苯胺類化學品廣泛用于染料、 農藥、 橡膠以及油漆的制造中[1, 2, 3]，此類化學品易隨著工業廢水、 農業徑流水、 生活污水排放到環境中，對水生生物和人體健康產生潛在危害[4, 5].
化學品在環境中的去除途徑主要有揮發、 水解、 吸附[6, 7]和生物降解. 由于苯胺類化學品亨利常數較低，且不含有易于水解的官能團，揮發和水解并非其在污水處理廠中的主要去除過程[8]，而主要是以生化作用去除含苯胺類化學品的廢水[9, 10]. 在以生化方法為主要工藝的污水處理廠中，pH、 溫度、 微生物活性、 活性污泥濃度以及水力停留時間等條件對化學品的去除過程影響較大[11]. 因此研究苯胺類化學品在污水處理廠中的歸趨過程，對于評估其環境暴露，環境風險防控具有重要意義.
生物降解性測試目前普遍采用經濟合作與發展組織提出的化學品生物降解性測試導則，包括快速生物降解性301、 固有生物降解性302和模擬生物降解性303A[12]，利用這種層層遞進的方式來評估其在環境中的歸趨過程. 模擬生物降解303A與快速生物降解性測試(301系列)的不同之處在于測試過程中活性污泥的濃度高低以及活性污泥是否經過馴化等; 模擬生物降解303A是更高水平的測試，更接近于實際情況，比快速生物降解性301、 固有生物降解性302的結果更真實和可靠[13]，能為評估化學品在污水處理廠的去除和歸趨提供有效的實驗數據[14].
4-硝基苯胺以及氯代苯胺是一類典型的苯胺取代物，可以通過皮膚以及眼睛滲透進動物體，具有潛在的致癌以及誘發基因突變[15, 16]的嚴重影響，近年來許多國家將此類物質列為優先污染物[17, 18]，4-異丙基苯胺主要來源于除草劑異丙隆的合成和代謝[19]，但是關于它們的環境風險影響現在文獻中鮮有報道，因此，本文在303A方法的基礎上著重研究了不同水力停留時間條件下4-硝基苯胺、 4-異丙基苯胺和2-氯-4-硝基苯胺的生物降解性，探討了這3種化學品的生物降解動力學及降解影響因素，以期為此類化學品的環境暴露評估以及廢水處理提供基礎數據.
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑
好氧生化污水處理模擬系統見圖 1; 液質聯用儀(; TOC分析儀(3100，耶拿，德國); 分析天平(MS105DU，梅特勒，瑞士); 高速冷凍離心機; 水質多參數測定儀(HQ 40d，哈希，美國); 純水器.
A. 貯存罐; B.進水泵; C.曝氣罐(4.5 L); D.沉降池(2.3 L); E.回流泵; F.收集罐圖 1 好氧生化污水處理模擬系統
4-硝基苯胺(CAS:100-01-6，分析純); 4-異丙基苯胺(CAS：99-88-7，分析純); 2-氯-4-硝基苯胺(CAS:121-87-9，分析純)均購自百靈威化學. 甲醇(色譜純，Merck KGaA).
實驗中的活性污泥采自南京某生活污水處理廠的曝氣池.
1.2 好氧生化污水處理模擬實驗方法
生化污水處理模擬系統(如圖 1)放置于室溫(25℃±0.2℃)避光環境中，將活性污泥懸浮液(3 g ·L-1)接種于曝氣罐中，開啟電源及曝氣泵，連續充氧. 并加入適量合成污水(牛肉浸膏11 g ·L-1，蛋白胨16 g ·L-1，尿素3g ·L-1，NaCl 0.7 g ·L-1，CaCl2 ·H2O 0.4g ·L-1，MgSO4 ·7H2O 0.2 g ·L-1，磷酸氫二鉀 2.8 g ·L-1)[20]作為提供活性污泥生長的能源.
實驗期間不斷向貯存罐中加入含苯胺類化學品和合成污水，保持進水苯胺類化學品的濃度為1 mg ·L-1且溶解性有機碳濃度為100 mg ·L-1. 開啟進水提升泵和污泥回流泵，初始實驗溶液以420 mL ·h-1的流速進入曝氣罐中，平均水力停留時間(HRT)約為11.2 h，污泥停留時間為8 d. 當化學品去除率達到穩定后，調整進水泵轉速改變水力停留時間(6、 12和24 h)繼續測試. 實驗期間，每天測定曝氣罐中活性污泥懸浮固體的濃度，并定期去除回流的剩余污泥，使污泥濃度穩定在3 g ·L-1.
實驗期間，定期取進水及出水各10 mL，過0.45 μm濾膜，加200 μL 0.1 mol ·L-1鹽酸酸化去除水樣中無機碳后，用TOC分析儀測定DOC，每個樣品3個平行. 使用水質多參數測定儀測定曝氣罐中pH、 溶解氧(DO). 從曝氣罐中收集100 mL污泥，高速離心機(10 000 r ·min-1)離心5 min后棄去上清液，將下層污泥團稱重后置于105℃中烘干、 稱重，差值法計算混合液中的懸浮固體含量.
LC-MS/MS方法：取進水、 出水以及回流污泥樣品，加入等體積的甲醇超聲25 min后過0.22 μm濾膜后，采用電噴霧離子源、 負電離模式、 多反應離子監測掃描定量分析目標物. 氣簾氣壓350 000 Pa，噴霧氣壓379 214 Pa，輔助加熱氣壓413 688 Pa，源溫度450℃，離子化電壓5 500 V. 選擇ZORBAX Eclipse Plus C18 Column (150 mm×2.1 mm，3.5 μm，Agilent，USA)分離樣品. 流動相2 mmol ·L-1甲酸銨水溶液(A)和乙腈(B)，以0.5 mL ·min-1流速進行梯度洗脫，進樣量5 μL，梯度洗脫條件見表 1.
表 1 梯度洗脫程序
1.3 生物降解動力學實驗方法
模擬實驗結束時，此時活性污泥已對苯胺類化學品完全適應，從曝氣罐中取200 mL活性污泥懸浮液，使用高速冷凍離心機(5 000 r ·min-1)離心5min后棄去上清液，然后用去離子水重新溶解污泥團，充分混勻分散后重復上述步驟至少3次，從而盡可能地完全洗滌污泥中的污染物，最后用去離子水將潔凈的污泥配制成3 g ·L-1的懸浮液. 向其中添加3種苯胺類化學品，濃度為1 mg ·L-1，持續攪拌培養，確保溶解氧達到2 mg ·L-1以上，在36 h內定時取樣并測定污泥懸浮液中的化學品濃度.
1.4 數據處理與計算
采用Office Excel表格計算與處理數據，涉及的主要計算如下.
1.4.1 DOC去除率計算
式中,Dt為系統中t時刻DOC去除率(%); ci為進水DOC質量濃度(mg ·L-1); ce為出水時的DOC質量濃度(mg ·L-1).
1.4.2 化學品去除率計算
式中,R為化學品去除率(%); STi 為進水化學品質量濃度(mg ·L-1); STe為出水時化學品質量濃度(mg ·L-1).
1.4.3 化學品去除動力學計算
d=d0e-kt (3) 式中,d為t時刻化學品的殘留百分比(%); d0為化學品初始的殘留百分比(%); k為反應速率(h-1); t為時間(h).
式中,DT50為化學品濃度減少一半的時間(h); k為反應速率(h-1).
所得數據采用Origin8繪圖軟件作圖.
2 結果與討論 2.1 生化污水處理模擬系統運行情況
活性污泥中含有大量微生物，微生物活性對化學品生物降解性結果影響顯著. 模擬系統中DOC去除率，是反映微生物活性以及系統是否運轉正常的重要指標，不同HRT(6、 12、 24 h)對系統DOC去除的結果見圖 2. HRT為6、 12和24 h時，系統DOC平均去除率從70.2%依次增加至80.3%、 88.3%. HRT較短時，化學品與微生物接觸時間較短，還未充分生物利用就被排出系統，增加HRT可以促進化學品的降解; 但是實際污水處理廠中，需根據進水量、 進水水質、 處理能力、 運行成本等多方面因素綜合設定合適的HRT.
圖 2 不同水力停留時間下的DOC去除率
污水處理廠曝氣池pH是影響生物降解性的重要影響因素，pH過高不利于污泥生長，還會破壞新生的污泥[21]; pH值過低時菌膠團生長受到抑制，而真菌生長占據優勢，污泥絮體將遭到破壞和污泥膨脹等[22]. 通常在好氧生化反應池中，能降解硝基苯類化合物的優勢菌屬最適的pH為6.5~8.5[3, 23]，由圖 3可見，本模擬實驗曝氣罐中pH維持在6~8，適宜開展苯胺類化學品的生物降解研究.
在好氧生化反應池中，溶解氧是反映一個好氧系統生物活性能力的重要參數，溶解氧濃度要達到2 mg ·L-1以上時，才能為好氧菌群提供充足的氧. 如圖 3所示，實驗期間，氧化罐中溶解氧初始值為4.4 mg ·L-1，隨著系統穩定運行后逐步穩定在8.5 mg ·L-1，由于本模擬系統較小，通過連續曝氣，溶氧濃度較易控制.
圖 3 實驗過程中溶解氧和pH變化
2.2 HRT對苯胺類化學品去除率的影響
在好氧生化污水處理模擬系統中，HRT是影響化學品去除率的重要因素，它是可以人為調控的關鍵參數. HRT過大會使有機質過度增長從而對微生物產生聚集和毒性影響，HRT過短會導致細菌分散沖蝕[24]，因此有必要通過實驗研究獲取合適的水力停留時間，從而維持系統的穩定運行以及準確的化學品去除率.
實驗期間，通過調節水力停留時間(12、 24、 6 h)，分析進、 出水苯胺類化學品的去除率. 結果顯示見圖 4，初始HRT設置為12 h時，3種化學品12~15 d去除率非常低，其中2-氯-4-硝基苯胺和4-硝基苯胺去除率基本為0，4-異丙基苯胺去除率約為15%. 實驗開始21 d后，3種物質開始有了明顯的去除，其中2-氯-4-硝基苯胺去除率不穩定，在0和15%之間波動; 4-硝基苯胺去除率從28%上升至88%，平均去除率約為64.7%; 4-異丙基苯胺去除率從30%上升至98%，平均去除率約為76%. 這3種化學品出現較長的降解停滯期(12~15 d)，在此期間，微生物可能需適應此類化學品，同時也可能是降解優勢菌種的生長對數期.
實驗開始34 d后，將HRT由12 h調節為24 h，4-硝基苯胺去除率增加并維持在69%~89.4%; 4-異丙基苯胺去除率上升至79%~99%，它們的平均去除率分別為75%和91%. 2-氯-4-硝基苯胺去除率仍然很低，去除率約為11%.
實驗開始62 d后，將HRT由24 h調節為6 h，4-硝基苯胺去除率降低至55%，此后去除率在35%~56%范圍波動，平均去除率為48%. 4-異丙基苯胺去除率降至59%，此后去除率在48%~75%范圍波動，平均去除率為66%. 2-氯-4-硝基苯胺在HRT為6 h時，去除率低于15%.
分析可知，當微生物適應3種苯胺類化學品后，HRT為12h和24 h時，4-硝基苯胺和4-異丙基苯胺的平均去除率均可達到80%; HRT為6 h時，4-硝基苯胺和4-異丙基苯胺去除率顯著降低，且去除率穩定性降低; 2-氯-4-硝基苯胺則在所有條件下都未觀察到明顯的去除. 本研究表明在好氧污水處理系統中，HRT為24 h時可以有效且穩定去除苯胺類化學品.
圖 4 苯胺類化學品在不同水力停留時間的降解速率曲線
亨利常數(H)可用于表征化學品在水氣界面之間的分配過程，根據Whiteman雙阻力理論，當化學品H=2.5 Pa ·(m3 ·mol)-1時，化學品從水相遷移至氣相時，水相的阻力為氣相阻力的十分之一，揮發速率可以忽略[25]. 4-硝基苯胺、 4-異丙基苯胺以及2-氯-4-硝基苯胺H分別為0.035、 0.5和9.67×10-4 Pa ·(m3 ·mol)-1，它們的H遠小于2.5 Pa ·(m3 ·mol)-1[26]，因此在曝氣過程中的揮發性損失可以忽略. 當化學品吸附系數(lgkoc)大于3.3時，化學品可能會顯著地吸附于污泥中并隨剩余污泥排出系統[27]，4-硝基苯胺、 4-異丙基苯胺以及2-氯-4-硝基苯胺的lgkoc分別為1.64、 2.53、 2.25，不具有顯著吸附性. 此外，有文獻提到自然界中的硝基類芳香化合物以及2-氯-4硝基苯胺只有通過人工催化發生光氧化反應，并且自發的光降解反應對污染物去除的貢獻值極低[28, 29]，好氧生化污水處理系統位于較暗的室內環境，因此由光照引起的化學品輕微的降解可以忽略. 綜上，可以初步確定本研究中3種化學品在系統中的去除主要源自于生物降解.
2.3 苯胺類化學品的生物降解動力學
模擬生物降解性303A實驗方法只能得到化學品的去除率結果，無法得到化學品生物降解速率和降解動力學信息，而該信息在化學品風險評估中可用于評估環境暴露水平. 本研究使用模擬實驗中已經完全馴化和適應的活性污泥測定過的3種苯胺類化學品的生物降解動力學參數. 由圖 5降解曲線可知，4-硝基苯胺和4-異丙基苯胺易降解，36 h后生物降解率分別為80%和98%; 2-氯-4-硝基苯胺生物降解速率極低，36 h后生物降解率為20%.
圖 5 3種化學品的降解動力學曲線
化學品降解通常遵循一級動力學方程，表 2列出了按照一級動力學方程擬合的3種化學品的動力學去除方程、 降解速率常數以及半衰期. 3種化學品一級動力學曲線擬合相關性均在0.95以上. 4-異丙基苯胺、 4-硝基苯胺和2氯-4-硝基苯胺在好氧生化活性污泥中的降解半衰期分別為6.01、 16.16和123.75 h. 有研究表明，在好氧條件下適當濃度的硝基芳香化合物可以發生降解[30]，Khalid等[31]通過混合培養不動桿菌等3種微生物去除染料廢水中4-硝基苯胺，發現初始濃度為100 μmol ·L-1的4-硝基苯胺在72 h內可完全去除，楊彬等[32]研究也表明4-硝基苯胺在好氧條件下具有較高的降解速率，與本研究結果一致.
表 2 3種化學品動力學方程、 降解速率與半衰期
OECD 303A實驗模擬了真實的生物質與受試物濃度[33]，能客觀評估苯胺類化學品在污水處理階段的歸趨，通常3 g ·L-1的活性污泥濃度是好氧降解條件下微生物的最高濃度，而在地表水等其他環境中微生物濃度遠遠低于此濃度. 有研究認為化學品生物降解速率正比于微生物的細胞數量[34]，因此也可據此將本研究中化學品在好氧活性污泥中的降解速率外推獲得在地表水等環境中的生物降解速率.
2.4 苯胺類化學品取代基對生物降解性的影響
有機化合物的結構決定了其在環境中的生物降解性. 苯胺是易于生物降解的化學品，本研究中3種取代苯胺所含的官能團有—NO2、 —Cl和異丙基，它們的生物降解速率從高到低依次為，4-異丙基苯胺>4-硝基苯胺>2-氯-4-硝基苯胺. 通過定量結構與生物降解性關系[35]研究發現，異丙基對化學品生物降解起著積極的作用[36]，而—NO2、 —Cl等基團吸電子能力強，會降低微生物中酶的活性，阻礙化學品的生物降解性[37]. 因此，4-硝基苯胺的生物降解速率比4-異丙基苯胺小. 2-氯-4-硝基苯胺未發現明顯的生物降解也是因為苯環上同時引入氯原子及硝基2個吸電子基團后，苯環電子云密度減小，導致微生物及相關酶的親電攻擊性減弱，此外由于碳-氯鍵的牢固性，使得此類物質難以降解[6]. 化學品自身組成對它們生物降解性的影響有待進一步研究.
此外，—NO2、 —Cl等基團對微生物還有一定的毒性作用，本研究中添加的實驗濃度較低(1 mg ·L-1)，避免了較高濃度下對微生物產生的毒性抑制作用，因此本研究中得到的苯胺類化學品的生物降解結果更能反映它們在真實環境條件下的情形.具體參見污水寶商城資料或http://www.dongaorq.cn更多相關技術文檔。
3 結論
(1)提高HRT可促進DOC以及苯胺類化學品的去除. HRT為6、 12和24 h時，系統DOC去除率依次為70.2%、 80.3%和88.3%; 4-硝基苯胺去除率分別為48%、 64.7%和75%; 4-異丙基苯胺的去除率分別為66%、 76%和91%. 2-氯-4-硝基苯胺在不同HRT條件下，較難去除，去除率平均值低于20%.
(2)4-硝基苯胺、 4-異丙基苯胺和2-氯-4-硝基苯胺的降解符合一級動力學方程，回歸系數皆大于0.95，生物降解半衰期分別為6.01、 16.16和123.75 h.
(3)苯胺類化學品取代基對好氧生物降解性影響顯著，異丙基對降解有積極作用，硝基和氯原子等基團抑制生物降解.（來源及作者：南京工業大學化學與分子工程學院 古文 徐炎華 陳國松 環境保護部南京環境科學研究所 劉濟寧 陳國松 周林軍 石利利）
