1 引言(Introduction)

　　生物膜是由附著于固體載體表面的微生物和其自身分泌的胞外聚合物(EPS)所形成的結構性微生物群落(Costerton et al., 1999).有害生物膜的形成會給很多領域帶來不利影響, 如醫療器械表面的生物膜會造成病人感染(Zodrow et al., 2012), 飲用水管網污染生物膜會造成管道腐蝕及水污染(Percival et al., 1999;Shaw et al., 2014), 生物膜還會造成凈水設備膜材料表面污染(Yu et al., 2012), 因此, 如何有效抑制有害生物膜的形成成為很多領域面臨的嚴峻挑戰.

　　以往人們采用傳統的殺菌/抗菌劑通過殺死微生物細胞來抑制生物膜的形成(夏金蘭等, 2004).在這些傳統的抗菌劑中, 氯是目前世界上使用最廣泛的飲用水消毒劑, 廣泛用于飲用水處理和輸配系統中(Kim et al., 2009).銀離子和納米銀是應用廣泛、殺菌效果優異的無機非金屬殺菌劑(Rai et al., 2009).然而, 長期使用這些傳統殺菌/抑菌劑往往會造成細菌耐藥性的增加.

　　近年來有研究發現, 一些信號小分子物質參與生物膜形成與解體過程的調控(張志剛等, 2011).這些小分子通過非殺菌機制抑制生物膜, 因此, 不會產生細菌耐藥性的問題.例如, 雙(3-氨基丙基)胺能夠直接地、特異性地和EPS中的胞外多糖發生反應, 從而抑制生物膜的形成(Si et al., 2014).香蘭素通過抑制N-酰基-高絲氨酸內酯(N-acyl-homoserine lactone, AHL, acyl-HSL)來干擾細菌的群體感應(Quorum sensing, QS)系統, 從而抑制生物膜的形成(Ponnusamy et al., 2009).溴代呋喃酮通過和AHLs競爭受體蛋白, 或干擾呋喃酰硼酸二酯(Furan acyl boric acid ester, autoinducer-2, AI-2)來干擾細菌的QS系統, 從而抑制生物膜的形成(Jang et al., 2013; Shetye et al., 2013).

　　目前, 利用傳統殺菌劑抑制單一純菌生物膜形成的研究比較多, 而針對污水處理系統混合菌形成的復雜生物膜, 傳統殺菌劑及小分子物質對其抑制效果尚不明確, 有待于深入研究.因此, 本研究選用銀和氯作為傳統抗菌劑, 選用雙(3-氨基丙基)胺、香蘭素和(Z-)-4-溴-5-(溴乙烯)-2(5H)-呋喃酮(BBF)作為小分子物質, 比較這些傳統抗菌劑和小分子對污水處理系統中混合菌生物膜形成的抑制效應, 篩選效果較好的傳統抗菌劑和小分子物質, 并通過測定傳統抗菌劑和小分子物質對微生物生長的影響, 分析其抑制混合菌生物膜形成的可能機理, 以期為生物膜污染控制方法提供一定的理論基礎.

　　2 材料與方法(Materials and methods)2.1 化學試劑和微生物

　　雙(3-氨基丙基)胺和BBF購于Sigma Aldrich (St. Louis, MO), 香蘭素購自生工生物工程上海(股份)有限公司.雙(3-氨基丙基)胺、香蘭素和BBF的化學結構見圖 1.雙(3-氨基丙基)胺和香蘭素溶于超純水, 實驗過程中所用的超純水(電導率為18.2 MΩ·cm)由Milli-Q梯度系統(Millipore, Bedford, MA)生產.BBF溶于純乙醇(99%)制得40 mg·L-1的BBF儲備液.

　　圖 1

　　圖 1雙(3-氨基丙基)胺(a)、香蘭素(b)和BBF (c)的化學結構

　　混合菌取自北京清河污水處理廠的活性污泥.活性污泥首先用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗3遍, 然后通過離心(5000 r·min-1)收集, 將收集的活性污泥重懸于配置的模擬廢水中, 制備混合菌菌懸液(100 mg·L-1, 大約108 CFU·mL-1).模擬廢水成分為(mg·L-1)：COD(以葡萄糖計算) 825, NH4Cl 192, KH2PO4 35.1, NaCl 100, MgSO4 100, CaCl2 10.

　　2.2 不同傳統抗菌劑和小分子物質對混合菌生物膜形成的抑制作用

　　為研究不同傳統抗菌劑和小分子對生物膜形成的抑制作用, 選擇銀和氯作為傳統抗菌劑, 雙(3-氨基丙基)胺、香蘭素和BBF作為小分子.首先在12孔板的每個孔內加入3 mL上述制備好的混合菌菌懸液, 混合菌菌懸液中分別含有不同濃度的上述抗菌劑和小分子.其中, Ag+的最終濃度分別為0.01、0.05、0.1、1、10 mg·L-1, 有效氯的最終濃度分別為0.01、0.1、1、10、20 mg·L-1, 雙(3-氨基丙基)胺的最終濃度分別為100、500、1000、2000 μmol·L-1, 香蘭素的最終濃度分別為0.1、1、10、100、200 mg·L-1, BBF的最終濃度分別為1、10、20 mg·L-1.Ag+、氯、雙(3-氨基丙基)胺和香蘭素的對照組加入等量的超純水, BBF的對照組加入等量的純乙醇.然后將12孔板置于30 ℃的培養箱內靜止培養24 h.培養結束后, 將12孔板從培養箱內取出, 上面附著的生物膜量采用結晶紫染色法進行定量, 方法參考Xiong等(2013)的結晶紫染色法：首先將12孔板用PBS溶液沖洗3遍去除上面松散結合的浮游細菌, 然后通過干燥固定上面的生物膜, 生物膜固定后用500 μL、0.1%的結晶紫染色30 min, 然后用PBS將多余的未與生物膜結合的結晶紫洗干凈.最后, 用1 mL純乙醇將與生物膜結合的結晶紫洗脫30 min.取200 μL洗脫液加入到96孔板內通過酶標儀(Tecan Infinite M200, 瑞士)測定OD600.實驗組的相對生物膜量為與對照組相比的百分數(對照組為100%).

　　2.3 銀和雙(3-氨基丙基)胺對混合菌生長曲線的影響

　　為了研究不同濃度的銀和雙(3-氨基丙基)胺對微生物生長的影響, 將3 mL包含不同濃度的Ag+和雙(3-氨基丙基)胺的混合菌菌懸液加入10 mL離心管內, 然后將離心管置于30 ℃、180 r·min-1的條件下培養, 在不同時間內測定懸浮態混合菌的OD600.

　　2.4 統計分析

　　所有實驗均有3組平行數據.數據進行方差分析(ANOVA), p<0.05被認為具有顯著性, 具有顯著性差異的數據用*表示.

　　3 結果與討論(Results and discussion)3.1 不同傳統抗菌劑對混合菌生物膜形成的抑制效率

　　銀對混合菌生物膜形成的抑制效應見圖 2a.由圖可知, 0.01 mg·L-1的Ag+不能抑制混合菌生物膜的形成, 與對照相比, 0.05 mg·L-1的Ag+對混合菌生物膜形成的抑制率為23%.當Ag+濃度繼續從0.1 mg·L-1增加到10 mg·L-1時, 生物膜抑制率增加到70%左右, 并穩定在該水平, 不再隨Ag+濃度的增加而增加.由圖 2b可知, 與對照相比, 0.01 mg·L-1的氯對生物膜抑制效率為23%;0.1 mg·L-1的氯對生物膜抑制效率為40%, 遠低于該濃度下Ag+的抑制率(70%);當氯濃度從0.1 mg·L-1增加到20 mg·L-1時, 混合菌生物膜形成的抑制率在40%~53%之間, 沒有隨著氯濃度的增加而顯著性地增加.當銀和氯的濃度增加到一定程度時, 其對生物膜形成的抑制率都不再繼續增加, 保持相對穩定.這可能是由于微生物以聚集形式存在的生物膜會對其內部的細菌起保護作用, 相比懸浮態微生物具有更強的殺菌劑耐性;另外, 混合菌中一些耐銀和耐氯微生物的存在也增強了其對殺菌劑的抗性(Silver et al., 2006; Zhang et al., 2013).

　　圖 2

　　圖 2不同濃度的銀(a)和氯(b)對混合菌生物膜形成(24 h)的影響(*表示與對照相比具有顯著性差異(p<0.05), 誤差棒代表 3組平行數據之間的標準偏差, 下同)

　　總體來看, 同等濃度下Ag+對混合菌生物膜形成的抑制率要高于氯, Ag+對混合菌生物膜形成的最高抑制率可達到70%, 優于氯的抑制作用(53%).因此, 相比于氯, Ag+對本研究中所采用的活性污泥混合菌生物膜形成的抑制效率更高.

　　3.2 不同小分子物質對混合菌生物膜形成的抑制效率

　　雙(3-氨基丙基)胺是一種聚胺類小分子物質, 其對生物膜形成的抑制作用與目標菌種有著密切關系(Nesse et al., 2015).關于雙(3-氨基丙基)胺抑制生物膜形成的相關機理, 有研究發現其能直接地、特異性地與微生物聚集體中的胞外多糖發生反應, 通過不同于傳統抑菌/殺菌劑生物膜抑制機制, 抑制活性污泥生物膜的形成(Si et al., 2014).也有研究表明, 雙(3-氨基丙基)胺能夠干擾S. mutans的群體感應系統, 從而改變其生物膜中胞外多糖的結構(Ou et al., 2017).本研究中不同濃度的雙(3-氨基丙基)胺對生物膜形成抑制的效應見圖 3a, 隨著雙(3-氨基丙基)胺濃度的升高, 混合菌生物膜的附著量逐漸降低.與對照組相比, 100 μmol·L-1的雙(3-氨基丙基)胺不會抑制混合菌生物膜形成, 當其濃度增加到500 μmol·L-1時, 生物膜抑制率達到16%.當雙(3-氨基丙基)胺的濃度增加到1000和2000 μmol·L-1時, 生物膜的抑制率顯著增加到60%和68%.表明雙(3-氨基丙基)胺能夠有效抑制混合菌生物膜的形成, 在高濃度條件下的抑制效果更好.

　　圖 3

　　圖 3不同濃度的雙(3-氨基丙基)胺(a)、香蘭素(b)和BBF (c)對混合菌生物膜形成(24 h)的影響

　　香蘭素(4-羥基-3-甲氧苯甲醛)是一種小分子物質, 它可以作為信號分子抑制劑(Quorum sensing inhibitor, QSI)調控微生物聚集過程.香蘭素對混合菌生物膜形成的影響見圖 3b.當香蘭素濃度從0.1 mg·L-1增加到1 mg·L-1時, 生物膜抑制率維持在20%左右(p>0.05).當香蘭素的濃度增加到1~100 mg·L-1時, 生物膜的形成隨著香蘭素濃度的增加而逐步減少, 100 mg·L-1的香蘭素可以抑制37%混合菌生物膜的形成.當香蘭素的濃度繼續增加到200 mg·L-1時, 生物膜的形成量不再顯著性減少(p<0.05), 達到相對穩定的狀態.香蘭素作為一種QSI, 可以顯著抑制短鏈(C4-HSL和3-Oxo-C8-HSL)和長鏈AHL的活性, 從而阻礙細菌在基底表面的粘附及生物膜的形成(Ponnusamy et al., 2009).有研究報道, 香蘭素能夠顯著減少反滲透膜上生物膜的厚度、生物量和總蛋白量(Kappachery et al., 2010).也有研究表明, 香蘭素能夠減少活性污泥生物膜EPS中的多糖和蛋白, 但對eDNA不起作用(Si et al., 2017).本研究結果說明香蘭素可以顯著抑制混合菌生物膜的形成, 但其抑菌效果不如雙(3-氨基丙基)胺.

　　BBF作為一種溴代呋喃酮, 由于其結構和AHLs相似, 可以通過和AHLs競爭受體蛋白(LuxR家族蛋白)來干擾細菌的QS系統(Shetye et al., 2013).另外, 一些溴代呋喃酮還能夠通過干擾廣泛存在于革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌中的AI-2來抑制生物膜的形成(Jang et al., 2013).相關研究還發現, 溴化呋喃酮能夠抑制牙齦卟啉單胞菌生物膜的形成, 而且不會影響浮游細菌的生長(張利平等, 2011).因此, 選擇BBF來研究其對混合菌生物膜形成的抑制作用.由圖 3c可知, 當BBF的濃度在1~20 mg·L-1之間時, 其對混合菌生物膜形成的抑制率穩定在11%~18%, 且各處理間沒有顯著性差異(p>0.05).雖然與對照組相比, 1~20 mg·L-1的BBF能夠顯著抑制混合菌生物膜的形成(p<0.05), 但得到的抑制率相比于雙(3-氨基丙基)胺和香蘭素較低.因此, 需要進一步探討BBF在混合菌生物膜控制中的應用方式, 以提高其對混合菌生物膜的抑制效率.具體聯系污水寶或參見http://www.dongaorq.cn更多相關技術文檔。

　　3.3 銀和雙(3-氨基丙基)胺對微生物生長的影響

　　上述研究表明, 在傳統抗菌劑中, 銀對混合菌生物膜形成的抑制效果優于氯, 而在小分子中, 雙(3-氨基丙基)胺的抑制效果最好.因此, 本文研究了不同濃度的銀和雙(3-氨基丙基)胺對混合菌生長曲線的影響, 探討其抑制混合菌生物膜形成的可能機理.由圖 4可知, 銀和雙(3-氨基丙基)胺對混合菌生長曲線的影響與其濃度有關, 低濃度的銀(0.01 mg·L-1)可以促進混合菌的生長, 0.05 mg·L-1的Ag+對混合菌的生長沒有顯著影響, 高濃度的銀(0.1、1和10 mg·L-1)會顯著抑制混合菌的生長, 而且濃度越高, 抑制效果越顯著.1000 μmol·L-1以下的雙(3-氨基丙基)胺基本不會抑制懸浮狀態混合菌的生長, 所以其對混合菌生物膜的抑制是通過非殺菌機制來實現的.但高濃度(2000 μmol·L-1)的雙(3-氨基丙基)胺會顯著抑制混合菌的生長曲線, 表明高濃度的雙(3-氨基丙基)胺能夠殺滅微生物, 可以通過殺菌機制來抑制生物膜的形成.

　　圖 4

　　圖 4不同濃度的銀(a)和雙(3-氨基丙基)胺(b)對混合菌生長曲線的影響

　　4 結論(Conclusions)

　　1) 兩種傳統抗菌劑中, 銀對廢水處理系統混合菌形成生物膜的抑制效率要高于氯;高濃度的銀離子(>0.1 mg·L-1)通過殺菌機制抑制混合菌生物膜的形成, 可能會導致細菌產生耐藥性.

　　2)在3種小分子物質中, 雙(3-氨基丙基)胺對生物膜形成的抑制效果最好, 明顯優于香蘭素和(Z-)-4-溴-5-(溴乙烯)-2(5H)-呋喃酮(BBF).

　　3) 低濃度(<1000 μmol·L-1)的雙(3-氨基丙基)胺通過非殺菌機制抑制混合菌生物膜的形成, 可以避免傳統殺菌劑產生抗藥性的問題.如何將小分子物質和傳統抗菌劑有效耦合, 或者改變其作用方式, 進一步提高生物膜抑制率, 有待于進一步研究.(來源：環境科學學報 作者：武亞川)