菌.
表 4 樣品中各病原菌比例
2.2 紫外消毒對指示菌與病源菌的殺滅特性細菌的影響
不同紫外劑量下，大腸桿菌的去除效果如圖 4所示. 從中可知，當紫外劑量為60 mJ ·cm-2時，對大腸桿菌的去除率達到3.2個數量級，出水濃度為113 CFU ·L-1能夠滿足再生水用作景觀用水時的衛生學要求. 因此，本研究考察紫外劑量為60 mJ ·cm-2對不同病原菌的去除效果.
圖 4 大腸桿菌的紫外消毒曲線
本研究中qPCR的線性檢測區間如下：大腸桿菌為3×102～3×108 copies ·reaction-1; 沙門氏菌為6×102～6×108 copiese ·reaction-1; 分枝桿菌為8×101～8×108 copies ·reaction-1. 大腸桿菌、 沙門氏菌與分枝桿菌的線性相關系數均>0.99，PCR擴增效率在95%-110%之間. 大腸桿菌及分枝桿菌的熔解曲線呈現單一的熔點峰，峰值為87℃±0.5℃. 表明本研究所采用的qPCR標準曲線線性相關性較好，擴增效率較高，對細菌的特異性較強.
本研究中Q-RT-PCR的線性監測區間如下：大腸桿菌、 沙門氏菌和分枝桿菌均為1×102-1×109copies ·reaction-1. 大腸桿菌與分枝桿菌的線性相關系數均>0.99，PCR擴增效率在95%-115%之間.
采用培養法、 qPCR及Q-RT-PCR方法檢測水源地水樣消毒前后大腸桿菌、 沙門氏菌與分枝桿菌的濃度水平，檢測結果如圖 5所示. 從中可知，60 mJ ·cm-2劑量紫外消毒對可培養大腸桿菌及沙門氏菌的去除率約為99.9%. 靳慧霞等人在研究紫外消毒對大腸桿菌滅活效率的研究中發現，當消毒劑量為60 mJ ·cm-2時，大腸桿菌的去除率為99.99%[31]. 本研究相同劑量下，可培養大腸桿菌的去除率較低，這可能是由于紫外消毒會受到水體濁度、 有機物等的影響[32]. 但是，相同劑量的紫外消毒對可培養分枝桿菌的去除率不足90%，這與分枝桿菌特殊的細胞結構有關. 分枝桿菌的細胞膜富含脂類，細胞膜厚，具有疏水性，使得分枝桿菌對外界環境的抵抗性較強[33, 34].
qPCR檢測消毒前后大腸桿菌、 沙門氏菌及分枝桿菌的濃度水平的變化并不顯著. 這表明紫外消毒對細菌基因片段的破壞速率遠小于其對細菌可培養性的破壞速率. qPCR檢測的是目標菌的目的基因片段而不是整個基因組，由于檢測的目的基因的片段較短，無法很好地指示整個基因組的受損情況. Q-RT-PCR檢測結果顯示，經60 mJ ·cm-2劑量紫外消毒后，活性大腸桿菌、 沙門氏菌及分枝桿菌的濃度水平下降不顯著. 結合培養法的結果，細菌雖然無法在培養基上形成菌落，但是仍具有逆轉錄活性，這表明細菌仍具有一定活性. 這可能是由于經過紫外照射后細菌可能進入VBNC(viable but nonculturable)狀態，無法在培養基上生長，但仍具有細胞活性，可在一定條件下恢復其可培養性[35, 34]. 值得注意的是，分枝桿菌qPCR及Q-RT-PCR的檢測結果較培養法的檢測結果高2個數量級. 有學者指出，由于分枝桿菌種類較多，生長條件不同，一種培養基可能無法檢測到所有的分枝桿菌，采用qPCR的檢測結果會比培養法高1個多數量級[36]. 此外，Q-RT-PCR的檢測較qPCR略低，這是由于qPCR檢測到的是所有具有目的基因的DNA片段(包括非活性及活性菌)，而Q-RT-PCR檢測到的僅是具有逆轉錄活性的RNA片段，因此Q-RT-PCR比qPCR較好地指示污水中的活性病原菌的濃度水平.
圖 5 培養法、 qPCR及Q-RT-PCR對不同指示菌的檢測結果
上述研究結果表明，紫外消毒能夠抑制大腸桿菌及沙門氏菌的可培養性，但這些細菌尚能保持逆轉錄活性. 與投加化學消毒劑的消毒工藝相比，紫外消毒工藝沒有持久的消毒能力，一些仍具有活性的微生物在經受紫外照射滅活后能夠再次復活，恢復其可培養性. 已被證實能夠產生復活現象的微生物有：大腸埃希氏菌、 洋蔥假單胞桿菌、 糞鏈球菌、 藍藻等[37]. 此外，紫外消毒對分枝桿菌的影響較小，降低了紫外消毒的效果，給污水回用帶來了安全隱患，需結合其他工藝(如投加余氯等)來保障污水回用的衛生學安全.具體參見污水寶商城資料或http://www.dongaorq.cn更多相關技術文檔。
3 結論
(1)454焦磷酸測序研究污水廠二級出水中微生物群落結構,共發現12個門的細菌，其中擬桿菌門和變形菌門是主要的門類，且擬桿菌門的主要組成部位為Flavobacteria，變形菌門的主要組成部位為α-、 β-和γ-Proteobacteria. 本研究共發現11種病原菌，其中梭菌屬和分支桿菌是主要的屬類，此外還有軍團菌等常見的致病性較高的病原菌.
(2)研究比較60mJ ·cm-2劑量紫外消毒對大腸桿菌、 沙門氏菌及分枝桿菌的去除效果. 結果表明，該計量的紫外消毒能去除3個數量級可培養的大腸桿菌及沙門氏菌，對分枝桿菌的去除效果不顯著. Q-RT-PCR結果表明，雖然經過紫外消毒后，大部分大腸桿菌及沙門氏菌失去了可培養性，但仍具有逆轉錄活性，需結合其他深度處理工藝進一步去除活性病原菌以保障污水回用的衛生學安全.（來源及作者：蘇州市環境監測中心 景明 同濟大學環境科學與工程學院 王磊）
