隨著工業(yè)及社會經(jīng)濟的迅速發(fā)展，水體富營養(yǎng)化污染日益嚴重，水中氮素污染的去除已成為當(dāng)今水污染防治領(lǐng)域的熱點問題.近年來，污水處理排放標準日益嚴格，污水中總氮的去除難度也將逐漸提高.理論認為，生物脫氮由硝化反應(yīng)和反硝化反應(yīng)協(xié)同完成，反硝化作用通過反硝化酶系在缺氧/厭氧條件下的活性表達而實現(xiàn)總氮的去除.傳統(tǒng)活性污泥法、好氧顆粒污泥[3]和人工濕地等技術(shù)都是基于硝化反硝化的脫氮技術(shù).然而近年來涌現(xiàn)的厭氧氨氧化和好氧反硝化等技術(shù)則有別于傳統(tǒng)生物脫氮理論，其中隨著Robertson等對好氧反硝化菌和好氧反硝化酶系的研究逐步深入，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)反硝化過程不僅可以在缺/厭氧條件下發(fā)生，在好氧條件也能進行并具有較好的脫氮效果.

　　完全混合式曝氣系統(tǒng)具有占地面積較小，投資和能耗較低，抗沖擊負荷能力較強的優(yōu)點，曝氣系統(tǒng)內(nèi)各點底物濃度，污泥濃度和需氧速率相同，為系統(tǒng)內(nèi)同步硝化反硝化發(fā)生提供了基礎(chǔ).到目前為止對同步硝化反硝化作用機制存在不同認知：微環(huán)境理論認為物質(zhì)傳遞(有機物、電子受體)、菌膠團結(jié)構(gòu)及各類微生物分布和活動等致使菌膠團內(nèi)部形成多種多樣的微環(huán)境類型，為同步硝化反硝化的存在創(chuàng)造可能;而從生物學(xué)角度闡釋同步硝化反硝化機制則始于對好氧反硝化菌株Thiosphaera pantotropha的研究，好氧反硝化菌細胞內(nèi)存在不受DO抑制的反硝化酶系統(tǒng)，其好氧反硝化能力與胞內(nèi)特殊硝酸鹽還原酶--周質(zhì)硝酸鹽還原酶表達密切相關(guān)，Huang等對具有好氧反硝化功能的菌株DNA進行周質(zhì)硝酸鹽還原酶亞基基因napA擴增，得到了明顯的DNA特異條帶，證明了好氧反硝化菌可以表達周質(zhì)硝酸鹽還原酶.但目前基于完全混合式曝氣系統(tǒng)同步硝化反硝化的形成條件和污泥微生物菌種結(jié)構(gòu)解析的研究還相對較少，從而限制了完全混合式曝氣系統(tǒng)的發(fā)展與應(yīng)用.

　　因此，本文以無錫市某污水處理廠100 t·d-1完全混合式曝氣系統(tǒng)的運行為出發(fā)點，通過進出水水質(zhì)分析，研究系統(tǒng)對污染物的去除效能;結(jié)合反硝化速率靜態(tài)試驗，闡明系統(tǒng)污泥在好氧條件下的反硝化脫氮能力;通過周質(zhì)硝酸鹽還原酶PCR擴增和高通量測序技術(shù)，對系統(tǒng)污泥微生物菌群結(jié)構(gòu)和多樣性進行解析，并確定系統(tǒng)內(nèi)優(yōu)勢菌群，以期為完全混合式曝氣系統(tǒng)的反硝化脫氮應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐.

　　1 材料與方法1.1 完全混合式曝氣系統(tǒng)運行

　　完全混合式曝氣系統(tǒng)(中試規(guī)模)在無錫某城鎮(zhèn)污水處理廠運行，系統(tǒng)為鋼板池體，長約為10 m、寬為1.5 m、高為3.5 m，設(shè)計處理能力為100 t·d-1，工藝流程如圖 1所示.原水通過進水泵進入生化罐，然后依次流經(jīng)生化池1、生化池2和生化池3，生化罐及各生化池底部均布置穿孔管曝氣，最后進入過濾沉淀池進行泥水分離(利用沉淀池中部微孔過濾器進行泥水分離，微孔濾料孔徑為0.45 μm，對反應(yīng)器內(nèi)污泥進行截留)，處理后出水外排.系統(tǒng)包括兩套回流系統(tǒng)，分別維持生化罐和生化池內(nèi)的污泥濃度.系統(tǒng)自2011年啟動運行，效果穩(wěn)定，2015年春節(jié)前停止運行，春節(jié)后再次啟動，運行參數(shù)如下：進水流量為3 m3·h-1，HRT為10~12 h，SRT大于30 d，反應(yīng)器內(nèi)污泥濃度為7~10 g·L-1，回流比Q1為150~200%，Q2為200%，DO設(shè)定為1~3 mg·L-1，濾料反沖洗頻率為8 h.污泥來源于污水處理廠好氧池.

　　1.2 進水水質(zhì)

　　完全混合式曝氣系統(tǒng)進水取自污水處理廠提升泵房之前深度約4.5 m左右的污水，水質(zhì)如表 1所示.

　　表 1 污水處理廠進水水質(zhì)/mg·L-1

　　1.3 試驗方法1.3.1 污染物指標測定

　　COD、NH4+-N、TN、NO2--N和NO3--N通過標準方法進行測定;DO、pH采用Multi3410型溶氧儀測定.

　　1.3.2 反硝化模擬試驗

　　為了驗證完全混合式曝氣系統(tǒng)中污泥在不同DO梯度下的反硝化活性差異，對系統(tǒng)污泥進行反硝化模擬試驗.共設(shè)置3組試驗，控制溫度為20℃，初始硝態(tài)氮濃度45 mg·L-1，以無水乙酸鈉為碳源，按C/N=7投加，采用微曝氣供氧，反應(yīng)過程DO濃度分別控制為0.1~0.2、1.0~2.0和2.0~3.0 mg·L-1，污泥濃度均控制為4 000 mg·L-1左右(MLVSS/MLSS=0.52).分別在反應(yīng)第0、30、60、90、120、150、180、210和240 min取樣，將取出的混合液過濾后測定其硝酸鹽濃度.最后根據(jù)不同時刻硝酸鹽濃度變化與測定混合液中MLVSS的值，計算反硝化速率.

　　1.3.3 同步硝化反硝化能力測定

　　完全混合式曝氣系統(tǒng)的同步硝化反硝化能力(simultaneous nitrification and denitrification，SND)可以通過計算同步硝化反硝化率[式(1)]和同步硝化反硝化速率[式(2)]得到：

        式中，Efficiency(SND)為同步硝化反硝化率(%);R(SND)為同步硝化反硝化速率mg·(L·h)-1;NH4(oxidized)+為NH4+-N的消耗量(mg·L-1);NOx(produced)-為NO3--N和NO2--N的生成量(mg·L-1);t為運行時間(h).

　　1.3.4 總DNA提取及測序

　　取適量系統(tǒng)污泥樣品放入2 mL離心管內(nèi)，充分振蕩30 s，在10 000 r·min-1條件下離心1 min，棄去上清液.樣品經(jīng)預(yù)處理后采用MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒提取污泥樣品中微生物總宏基因組，然后用NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測DNA的濃度和純度，最后置于-20℃下保存?zhèn)溆?測序工作由上海晶能生物技術(shù)有限公司完成，測序儀器(平臺)為Illumina MiSeq，采用Trimmomatic軟件對序列進行去雜，采用Qiime軟件進行群落豐度計算.

　　1.3.5 周質(zhì)硝酸鹽還原酶亞基基因(napA)的PCR擴增

　　由于污泥長期在完全混合式曝氣系統(tǒng)中馴化，因此對系統(tǒng)污泥中是否存在好氧反硝化菌進行鑒定.采用周質(zhì)硝酸鹽還原酶亞基基因保守區(qū)的一部分序列為引物，引物NAP1(5′-TCTGGACCATGGGCTTCAACCA-3′)和NAP2(5′-ACGACGACCGGCCAGCGCAG-3′)，擴增產(chǎn)物長度為877bp. PCR反應(yīng)體系(50 μL)：10×buffer 4 μL，dNTP2 μL，引物NAP1和引物NAP2各1 μL，模板DNA 1 μL，Taq酶(10 000 U·mL-1)0.8 μL，重蒸水38.2 μL. PCR程序如下：94℃變性5 min;然后進行30個循環(huán)：94℃，30 s;59℃，30 s;72℃，60 s;最后72℃延伸7 min. PCR產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證.

　　2 結(jié)果與討論2.1 COD去除效果

　　完全混合式曝氣系統(tǒng)對沖擊負荷表現(xiàn)出較好的抵抗能力，系統(tǒng)穩(wěn)定運行后，盡管進水COD濃度波動較大，但出水COD較穩(wěn)定，基本維持在7.8~35.3 mg·L-1，平均值為17.1 mg·L-1，優(yōu)于GB 18918-2002的一級A排放標準，COD去除率為82.4%~98.3%，平均去除率為93.2%.結(jié)果表明維持系統(tǒng)較高的污泥濃度(7~10 g·L-1)可以保證生物降解的穩(wěn)定性，使整個工藝對COD的去除保持在較高水平.

　　圖 2顯示了系統(tǒng)沿程COD變化趨勢.原水COD濃度約346 mg·L-1，進入系統(tǒng)后迅速下降，經(jīng)過回流稀釋作用及曝氣條件下異養(yǎng)菌對碳源的消耗，生化罐中混合液COD濃度已降至86 mg·L-1，系統(tǒng)出水COD濃度約為20 mg·L-1.由此可見，完全混合式曝氣系統(tǒng)具有較強的COD去除能力，其原因在于：① 系統(tǒng)采用完全混合曝氣的模式，強化了異養(yǎng)菌對有機物的降解與消耗;② 系統(tǒng)具有較大的回流，延長了污水實際水力停留時間，從而強化了系統(tǒng)對有機污染物的去除能力.完全混合式曝氣系統(tǒng)可以為包括好氧反硝化菌在內(nèi)的異養(yǎng)微生物提供適宜的生長環(huán)境，而大部分好氧反硝化菌同時具有異氧硝化及代謝降解有機物的能力，可以在曝氣條件下表現(xiàn)出對有機底物較高的去除能力.

圖 2 進出水COD濃度及沿程變化特征

　　2.2 氮去除效果

　　完全混合式曝氣系統(tǒng)進出水NH4+-N、TN變化曲線如圖 3所示.系統(tǒng)進水NH4+-N為1.33~57.1 mg·L-1，均值為30.3 mg·L-1，出水NH4+-N為0.2~5.6 mg·L-1，均值為0.89 mg·L-1，平均去除率達96.9%，出水NH4+-N超標率低于2%.系統(tǒng)進水TN波動較大，在7.7~58.3 mg·L-1之間，均值為33.6 mg·L-1，出水TN在1.9~26.9 mg·L-1范圍波動，平均去除率為75.2%，均值為7.8 mg·L-1，出水氨氮和TN均優(yōu)于GB 18918-2002的一級A排放標準，表明系統(tǒng)具有較強的脫氮能力.當(dāng)系統(tǒng)運行至第70 d左右時，出水TN濃度高于20 mg·L-1，這是由于濾池內(nèi)濾料出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象，增加系統(tǒng)反沖洗頻率后使反沖洗過程中部分污泥顆粒隨出水流出，導(dǎo)致系統(tǒng)TN升高.但在恢復(fù)反沖洗頻率后，出水水質(zhì)得以改善.

圖 3 進出水NH4+-N和TN濃度的變化

　　為了考察完全混合式曝氣系統(tǒng)各單元對氮轉(zhuǎn)化的作用和貢獻，對其各單元出水中氮組分及濃度進行測定，結(jié)果如圖 4所示.根據(jù)式(1)和(2)計算得生化罐的同步硝化反硝化率為99.6%，同步硝化反硝化速率為32.9 mg·(L·h)-1，生化罐中具有良好的同步硝化反硝化能力，氨氮進入生化池1后持續(xù)降低，最終出水氨氮低于1 mg·L-1.生化池1的同步硝化反硝化率為94%，同步硝化反硝化速率為1.1 mg·(L·h)-1.由圖 4中總氮，硝態(tài)氮及亞硝態(tài)氮的變化可知，系統(tǒng)同時具備較強的反硝化脫氮能力，而且不存在亞硝酸鹽的積累現(xiàn)象.系統(tǒng)僅在單一曝氣條件下就能實現(xiàn)同步硝化反硝化，有效節(jié)省了占地面積并在系統(tǒng)堿度維持方面更具有經(jīng)濟性.

圖 4 不同形態(tài)氮濃度的沿程變化

　　為進一步研究系統(tǒng)各反應(yīng)單元的實際運行狀態(tài)，對每個反應(yīng)單元的DO進行24 h連續(xù)監(jiān)測，結(jié)果如表 2所示.生化罐和生化池1內(nèi)溶解氧較低，其DO均低于0.5 mg·L-1，生化池2和生化池3的DO濃度較高，一般維持在1~4 mg·L-1.其原因在于進水有機物濃度較高，異養(yǎng)菌在曝氣條件下快速降解有機物并消耗大量溶解氧，導(dǎo)致在系統(tǒng)前段(生化罐和生化池1)溶解氧明顯低于設(shè)定值.隨著有機物的消耗，系統(tǒng)后段(生化池2和生化池3)的DO濃度逐漸上升.通過核算發(fā)現(xiàn)生化罐和生化池1中硝酸鹽濃度分別降低1.82 mg·L-1和1.67 mg·L-1，而在生化池2和生化池3中硝酸鹽濃度略有上升，但總氮呈降低趨勢，系統(tǒng)中可能存在好氧反硝化菌群.研究表明不同菌屬的好氧反硝化菌對DO的耐受能力存在顯著差異，大部分好氧反硝化菌在DO濃度低于3 mg·L-1時仍具有較高的反硝化活性.根據(jù)系統(tǒng)氮平衡分析，生化罐和生化池1中的同步硝化反硝化現(xiàn)象明顯強于生化池2和生化池3，其原因可能基于以下兩方面：第一，系統(tǒng)前段C/N明顯高于后段，較高的C/N能保證充足的碳源，進而有利于反硝化反應(yīng)順利進行，Ahmad也在研究中發(fā)現(xiàn)，好氧反硝化菌的反硝化活性同樣隨著C/N的升高而增大;第二，較低的DO濃度有利于活性污泥絮體內(nèi)部形成缺氧微環(huán)境，從而使缺氧反硝化與好氧反硝化相協(xié)同，進一步強化同步硝化反硝化效果.

　　表 2 系統(tǒng)DO分布/mg·L-1

　　2.3 反硝化特性

　　反硝化模擬試驗的硝態(tài)氮濃度隨時間變化曲線如圖 5所示，在DO濃度為0.1~0.2 mg·L-1時，完全混合式曝氣系統(tǒng)中污泥在最初的2 h內(nèi)硝酸鹽還原效果明顯，其脫氮速率(以NO3--N/MLVSS計，下同)為4.09 mg·(g·h)-1.當(dāng)DO濃度在1.0~2.0 mg·L-1和2.0~3.0 mg·L-1時，污泥脫氮速率分別為0.73和0.67 mg·(g·h)-1，系統(tǒng)污泥在低DO濃度條件下的脫氮能力約為高DO濃度條件下的5.8倍.這是因為系統(tǒng)污泥中的反硝化菌群適應(yīng)低DO條件，從而表現(xiàn)出更高的活性;同時，DO會優(yōu)先于NO3--N被異養(yǎng)微生物利用，且相對較高DO濃度會有利于異養(yǎng)菌消耗有機物，從而使反硝化菌群在高DO條件下的反硝化能力受到抑制[22].當(dāng)DO較高時，系統(tǒng)污泥仍具有較好的反硝化效果，表明系統(tǒng)中可能存在好氧反硝化菌群.

圖 5 不同DO條件下污泥反硝化效果

　　取污水處理廠污泥與系統(tǒng)污泥反硝化能力進行對比發(fā)現(xiàn)，當(dāng)控制DO濃度為0.1~0.2 mg·L-1時，兩座污水處理廠缺氧池污泥反硝化能力明顯受到抑制，其脫氮速率僅為0.58和1.43 mg·(g·h)-1，反硝化能力明顯低于完全混合式曝氣系統(tǒng)污泥.

　　完全混合式曝氣系統(tǒng)一般運行約30 d即可實現(xiàn)對COD、氨氮和總氮的穩(wěn)定高效去除，隨著進水沖擊負荷的變化，污染物去除效果穩(wěn)定.系統(tǒng)運行過程中極少出現(xiàn)污泥上浮與污泥膨脹等不利現(xiàn)象，適用性較高.

　　2.4 微生物特性

　　由圖 6可知，完全混合式曝氣系統(tǒng)在有氧條件下的反硝化能力明顯優(yōu)于傳統(tǒng)活性污泥，因此對活性污泥進行周質(zhì)硝酸鹽還原酶亞基基因(napA)的PCR擴增.

圖 6 系統(tǒng)污泥與傳統(tǒng)活性污泥在低DO條件下的反硝化效果

　　試驗結(jié)果如圖 7所示，編號1、2和3為系統(tǒng)春季運行時污泥樣品;4和5為污水處理廠A缺氧池污泥樣品(系統(tǒng)所在污水處理廠);6和7為污水處理廠B缺氧池污泥樣品;8和9為系統(tǒng)秋季運行時污泥樣品.系統(tǒng)污泥得到明顯清晰的877 bp的DNA特異條帶，表明系統(tǒng)污泥存在周質(zhì)硝酸鹽還原酶亞基基因napA，可以表達周質(zhì)硝酸鹽還原酶，污泥中含有典型的好氧反硝化細菌，其在好氧條件下經(jīng)由周質(zhì)硝酸鹽還原酶的催化還原硝酸鹽，產(chǎn)生氮氣實現(xiàn)好氧反硝化，提高系統(tǒng)的總氮去除能力.污水處理廠A中活性污泥顯示存在特異性條帶，表明污水處理廠A中存在少量好氧反硝化菌，但是其強度較低，未在反硝化微生物中占優(yōu)勢，無法顯著增強污水處理廠A的總氮去除效果，而污水處理廠B幾乎不存在好氧反硝化菌.

圖 7 PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖像

　　為準確反映完全混合式曝氣系統(tǒng)內(nèi)的微生物群落結(jié)構(gòu)，對系統(tǒng)穩(wěn)定運行的不同時期(春季和秋季)的微生物群落結(jié)構(gòu)進行解析.通過高通量測序發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)污泥中微生物共有42個綱，污泥微生物比例分布如圖 8所示(選取比例超過1%的綱繪入圖中).不同時期系統(tǒng)污泥微生物菌群結(jié)構(gòu)基本一致，以變形菌綱為主，其中β變形菌綱、γ變形菌綱、δ變形菌綱和α變形菌綱比例分別占變形菌綱54.45%、10.60%、7.80%和7.85%;鞘脂桿菌綱占6.02%，厭氧繩菌綱占2.71%，放線菌綱占1.66%，酸桿菌綱占1.03%.其中β變形菌綱與污水處理過程密切相關(guān)，是污水處理廠脫氮的重要菌群，可以在低溶解氧條件下利用有機物生長繁殖.測序結(jié)果表明(表 3)，系統(tǒng)污泥微生物中動膠菌屬(Zoogloea)，陶厄氏菌屬(Thauera)和Dechloromonas菌屬始終處于優(yōu)勢地位，其中Zoogloea屬與菌膠團的形成有密切關(guān)系，可能會促進系統(tǒng)實現(xiàn)同步硝化反硝化作用;Thauera屬是β變形菌中的一類革蘭氏陰性細菌，大部分為桿狀且以反硝化菌居多，如T. aromatica、T.mechernichensis和T. terpenica等，而其中T. mechernichensis是一類典型的好氧反硝化菌;Dechloromonas菌屬具有良好的反硝化功能，主要功能菌D. agitate和D. denitrificans都具有較強的硝酸鹽還原能力[23].隨著季節(jié)的變化，僅Azohydromonas和Longilinea菌屬存在較大波動，但污泥微生物群落結(jié)構(gòu)整體變化較小，使完全混合式曝氣系統(tǒng)始終保持良好的脫氮效能.完全混合式曝氣系統(tǒng)內(nèi)污泥微生物多樣性豐富，為系統(tǒng)的高效脫氮奠定了基礎(chǔ).具體參見污水寶商城資料或http://www.dongaorq.cn更多相關(guān)技術(shù)文檔。

圖 8 系統(tǒng)中污泥微生物綱的分布比例

　　表 3 系統(tǒng)污泥微生物優(yōu)勢菌屬及其比例/%

　　3 結(jié)論

　　(1) 采用完全混合曝氣系統(tǒng)處理污水，在無外加碳源的情況下，取得較好的有機物去除效果和脫氮效果，COD、NH4+-N和TN的去除率分別為93.2%、96.9%、75.2%，出水COD、NH4+-N和TN均優(yōu)于一級A排放標準.

　　(2) 完全混合式曝氣系統(tǒng)中污泥在低DO濃度(0.1~0.2 mg·L-1)條件下具有較高的反硝化能力，其脫氮速率是污水處理廠污泥的2.86倍以上.當(dāng)DO濃度大于1 mg·L-1時，系統(tǒng)污泥仍具有一定反硝化能力，其脫氮速率與污水處理廠污泥相當(dāng).

　　(3) 周質(zhì)硝酸鹽還原酶亞基基因napA的PCR擴增結(jié)果表明，系統(tǒng)內(nèi)存在一定濃度的好氧反硝化菌.系統(tǒng)內(nèi)污泥微生物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，以變形菌綱為主，動膠菌屬(Zoogloea)，陶厄氏菌屬(Thauera)和Dechloromonas菌屬為優(yōu)勢菌屬.