20世紀(jì)90年代，荷蘭的Mulder等在處理工業(yè)廢水的反硝化流化床中發(fā)現(xiàn)了一種新型細(xì)菌——厭氧氨氧化細(xì)菌 (anaerobic ammonia oxidation bacteria，AnAOB).該類細(xì)菌可以在缺氧條件下以亞硝酸鹽為電子受體將氨氮轉(zhuǎn)化為氮?dú)? 1999年，Strous等采用密度梯度離心法成功分離了AnAOB菌株，并通過16S rRNA基因測(cè)序，確認(rèn)了AnAOB是浮霉?fàn)罹�的成員.

　　與傳統(tǒng)的硝化反硝化工藝相比，厭氧氨氧化 (anaerobic ammonia oxidation，ANAMMOX) 工藝具有無需外加碳源和供氧動(dòng)力消耗，反應(yīng)過程中CO2排放量少和剩余污泥產(chǎn)量少等優(yōu)點(diǎn).目前該工藝已經(jīng)用于高氨氮工業(yè)廢水的處理中，如污泥消化液、垃圾滲濾液和養(yǎng)豬場(chǎng)廢水等.

　　厭氧氨氧化工藝雖然有諸多優(yōu)點(diǎn)，但AnAOB生長(zhǎng)緩慢，倍增時(shí)間為7~22 d，導(dǎo)致ANAMMOX反應(yīng)器啟動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)，是限制厭氧氨氧化工藝大規(guī)模應(yīng)用的最主要因素.因此，選擇合適的反應(yīng)器，減少AnAOB的流失，是成功應(yīng)用厭氧氨氧化工藝的關(guān)鍵.目前，用于厭氧氨氧化技術(shù)的反應(yīng)器有上流式污泥床反應(yīng)器 (USB)、批序式間歇反應(yīng)器 (SBR)和厭氧折流板反應(yīng)器 (ABR)等.本實(shí)驗(yàn)選擇上流式厭氧過濾床反應(yīng)器 (upflow blanket filter, UBF)，UBF反應(yīng)器是由 (上流式污泥床) USB和厭氧過濾器 (AF) 構(gòu)成的復(fù)合式反應(yīng)器，具有良好的生物截留能力和易形成顆粒污泥等特點(diǎn).

　　AnAOB至今仍未獲得人工的純培養(yǎng)，而高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為鑒定環(huán)境中的微生物群落的多樣性提供了有力的工具.本研究采用Illumina Hisep PE250測(cè)序平臺(tái)對(duì)UBF厭氧氨氧化反應(yīng)器內(nèi)的微生物進(jìn)行高通量測(cè)序，分析了ANAMMOX反應(yīng)器內(nèi)微生物的分布情況，以期為ANAMMOX反應(yīng)器內(nèi)微生物群落相對(duì)豐度及群落結(jié)構(gòu)變化提供理論依據(jù).

　　1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

　　反應(yīng)器為UBF厭氧氨氧化反應(yīng)器，由有機(jī)玻璃制成，呈圓柱形，總?cè)莘e為3.94 L，有效容積為2.1 L，直徑為8 cm，總高度為66 cm，內(nèi)置20 cm高的填料層，外裹黑布，避免光對(duì)厭氧氨氧化菌的抑制.廢水通過蠕動(dòng)泵從反應(yīng)器的底部連續(xù)泵入，與污泥混合后，反應(yīng)生成的氣體從反應(yīng)器頂部的排氣孔排出，出水由反應(yīng)器上部的溢流堰流出.進(jìn)水pH控制在7.1~7.8，在常溫條件下啟動(dòng).實(shí)驗(yàn)裝置如圖 1所示.

圖 1 實(shí)驗(yàn)裝置示意

　　1.2 接種污泥和實(shí)驗(yàn)用水

　　反應(yīng)器接種污泥來自廣州市瀝滘污水處理廠缺氧池，接種量為800 mL.

　　實(shí)驗(yàn)采用模擬廢水，主要成分為NH4Cl和NaNO2，其濃度按實(shí)驗(yàn)需要添加.其它成分為：NaHCO3 1 000 mg ·L-1，MgSO4 ·7H2O 473 mg ·L-1，CaCl2 ·2H2O 180 mg ·L-1，KH2PO4 27 mg ·L-1，微量元素Ⅰ1 mg ·L-1和微量元素Ⅱ 1 mg ·L-1.其中微量元素Ⅰ為：EDTA 5 000 mg ·L-1和FeSO4 ·7H2O 5 000 mg ·L-1.微量元素Ⅱ?yàn)椋篫nSO4 ·7H2O 430 mg ·L-1，GuSO5 ·5H2O 240 mg ·L-1，MnCl2 ·4H2O 990 mg ·L-1，NiCl2 ·6H2O 190 mg ·L-1，CoCl2·6H2O 24 mg ·L-1.進(jìn)水pH值用鹽酸調(diào)節(jié)為7.1~7.8.

　　1.3 水樣檢測(cè)方法

　　氨氮：納氏試劑分光光度法;亞硝氮：N-(1-萘基)-乙二胺光度法;硝氮：紫外分光光度法;總氮為氨氮、亞硝氮和硝氮之和;pH值采用pH計(jì)測(cè)定.

　　1.4 微生物群落多樣性檢測(cè)方法1.4.1 DNA提取

　　反應(yīng)器運(yùn)行至第54 d時(shí)取下層污泥20 mL (標(biāo)記為CYR110，文中表示富集階段)，此時(shí)污泥高度為19.6 cm.第83 d時(shí)分別取上層污泥 (標(biāo)記為CYR111) 和下層污泥 (標(biāo)記為CYR112，文中表示穩(wěn)定運(yùn)行階段) 各20 mL，此時(shí)污泥高度為24.4 cm.下層污泥的取樣口距離底部4.4 cm，上層污泥的取樣口距離底部20.7 cm.采用Powersoil土壤DNA提取試劑盒提取基因組DNA.提取的DNA使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度，使用Nanodrop檢測(cè)DNA濃度.

　　1.4.2 PCR擴(kuò)增

　　采用16S rRNA V4區(qū)通用引物，引物序列為515F 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′和806R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，擴(kuò)增片段大小為300bp左右.采用PCR儀對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系 (60 μL) 為10x Ex Taq Buffer 6 μL，dNTP 6 μL，BSA 0.6 μL，Ex Taq 0.3 μL，Primer F 1.2 μL，Primer R 1.2 μL，DNA 1 μL，ddH2O 43.7 μL.按照PCR反應(yīng)條件 (94℃ 5 min，94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 45 s，72℃ 10 min) 進(jìn)行，31 Cycles PCR完成后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物.

　　1.4.3 Illumina高通量測(cè)序

　　采用Illumina Hisep PE250測(cè)序平臺(tái)對(duì)采集的樣品進(jìn)行高通量測(cè)序.

　　1.4.4 數(shù)據(jù)處理分析方法

　　采用Origin 7.5和AutoCAD 2007軟件繪制圖，并采用SPSS 19.0(IBM Inc，USA) 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析.

　　2 結(jié)果與討論2.1 反應(yīng)器的脫氮性能

　　反應(yīng)器運(yùn)行至第54d時(shí)，保持HRT為8h不變，以提高進(jìn)水NH4+-N和NO2--N濃度的方式增大反應(yīng)器的容積負(fù)荷，此時(shí)NH4+-N、NO2--N和TN的去除率分別為76.18%、53.47%和55.66%，總氮容積負(fù)荷和去除負(fù)荷分別為0.56 kg ·(m3 ·d)-1和0.29 kg ·(m3 ·d)-1.當(dāng)反應(yīng)器運(yùn)行至第83 d時(shí)，NH4+-N、NO2--N和TN的去除率分別為99.4%、93.1%和82.8%，總氮容積負(fù)荷和去除負(fù)荷分別為1.25 kg ·(m3 ·d)-1和1.04 kg ·(m3 ·d)-1，說明反應(yīng)器啟動(dòng)成功.由圖 2可以看出，NH4+-N、NO2--N濃度和NLR呈梯度升高.當(dāng)反應(yīng)器的總氮容積負(fù)荷由0.52 kg ·(m3 ·d)-1增大至2.75 kg ·(m3 ·d)-1時(shí)，TN的去除率由55.66%增大至82.96%.蔣軍等研究表明，當(dāng)反應(yīng)器的容積負(fù)荷由0.21 kg ·(m3 ·d)-1增大至0.84 kg ·(m3 ·d)-1時(shí)，TN的去除率由67.98%減小至50.4%，與本研究結(jié)果有較大差異，可能與實(shí)驗(yàn)裝置和反應(yīng)條件有關(guān).實(shí)驗(yàn)的前40多天，出水中的NH4+-N和NO2--N濃度較穩(wěn)定，分別在0~30 mg ·L-1和4~53 mg ·L-1之間波動(dòng).當(dāng)進(jìn)水NH4+-N和NO2--N濃度分別增大至240 mg ·L-1和300 mg ·L-1時(shí)，出水中的NH4+-N和NO2--N濃度有所增大，但增大幅度較小，通過降低進(jìn)水的pH值，出水中的NH4+-N和NO2--N濃度經(jīng)過1 d分別降低至0~10 mg ·L-1和15~30 mg ·L-1之間.隨著進(jìn)水NH4+-N和NO2--N濃度的繼續(xù)增大，當(dāng)進(jìn)水NH4+-N和NO2--N濃度分別達(dá)到330 mg ·L-1和430mg ·L-1時(shí)，反應(yīng)器出水水質(zhì)突然惡化，出水的NH4+-N和NO2--N濃度分別增大至89 mg ·L-1和163 mg ·L-1.此時(shí)NH4+-N和NO2--N的去除率分別為73.0%和62.1%，此時(shí)厭氧氨氧化菌的活性受到抑制. Dapena-Mora等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)NO2--N濃度達(dá)到350mg ·L-1時(shí)，厭氧氨氧化菌的活性會(huì)降低50%.在不同研究中，NO2--N對(duì)厭氧氨氧化菌的抑制濃度是不同，這可能與菌種及操作條件有關(guān).為了較快地恢復(fù)反應(yīng)器的脫氮性能，將進(jìn)水NH4+-N和NO2--N濃度分別降低至310 mg ·L-1和400 mg ·L-1.經(jīng)過7 d的恢復(fù)期，出水中的NH4+-N和NO2--N濃度分別降低至16 mg ·L-1和56 mg ·L-1，NH4+-N和NO2--N的去除率分別恢復(fù)至95.0%和86.6%.研究表明，NO2--N毒性顯著強(qiáng)于NH4+-N，在進(jìn)水NO2--N濃度較高或進(jìn)水NO2--N/NH4+-N相對(duì)較高的條件下，反應(yīng)器性能易因基質(zhì)抑制而失穩(wěn).

圖 2 ANAMMOX反應(yīng)器的脫氮性能

　　2.2 ANAMMOX反應(yīng)器微生物群落多樣性研究2.2.1 Alpha多樣性指數(shù)分析

　　由Observed species和Chao1指數(shù)可知 (見表 1)，富集階段反應(yīng)器內(nèi)的微生物群落相對(duì)豐度要高于穩(wěn)定運(yùn)行階段，而在穩(wěn)定運(yùn)行階段，反應(yīng)器內(nèi)的上層微生物群落相對(duì)豐度要高于下層，說明反應(yīng)器內(nèi)的微生物經(jīng)過一段時(shí)間的馴化后，部分微生物適應(yīng)不了無機(jī)厭氧環(huán)境而逐漸死亡，造成微生物的豐度降低.由PD whole tree、Shannon和Simpson指數(shù)可知 (見表 1)，富集階段反應(yīng)器內(nèi)的微生物群落多樣性要高于穩(wěn)定運(yùn)行階段，而穩(wěn)定運(yùn)行階段反應(yīng)器內(nèi)的上層微生物群落多樣性要高于下層，說明反應(yīng)器內(nèi)的AnAOB經(jīng)過一段時(shí)間的馴化后形成了優(yōu)勢(shì)種群，導(dǎo)致微生物群落多樣性的減少.由于廢水是從反應(yīng)器的底部泵入，因此反應(yīng)器下層的AnAOB最先被馴化成優(yōu)勢(shì)種群，因而下層的微生物群落多樣性要低于上層.

　　表 1 生物多樣性分析

　　2.2.2 門水平物種相對(duì)豐度分析

　　由圖 3可知，所測(cè)得的相對(duì)豐度大于等于1%的門隸屬于14個(gè)門.其中，富集階段反應(yīng)器中的微生物主要以變形菌門Proteobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、綠彎菌門Chloroflexi、泉古菌門Crenarchaeota和廣古菌門Euryarchaeota為主，穩(wěn)定運(yùn)行階段反應(yīng)器中的微生物主要以變形菌門Proteobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、綠彎菌門Chloroflexi和浮霉菌門Planctomycetes為主，反應(yīng)器中的浮霉菌門和變形菌門有了明顯的增加，分別由1.1%、27.9%增加到了26.4%、39.9%.而擬桿菌門、綠彎菌門、泉古菌門和廣古菌門都明顯減少.反應(yīng)器上下層物種相對(duì)豐度有明顯的差異.底部的浮霉菌門明顯比上層多，而上層的擬桿菌門要比底部多.

圖 3 門水平物種相對(duì)豐度分布

　　2.2.3 科水平物種相對(duì)豐度分析

　　由圖 4可知，所測(cè)得的相對(duì)豐度大于等于1%的科隸屬于21個(gè)科，其中，富集階段反應(yīng)器中的微生物主要以厭氧蠅菌科Anaerolinaceae、紅環(huán)菌科Rhodocyclaceae、叢毛單孢菌科Comamonadaceae為主.穩(wěn)定運(yùn)行階段反應(yīng)器中的上層污泥主要以厭氧蠅菌科Anaerolinaceae、紅環(huán)菌科Rhodocyclaceae、叢毛單孢菌科Comamonadaceae和Brocadiaceae為主，下層污泥主要以厭氧蠅菌科Anaerolinaceae、紅環(huán)菌科Rhodocyclaceae、叢毛單孢菌科Comamonadaceae、黃單胞菌科Xanthomonadaceae和Brocadiaceae為主.反應(yīng)器中的厭氧蠅菌科Anaerolinaceae、甲烷絲狀菌科Methanosaetaceae、WSA2、腐螺旋菌科Saprospiraceae、熱孢菌科Thermotogaceae和互營(yíng)菌科Syntrophaceae有明顯的減少，其中WSA2、腐螺旋菌科Saprospiraceae、熱孢菌科Thermotogaceae和互營(yíng)菌科Syntrophaceae在穩(wěn)定運(yùn)行階段幾乎看不到.而紅環(huán)菌科Rhodocyclaceae、叢毛單孢菌科Comamonadaceae、黃單胞菌科Xanthomonadaceae和Brocadiaceae有了明顯的增加，其中Brocadiaceae增加最為顯著，由0.074 6%增加到了24.572 7%.反應(yīng)器上層Brocadiaceae占12.486 9%，下層占24.572 7%，下層Brocadiaceae的豐度明顯比上層高. Brocadiaceae屬于浮霉菌門下的一個(gè)科，已出現(xiàn)的厭氧氨氧化菌主要來自于這個(gè)科.由此可知，厭氧氨氧化反應(yīng)器經(jīng)過一段時(shí)間的運(yùn)行后，反應(yīng)器中的厭氧氨氧化微生物明顯增加了.而反應(yīng)器下層的厭氧氨氧化微生物明顯比上層高.

圖 4 科水平物種相對(duì)豐度分布

　　2.2.4 物種相對(duì)豐度熱圖分析

　　由圖 5可知，穩(wěn)定運(yùn)行階段的下層污泥中的Brocadiaceae、噬纖維菌科Cytophagaceae、叢毛單胞菌科Comamonadaceae、SB1、黃單胞菌科Xanthomonadaceae、慢生根瘤菌科Bradyrhizobiaceae、A4b、Haliangiaceae、Cryomorphaceae、生絲微菌科Hyphomicrobiaceae群落相對(duì)豐度要比上層高，其中，上層污泥中的Brocadiaceae、噬纖維菌科Cytophagaceae、叢毛單胞菌科Comamonadaceae、SB1群落相對(duì)豐度要比富集階段高.相反，富集階段反應(yīng)器中的熱袍菌科Thermotogaceae、互營(yíng)桿菌科Syntrophobacteraceae、Syntrophorhabdaceae、互營(yíng)菌科Syntrophaceae、腐螺旋菌科Saprospiraceae、WSA2、甲烷絲狀菌科Methanosaetaceae、甲烷桿菌科Methanobacteriaceae、厭氧蠅菌科Anaerolinaceae、暖蠅菌科Caldilineaceae、肉桿菌科Carnobacteriaceae群落相對(duì)豐度要比穩(wěn)定運(yùn)行階段高.總體來看，富集階段反應(yīng)器內(nèi)的微生物群落結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定運(yùn)行階段相比相差很大，而穩(wěn)定運(yùn)行階段反應(yīng)器上下層的微生物群落結(jié)構(gòu)也有較大的差異. Chen等研究表明ABR厭氧氨氧化反應(yīng)器各隔室的微生物群落結(jié)構(gòu)存在較大的差異, 與本研究結(jié)果相符.

圖 5 物種相對(duì)豐度聚類 (科水平)

　　2.2.5 脫氮細(xì)菌多樣性分析

　　通過高通量的擴(kuò)增子測(cè)序，共鑒定出門的細(xì)菌40種.其中，涉及到脫氮細(xì)菌的有變形菌門、浮霉菌門和硝化螺旋菌門3種，變形菌門豐度最高，與多數(shù)厭氧氨氧化反應(yīng)器微生物群落分布情況相一致.

　　在變形菌門中，富集階段的樣品中共鑒定出屬的細(xì)菌67種，占據(jù)比例較高的是陶厄氏菌屬Thauera(1.532%)、Dok59(1.318%)、Thibacillus硫桿菌屬 (0.888%) 和互營(yíng)桿菌屬Syntrophobacter(0.650%).穩(wěn)定運(yùn)行階段的上層污泥樣品中共鑒定出屬的細(xì)菌56種，占據(jù)比例較高的是Dok59屬 (4.644%)、Thauera屬 (2.560%)、Thibacillus屬 (1.074%) 和脫硫微菌屬Desulfomicrobium(0.923%)，穩(wěn)定運(yùn)行階段的下層污泥樣品中共鑒定出屬的細(xì)菌54種，占據(jù)比例較高的是Dok59屬 (6.014%)、Thauera屬 (1.447%)、Thibacillus屬 (0.638%) 和Thermomonas屬 (0.503%).變形菌門中屬的細(xì)菌多樣減小. Thauera屬、Dok59屬和Thibacillus屬豐度最高，其中Thauera屬和Thibacillus屬是β-變形菌綱中的反硝化細(xì)菌.此外，富集階段的樣品中只檢測(cè)出Nitrosovibrio這一種氨氧化細(xì)菌 (AOB)，僅占0.011%，屬于β-變形菌亞綱. AOB屬于能夠在有氧條件下將氨氧化為亞硝酸鹽的化能無機(jī)自養(yǎng)型細(xì)菌.本實(shí)驗(yàn)裝置沒有專門的除氧設(shè)備，因此會(huì)伴隨有少量的氧氣進(jìn)入反應(yīng)器中為AOB提供有氧環(huán)境.由圖 6可以看出，ΔNO2--N/ΔNH4+-N值在最初的10 d由0.60增大至1.31，然后在1.05~1.41之間波動(dòng). ΔNO3--N/ΔNH4+-N值在最初的10 d由0.22增大至0.44，然后逐漸減小至0.15.說明富集階段部分NH4+-N被AOB轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽.而穩(wěn)定運(yùn)行階段的ΔNO2--N/ΔNH4+-N值較接近理論值1.32，說明此時(shí)NH4+-N幾乎全部由AnAOB所利用.

圖 6 3種氮素的比值變化

　　硝化螺旋菌門是測(cè)序得到的三大脫氮細(xì)菌門中所占比例最小的，在0.035%~0.188%之間，富集階段的含量最高 (0.188%).推測(cè)富集階段的AOB將部分氨轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，導(dǎo)致剩余亞硝酸鹽的積累，而硝化螺旋菌門是亞硝化反應(yīng)的主要微生物，因此含量高于穩(wěn)定運(yùn)行階段.在硝化螺旋菌門中，共鑒定出2種屬的細(xì)菌，分別為GOUTA19和Nitrospira，其中，Nitrospira為亞硝鹽氧化細(xì)菌 (NOB)，所占比例在0.023%~0.174%之間，富集階段的含量最高 (0.174%).推測(cè)富集階段的AOB將部分氨轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，導(dǎo)致剩余亞硝酸鹽的積累，而NOB可將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽，因此含量高于穩(wěn)定運(yùn)行階段.

　　在浮霉菌門中共鑒定出屬的細(xì)菌5種，分別為Gemmatia、A17、Pirellula、Planctomyces、Candidatus brocadia，其中，Candidatus brocadia所占的比例最高，在0.011%~1%之間.穩(wěn)定運(yùn)行階段Candidatus brocadia所占的比例 (1%) 高于富集階段 (0.011%)，與穩(wěn)定運(yùn)行階段的去除負(fù)荷1.04kg ·(m3 ·d)-1高于富集階段0.29 kg ·(m3 ·d)-1相一致. Candidatus brocadia屬是第一個(gè)被富集鑒定的AnAOB[25]，屬于Brocadiaceae科.而屬于Brocadiaceae科的96%序列通過BLAST進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)與多條序列同源性相似，因此無法確定是哪種屬.推測(cè)未分類菌屬中可能含有未鑒定出的AnAOB新種.具體參見污水寶商城資料或http://www.dongaorq.cn更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　3 結(jié)論

　　(1) 采用提高進(jìn)水NH4+-N和NO2--N濃度的方式將ANAMMOX反應(yīng)器的容積負(fù)荷由0.52 kg ·(m3 ·d)-1增大至2.75 kg ·(m3 ·d)-1，NH4+-N、NO2--N和TN的去除率分別從76.18%、53.47%、55.66%增大至94.04%、86.97%、82.96%，AnAOB成功富集.

　　(2) 由Alpha多樣性指數(shù)分析可知，反應(yīng)器富集階段的微生物群落相對(duì)豐度和群落多樣性要高于穩(wěn)定運(yùn)行階段，而在穩(wěn)定運(yùn)行階段，反應(yīng)器內(nèi)的上層微生物群落相對(duì)豐度和群落多樣性要高于下層.

　　(3) 由門水平物種相對(duì)豐度分析可知，反應(yīng)器中的浮霉菌門和變形菌門有明顯的增加，其中，浮霉菌門的豐度增大最為顯著.反應(yīng)器底部的浮霉菌門明顯比上層多，而上層的擬桿菌門要比底部多.由科水平物種相對(duì)豐度分析可知，反應(yīng)器富集階段以厭氧蠅菌科的相對(duì)豐度最高，為9.47%.穩(wěn)定運(yùn)行階段Brocadiaceae的相對(duì)豐度最高，達(dá)到了24.57%，成為優(yōu)勢(shì)菌群.

　　(4) 由物種相對(duì)豐度熱圖分析可知，富集階段的微生物群落結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定運(yùn)行階段相比相差很大，而穩(wěn)定運(yùn)行階段反應(yīng)器上下層微生物群落結(jié)構(gòu)也有較大的差異.

　　(5) 由測(cè)序結(jié)果可知，穩(wěn)定運(yùn)行階段UBF厭氧氨氧化反應(yīng)器中的脫氮細(xì)菌較為豐富，其中變形菌門、浮霉菌門和硝化螺旋菌門分別占39.9%、26.4%和0.188%.變形菌門中占據(jù)比例較高的是Dok59屬、Thauera屬、Thibacillus屬和Thermomonas屬.浮霉菌門主要包含Candidatus brocadia.