環丙沙星(ciprofloxacin, CIP)作為第三代氟喹諾酮類抗生素, 因具有廣譜抗菌活性而得到廣泛應用, 這也導致越來越多的CIP進入環境之中.據報道, 近年來CIP在生活污水、制藥廢水、農業廢水和地表水中均被頻繁檢出.該物質化學性質穩定, 很難被微生物降解, 因此其抗菌生物活性在環境中殘留時間較長.有研究表明, CIP的大量使用甚至濫用致使致病菌長期處于亞抑菌濃度中, 致病菌很容易突變產生耐藥性.因此, 近年來CIP等新型污染物引起的微污染問題已引起了人們的廣泛關注.
CIP在環境中持續地遷移擴散, 當達到一定濃度后會對某些敏感微生物的生長產生抑制, 甚至直接殺死它們, 從而改變土著微生物區系和數量, 影響微生物群落結構分布.同時, 環境中殘留的CIP等氟喹諾酮類抗生素能促進抗性基因(antibiotic resistant genes, ARGs)的產生.目前, 在河流、湖泊、土壤、底泥等不同介質中就檢出了由于抗生素作用而產生的抗性基因和耐藥細菌.抗性基因的傳播和擴散可能會加快抗藥性菌群的大量繁殖, 且細菌抗藥性一旦生成就很難在短時間內消失， 對微生物群落結構形成了潛在的威脅.抗性基因作為一種新型污染物, 其危害比抗生素本身要大, 這給人類的身體健康和生態環境安全帶來了不可預測的風險.近年來, 圍繞著CIP對水或土壤中微生物群落的影響開展了較多的研究, 但大多集中于CIP痕量水平(ng ·L-1或μg ·L-1級別), 關于高濃度CIP(mg ·L-1水平)對活性污泥中微生物群落結構、功能微生物數量及抗性基因豐度的影響還少有報道.
Xie等針對某抗生素生產廢水開展研究, 發現廢水中CIP濃度很高, 達到5.06 mg ·L-1, 生化處理對CIP去除效果不佳, 處理出水中殘留濃度仍高達3.23 mg ·L-1; 且該系統對有機物和氨氮去除效果較差, 推測是廢水中的CIP對活性污泥中功能微生物造成了影響.此外, 本實驗室前期研究也發現CIP對膜生物反應器(membrane bioreactor, MBR)運行效能會產生負面影響.
本研究旨在通過MBR處理CIP模擬廢水實驗, 考察不同CIP投加濃度下MBR中微生物群落結構和功能微生物豐度的變化; 探討CIP-ARGs, 包括gyrA、gyrB、parC和parE在CIP選擇壓力下的變化情況, 以期為CIP生產廢水的無害化處理提供數據支撐.
1 材料與方法1.1 實驗用水
MBR進水中含有200 mg ·L-1葡萄糖、256.67 mg ·L-1無水乙酸鈉、94.17 mg ·L-1硫酸銨和17.50 mg ·L-1磷酸二氫鉀(C :N :P=100 :5 :1), 其COD、氨氮和磷濃度分別約為400、20和4 mg ·L-1.整個實驗分為4個工況, 共運行132 d, 運行工況1(1~33 d)、2(34~66 d)、3(67~99 d)、4(100~132 d)條件下分別向上述MBR進水中投加CIP濃度為0、5、10和15 mg ·L-1.所用CIP(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、葡萄糖、無水乙酸鈉、硫酸銨、磷酸二氫鉀等藥劑均為分析純.
1.2 實驗裝置與運行條件
MBR主要由有機玻璃容器(長方體結構, 有效體積為12 L)、膜組件(日本三菱麗陽株式會社的中空纖維膜, 膜平均孔徑為0.1 μm, 膜面積為0.09 m2)和曝氣裝置組成(圖 1).反應器中接種污泥取自某生活污水處理廠好氧膜池, 經稀釋水洗和稀釋后, 調整反應器中初始MLSS為6.2 g ·L-1.整個MBR裝置和進水桶采取遮光處理, 避免CIP發生光解.反應器連續進水, 流速為25 mL ·min-1; 間歇抽吸出水, 每連續出水5 min后停止出水1 min, 以減緩膜污染, 出水流速為30 mL ·min-1.整個實驗中, 反應器水力停留時間(HRT)為8 h, 溶解氧為2~4 mg ·L-1, pH為7~8, 水溫為25~30℃, COD容積負荷約1.2 kg ·(m3 ·d)-1, 除工況1視情況周期性排泥外其余3個工況幾乎沒有排泥(檢測時所取混合液體積與整個MBR體積相比, 影響甚微, 可忽略此污泥損耗).
圖 1
每個工況下周期性取樣分析常規水質指標和CIP的變化情況, 并取污泥樣品密封避光保存于-70℃超低溫冰箱內, 用于分析微生物群落及其抗性基因的變化.
1.3 分析項目與方法1.3.1 高通量測序
分別于第33 d(運行工況1末)、36 d和66 d(即工況2的第3 d和33 d)、69 d和99 d(即工況3的第3 d和33 d)、102 d和132 d(即工況4的第3 d和33 d)采取污泥樣品, 委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行高通量測序.
泥水混合物3 000 r ·min-1離心去上清液, 沉淀固體部分使用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒(OMEGA)進行DNA提取, 之后用Qubit®2.0熒光計(Invitrogen)檢測DNA濃度, 用瓊脂糖凝膠(美國UVP)檢測DNA完整性, 用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒(Life)對基因組DNA精確定量.PCR擴增采用融合了MiSeq測序平臺的V3-V4通用引物341F(CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG(barcode) CCTACGGGNGGCWGCAG)和805R(GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACT ACHVGGGTATCTCTA ATCC).
1.3.2 抗性基因檢測分析
采用PowerSoil® DNA Isolation Kit試劑盒(MO BIO)并結合液氮冷凍研磨法對樣品的基因組DNA進行提取.PCR的擴增引物如表 1所示.PCR反應體系:DNA模板1 μL, 2×Taq酶12.5 μL, 上下游引物(10 μmol ·L-1)各0.5 μL, 10.5 μL ddH2O, 反應體系總體積為25 μL.PCR反應程序:94℃預熱5 min, 30個循環:94℃變性30 s, 退火溫度(gyrA, gyrB:55℃; parC, parE:57℃; 16S rRNA:60℃)30 s, 72℃延伸30 s, 最后72℃停留7 min.再采用Universal DNA Purification Kit(TIANGEN)試劑盒對CIP-ARGs的PCR產物進行純化回收, 并委托中國科學院南京土壤研究所對純化的PCR產物進行定量分析.
表 1 引物信息 Table 1 Primer information
1.3.3 其它指標檢測
CIP濃度采用高效液相色譜儀HPLC(LC-2010A型, 日本島津)測定:色譜柱為ODS-2, 5 μm 4.6×250 mm(WondaCract, 日本島津); 檢測器為紫外可見吸收檢測器(UV-Vis), 波長為277 nm; 流動相為色譜純乙腈:水(含0.1%甲酸, 色譜純)=20 :80(體積比); 流速為0.7 mL ·min-1; 溫度為35℃; 進樣體積為10 μL.COD、氨氮和MLSS分別采用重鉻酸鉀法、納氏試劑分光光度法和重量法[30]測定; TOC采用TOC-VCSN總有機碳分析儀(日本島津)測定.
2 結果與討論2.1 不同CIP投加濃度下MBR中微生物群落解析2.1.1 活性污泥的微生物群落結構
不同CIP投加濃度下MBR污泥中微生物群落在門、綱、目、科、屬等分類水平上的平均種類分布如圖 2所示.門、綱、目、科、屬等5個分類水平微生物種類數分布大體上都隨著CIP投加濃度和運行時間的增加呈現減少的趨勢.
圖 2
在工況1下MBR運行穩定時, 微生物群落分析中共檢出了17個門、34個綱、60個目、104個科和232個屬.
當運行至工況2, MBR進水中CIP濃度為5 mg ·L-1時, 微生物體系突然受到CIP的脅迫, 敏感微生物活性受到抑制而死亡, 使得微生物群落的門、綱和目種類減少; 繼續運行至該階段末, MBR運行逐漸趨于穩定, 此時科和屬種類數相較于0 mg ·L-1(33 d)時分別下降了21%和25%.
繼續增加MBR進水中CIP濃度至10 mg ·L-1和15 mg ·L-1, 門和綱水平上微生物種類數基本趨于穩定; 但目、科、屬水平上微生物種類數卻有較大程度減少, 尤其是屬水平, 工況4末的屬水平種類數相較于工況1末下降了53%.結果顯示, CIP的加入對微生物群落的門和綱數量影響不大, 但對目、科、屬數量影響較大; 表明了微生物分類單位越小, CIP脅迫所引起的微生物種類變化越明顯.
為了深入探究不同CIP濃度對微生物群落結構的影響, 接下來分別從門、科、屬水平上進行群落結構分析.門水平上, MBR中微生物群落結構分布如圖 3所示.
圖 3
MBR在工況1中運行穩定時, 微生物群落共檢出17個門, 優勢菌群為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae), 其中變形菌門所占豐度比例最大, 為52%.工況2, MBR進水中開始投加5 mg ·L-1的CIP, 上述優勢菌群受到CIP的突然沖擊, 其相對豐度比例呈現出不同程度地降低; 厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、Candidatus Saccharibacteria和綠彎菌門(Chloroflexi)為該工況下新增的優勢菌群.
隨著運行時間的延長和CIP投加濃度的繼續增加, 上述優勢菌群的相對豐度比例呈現不同的變化趨勢:變形菌門和擬桿菌門的相對豐度比例呈先升高后降低再升高再降低的趨勢, 表明這兩種菌群對CIP濃度的增加比較敏感; 浮霉菌門、酸桿菌門和硝化螺旋菌門的相對豐度比例均呈先增后減的趨勢, 表明這3種菌群能適應一定濃度的CIP環境但在更高濃度的CIP環境中很難生存; 5 mg ·L-1(3 d)時新檢出的優勢菌群均不能適應CIP的長期脅迫而持續減少, 甚至消失.具體聯系污水寶或參見http://www.dongaorq.cn更多相關技術文檔。
在高濃度CIP的長期選擇性壓力下變形菌門和擬桿菌門成為MBR污泥中的主要菌群, 工況4末二者相對豐度比例分別為57.5%和12.7%, 表明MBR中大部分抗CIP的微生物是屬于這兩種優勢菌群, 這與前人的研究一致.
科水平上, MBR中微生物群落結構分布如圖 4所示(僅顯示整個運行過程中平均相對豐度比例≥2.5%的菌科).
圖 4
工況1條件下, MBR中檢出的優勢菌科有紅環菌科(Rhodocyclaceae)、Kofleriaceae、生絲微菌科(Hyphomicrobiaceae)、Chitinophagaceae和浮霉菌科(Planctomycetaceae), 所占比例分別為15.45%、5.80%、5.67%、16.10%和10.13%;前3者均屬于變形菌門, 后兩者分別隸屬于擬桿菌門和浮霉菌門.工況2, 當MBR進水中開始投加CIP時, 這些優勢菌科活性和生長受到CIP的抑制, 相對豐度比例均急劇降低; 而紅桿菌科(Rhodobacteraceae)、消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)和葉桿菌科(Phyllobacteriaceae)比例增大, 成為優勢菌科.
當MBR在5~15 mg ·L-1的CIP環境中運行期間, 微生物群落結構產生不同的變化.其中紅環菌科逐漸適應CIP環境, 相對豐度比例持續增加; Kofleriaceae、Chitinophagaceae和浮霉菌科的相對豐度比例呈現出先升高后降低再升高再降低的過程, 表現出波動狀態, 表明這3種菌科易受到CIP濃度增加的影響, 其中Chitinophagaceae的變化趨勢與擬桿菌門完全一致; 生絲微菌科、紅桿菌科、消化鏈球菌科和葉桿菌科相對豐度比例逐漸降低, 表明這4種菌科經不住CIP的長期脅迫.
面對高濃度CIP長時間的選擇性壓力, 在工況4末期選擇出來的優勢菌科為紅環菌科、Chitinophagaceae和叢毛單胞菌科(Comamonadaceae), 相對豐度比例分別為29.96%、5.44%和6.60%.
屬水平上, MBR中微生物群落結構分布如圖 5所示(僅顯示整個運行過程中平均相對豐度比例≥2.5%的菌屬).MBR進水中未投加CIP時, 污泥中的優勢菌屬為Azospira、Kofleria、Ferruginibacter、動膠菌屬(Zoogloea)和生絲微菌屬(Hyphomicrobium), 所占比例分別為13.07%、5.80%、10.41%、7.03%和4.48%.工況2, 當MBR進水中開始投加CIP時, 上述優勢菌屬相對豐度比例均急劇降低, 表明其活性和生長受到了CIP的抑制; 此時優勢菌屬為動膠菌屬(隸屬于紅環菌科)、Tissierella(隸屬于消化鏈球菌科)、Acetoanaerobium和Roseicitreum.
圖 5
由圖 5可知, 繼續延長CIP作用時間并增加CIP的投加濃度, 微生物群落結構分布產生顯著性差異.其中Azospira、Kofleria、Tissierella、生絲微菌屬、Acetoanaerobium和Roseicitreum在CIP長期脅迫下很難生存而失去優勢; 而Methyloversatilis、Ferruginibacter、動膠菌屬和叢毛單胞菌屬(Comamonas)在高濃度CIP的選擇性壓力下成為優勢菌屬, 工況4末各相對豐度比例分別為21.70%、7.56%、5.24%和4.15%.
門、科、屬水平上的微生物群落結構分析表明, 在高濃度CIP的長期脅迫和選擇性壓力下, 敏感性微生物活性受到抑制而難以生存; 而變形菌門中紅環菌科下的Methyloversatilis、Ferruginibacter和動膠菌屬及叢毛單胞菌科下的叢毛單胞菌屬最終成為了MBR中的優勢菌屬.
2.1.2 CIP投加濃度對MBR中微生物群落多樣性的影響
考察CIP投加濃度對MBR中微生物群落豐富度與多樣性的影響, 結果如表 2所示.Chao1和ACE指數用來估計微生物群落的豐富度, 而Simpson和Shannon指數代表群落多樣性.由表 2可知, 隨著MBR進水中CIP投加濃度的增加和反應時間的延長, Chao1指數呈下降趨勢, 從0 mg ·L-1(33 d)的1271.7降至15 mg ·L-1(33 d)的469.7, 下降率為63%;ACE指數在整個運行中比較波動, 但整體上呈下降趨勢; Simpson指數持續升高, 而Shannon指數持續降低.Chao1、ACE、Shannon指數的降低和Simpson指數的升高表明了MBR污泥中微生物群落受到了CIP的抑制導致部分微生物難以生存而死亡, 使得污泥中微生物群落豐富度和多樣性均呈下降趨勢, 這與圖 2顯示的結果一致.
表 2 CIP投加濃度對微生物群落Chao1、ACE、Simpson和Shannon指數的影響
2.1.3 CIP投加濃度對部分功能微生物群落的影響
考察CIP投加濃度對TOC、氨氮和CIP去除效果的影響(如圖 6), 淺析污染物去除率變化與微生物群落結構變化的關系.結合圖 5和圖 6可知, 隨著CIP投加濃度從0 mg ·L-1增加到15 mg ·L-1, TOC平均去除率從97.56%下降至90.84%, 表明CIP對有機物去除有所影響但影響程度不大.眾所周知, 菌膠團是活性污泥和生物膜的重要組成部分, 是有機物降解去除的主力軍; 動膠菌屬作為菌膠團的主要構成體, 在CIP長期脅迫下, 其相對豐度比例趨于穩定, 或許TOC去除效果較穩定就與之相關.
圖 6
圖 5顯示, 叢毛單胞菌屬也逐漸成為MBR中優勢菌屬之一, 有研究報道該菌屬能利用CIP作為碳源[32]; 但在整個運行期間CIP去除率較低, 除了5 mg ·L-1(3 d)時主要靠污泥吸附去除59.03%的CIP外, 其余時段平均去除率僅為7.24%~24.90%, 表明大部分優勢菌種雖可在CIP脅迫下生存和繁殖, 但對CIP利用率不高.
由圖 6和圖 7可知, 隨著CIP投加濃度的增加和運行時間的延長, 亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)和硝化螺旋菌屬(Nitrospira)相對豐度呈先降低后升高再降低的趨勢; 產堿菌屬(Alcaligenes)和硝化桿菌屬(Nitrobacter)持續減少, 最后消失.這4種菌屬的減少或消失對MBR中氨氮的去除造成了負面影響, 平均去除率由0 mg ·L-1(33 d)的96.67%降低至15 mg ·L-1(33 d)的66.52%.雖然硝化微生物對低濃度CIP(μg ·L-1)可能具有一定的抵抗性和適應性, 但在高濃度CIP環境中硝化微生物卻很難成為優勢菌群, 導致氨氮的去除效率降低.
圖 7
2.2 CIP對抗性基因(CIP-ARGs)的影響
由圖 3~5可知, 在CIP投加濃度為5 mg ·L-1的階段, MBR中微生物在門、科和屬水平上的優勢群落結構分布均存在顯著性差異.因此選取該階段為研究對象, 考察CIP-ARGs平均相對豐度隨時間的變化情況, 判斷ARGs水平是否也存在類似現象, 結果如表 3所示.本研究選取的抗性基因包括DNA促旋酶A亞單位(gyrA)與B亞單位(gyrB)和拓撲異構酶Ⅳ的C亞單位(parC)與E亞單位(parE).為了減少分析檢測過程中產生的誤差, 采用CIP-ARGs的相對豐度(目標基因拷貝數/ 16S rRNA拷貝數)進行分析.表 3顯示, CIP的加入對MBR微生物產生了較為顯著的影響, 其中內參基因16S rRNA的絕對豐度隨CIP暴露時間的增加總體上呈降低趨勢, 由3.45×107 copies ·g-1降至33 d的1.68×107 copies ·g-1; 4種CIP-ARGs在運行3 d時, 相對豐度均呈現不同程度的降低, 以gyrA基因降低幅度最大, 原因可能是攜帶這4種抗性基因的部分菌種對高濃度CIP敏感而被殺死.之后隨著運行時間的增加, 這4種CIP-ARGs的相對豐度呈波動狀態, 但相較于CIP投加初期均有所增加(parE基因除外), 原因可能在于細菌長期暴露在CIP環境中, 其DNA旋轉酶和拓撲異構酶Ⅳ基因的抗性決定區發生基因突變導致細菌對CIP出現抗性作用, 抗藥性細菌可能會逐漸被選擇成為優勢菌群, 這與微生物群落結構分布結果相一致.
表 3 CIP-ARGs在MBR運行中的波動變化(CIP=5 mg ·L-1)
3 結論
(1) 通過考察不同CIP投加濃度下MBR污泥中微生物群落結構變化發現, 隨著CIP投加濃度和運行時間的增加, 工況4末, 門水平上Proteobacteria和Bacteroidetes仍然為MBR中的優勢菌群, 科水平上Rhodocyclaceae、Chitinophagaceae和Comamonadaceae被選擇成為優勢菌科, 屬水平上Methyloversatilis、Ferruginibacter、Zoogloea和Comamonas被選擇成為優勢菌屬.Chao1、ACE、Shannon指數降低和Simpson指數升高表明MBR中微生物豐富度和多樣性均降低.高濃度CIP對硝化微生物Nitrosomonas、Nitrospira、Alcaligenes和Nitrobacter的活性具有抑制作用, 導致氨氮去除效果下降.
(2) CIP-ARGs分析表明高濃度CIP的長期脅迫使得MBR中的gyrA、gyrB和parC基因增加.
(3) 本研究僅為CIP對MBR中微生物群落結構特征和抗性基因的影響提供數據支撐, 由于實驗規模較小, 未對如何提高耐藥菌與抗性基因的削減效果進行探討, 今后有必要在這一方面, 優化工藝參數與運行條件, 開展放大規模的連續實驗, 從技術和經濟上進行綜合評估.(來源：科學學報 作者：戴琦)
