采礦廢水是由礦井排水、露天采場排水和廢石場雨排水構成的一種酸性廢水, 含有高濃度的硫酸鹽和重金屬等物質.人工濕地作為常見的廢水處理方法之一, 在采礦廢水的處理領域中已有一定的應用.濕地沉積物中氮含量與其遷移轉化過程對濕地系統的結構、功能和生產力有重要影響, 氮含量被視為濕地營養水平指示劑, 是天然或者人工濕地沉積物中的主要限制性養分.采礦廢水、酸性礦山排水、礦井排水等中缺乏氮磷等營養元素, 研究處理此類廢水濕地中氮循環過程具有重要的意義.
濕地生態系統的氮素輸入過程包括大氣氮沉降、生物固氮、人為氮和徑流氮輸入等途徑.對于流入濕地的無機氮, 首先將還原價態氨氮氧化成高價態氮, 例如氨氮被氧化成亞硝酸鹽或硝酸鹽, 再被還原成氮氣.常見的厭氧氨氧化(ANAMMOX)廣泛存在于河口、中國華南水稻土和天然淡水濕地等環境中.近年來, 厭氧氨氧化與鐵還原耦合作用(Feammox)過程得到了國內外研究者的廣泛關注, 研究對象包括美國新澤西州的河岸濕地、波多黎各的熱帶雨林土壤、中國稻田土壤和美國卡羅萊納州薩凡納河流流域等.然而, 目前對酸性礦山排水污染土壤及相關濕地中發生的Feammox過程尚缺乏公開報道.
凹山濕地處理的采礦廢水含高濃度的SO42-, 沉積物中含有較高濃度的離子交換態鐵, 以及濕地中有機質、總氮等營養物質流失較為嚴重。本實驗以人工濕地為研究對象, 采集沉積物, 通過添加氨氮和水鐵礦, 以及利用乙炔抑制劑的技術手段, 探究Feammox是否存在及其對氮轉化過程的影響, 同時分析了水鐵礦加入對濕地氨氮厭氧轉化過程的影響, 達到了減少濕地系統總氮流失的目的.
1 材料與方法1.1 沉積物取樣地點和預處理
考察用于處理采礦廢水的安徽省馬鞍山市凹山濕地, 并采集沉積物樣品.樣品迅速裝入冰盒保鮮箱, 保鮮箱中預存保濕劑和脫氧劑, 并在6 h內送到合肥工業大學.在厭氧手套箱中沉積物樣品經人工除雜后, 過220 mm篩子待用.將沉積物攪拌均勻后裝入血清瓶, 加入體積比為1:3的去離子水, 高純度氬氣(99.99%)鼓氣密封, 在黑暗32℃下預培養25 d, 以消耗本底氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽和氧氣.預處理完后取樣分析未發現氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽.
1.2 培養實驗
在厭氧手套箱中將預處理的沉積物泥漿除去上清液, 分別稱取10.0 g剩余泥漿(pH≈6.5)置于25個50.0 mL血清瓶中, 每瓶各加入30.0 mL營養液, 按照實驗分組相應加入NH4Cl溶液(1 719.49 mg·L-1)和水鐵礦, 添加氨氮反應瓶中初始氮含量為90.0 mg·kg-1.實驗加入的營養液組成為16.0 mg·L-1 KH2PO4; 300.0 mg·L-1 MgCl2·6H2O; 74.0 mg·L-1 KCl; 840.0 mg·L-1 NaHCO3; 200.0 mg·L-1 NaCl; 180.0 mg·L-1CaCl2·2H2O; 微量元素溶液1.0 mL·L-1.微量元素溶液組成為: 204.0 mg·L-1 ZnCl2; 240.0 mg·L-1 CoCl2·6H2O; 990.0 mg·L-1 MnCl2·4H2O; 149.0 mg·L-1 CuCl2·2H2O; 220.0 mg·L-1 Na2MoO4·2H2O; 190.0 mg·L-1 NiCl2·6H2O; 140.0 mg·L-1H3BO4·2H2O; 210.0 mg·L-1 NaSeO4·10H2O.
將25個血清瓶隨機分為5組, 第一組為空白對照組, 加入2.0 mL去離子水; 第二組加入2.0 mL NH4Cl溶液; 第三組加入2.0 mL NH4Cl溶液, 上層氣相含30.0%(~3 kPa)乙炔氣體; 第四組加入2.0 mL NH4Cl溶液和41.24 mg水鐵礦; 第五組加入2.0 mL NH4Cl溶液、41.24 mg水鐵礦, 上層氣相含30.0%(~3 kPa)乙炔氣體.添加上述NH4Cl溶液和水鐵礦后, 將所有血清瓶鼓氬氣15 min(DO<0.10 mg·L-1)脫氧之后密封, 其中第三和第五組抽取血清瓶上層氬氣6.0 mL, 添加等體積的高純度純乙炔(99.99%)氣體, 體積比為30.0%(~3 kPa).然后將所有血清瓶置于32℃培養箱避光下培養15 d, 反應瓶每1~2 d以100 r·min-1搖晃1.0 min.
1.3 測試方法
氮氣(N2)濃度采用魯南氣相色譜儀(SP 6890, 杭州瑞析科技有限公司)檢測; 一氧化二氮濃度(N2O)采用傅里葉變換紅外光譜儀(VERTEX 70, 德國)檢測; 硫化氫氣體(H2S)采用氣相分子吸收光譜儀(GMA33xx, 上海北裕分析儀器有限公司, 上海)檢測; pH值采用梅特勒-托利多Delt320型酸度計檢測.
2 mol·L-1KCl溶液提取泥漿中的NH4+、NO2-和NO3-, 提取2.0 h后, 稀釋5~10倍后采用氣相分子吸收光譜儀(GMA33xx, 上海北裕分析儀器有限公司, 上海)檢測; 0.5 mol·L-1HCl溶液提取泥漿中的Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ), 用菲啰嗪法測定溶液中的Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)濃度; 硫酸鹽(SO42-)采用1+1 HCl溶液煮沸提取, 用離子色譜儀(皖儀, S600)測定的硫酸鹽濃度; 硫化物濃度(S2-)采用氣相色譜法(AJ-2100氣相分子吸收光譜儀, 上海安杰環保科技有限公司)檢測; 單質硫(S)采用高效液相色譜儀(ULTIMATE 3000, USA)檢測[15]; 重金屬濃度采用火焰原子吸收法(WAYEE-WYS 2200)檢測; TOC濃度采用重鉻酸鉀氧化法檢測.
2 結果與討論2.1 不同體系的氮氣(N2)產生
五組反應體系氮氣生成及五組硫酸鹽還原過程結果如圖 1所示.在空白對照組中氮氣產生量為(0.80±0.05)mg·kg-1, 氮氣產生速率為(0.05±0.003) mg·(kg·d)-1, 與其他三組對比可以忽略. NH4+組體系中氮氣產生量為(63.17±5.34) mg·kg-1, 氮氣產生速率為(4.21±0.36) mg·(kg·d)-1, 沉積物氮損失達到了(70.15±1.25)%. NH4++C2H2組體系中氮氣產生量為(25.35±3.32) mg·kg-1, 氮氣產生速率為(1.69±0.221) mg·(kg·d)-1, 沉積物氮損失達到了(27.05±2.01)%. NH4++Fe(Ⅲ)組體系中氮氣產生量為(41.07±5.17) mg·kg-1, 氮氣產生速率為(2.74±0.35) mg·(kg·d)-1, 沉積物氮損失達到了(45.44±0.98)%. NH4++Fe(Ⅲ)+C2H2組體系中氮氣產生量為(38.18±1.23) mg·kg-1, 氮氣產生速率為(2.55±0.08) mg·(kg·d)-1, 沉積物氮損失達到了(42.29±2.11)%.
圖 1
孫志高等應用C2H2抑制原狀土柱培育法研究濕地土壤反硝化速率, 發現反硝化速率變化為0.301~1.595 mg·(kg·d)-1, 分析溫度因素因子與反硝化速率存在顯著相關, 采用孫等的線性回歸方程估算本實驗反硝化速率為1.561~1.786 mg·(kg·d)-1, 未加C2H2抑制劑反應器氮氣產生速率比此值高出53.42%~169.70%.據報道在沉積物、土壤、純培養中, C2H2分壓≥0.7 kPa時可完全抑制反硝化過程中N2O的還原， 而ANAMMOX群落對C2H2的抑制作用更加敏感, 乙炔≥70 Pa時即被抑制95%, Feammox菌群對C2H2的敏感性較低.如圖 1所示, NH4++Fe(Ⅲ)+C2H2組的氮氣產量低于NH4++Fe(Ⅲ)組(P<0.05), NH4++C2H2組的氮氣產量低于NH4+組(P < 0.01), 這主要是由于乙炔的加入對反硝化及ANAMMOX微生物群落具有抑制作用.因此, NH4++C2H2組和NH4++Fe(Ⅲ)+C2H2組體系產生的氮氣是由于其他微生物的作用, 可能的途徑是Fe(Ⅲ)參與的Feammox或SO42-參與的S-ANAMMOX.
本實驗各體系中硫酸鹽和硫化物初始含量差異不顯著, 分別是(307.59±65.21)mg·kg-1和(64.64±3.83) mg·kg-1.反應體系培養15 d后, 硫酸鹽含量為(284.11±25.48)~(295.1±38.73) mg·kg-1, 硫化物含量為(89.04±12.51)~(114.56±25.93) mg·kg-1, 單質硫在體系中并沒有被檢測到[圖 1(b)].富鐵沉積物中, Fe(Ⅲ)與SO42-同時作為電子受體具有競爭關系, Fe(Ⅲ)抑制了SO42-的還原[20].因此, 在凹山濕地沉積物中硫酸鹽的還原過程主要由硫酸鹽還原菌參與作用, 沒有發生S-ANAMMOX生物化學過程. NH4++C2H2組和NH4++Fe(Ⅲ)+C2H2組體系由于C2H2的抑制作用, N2主要為Feammox過程產生的, 如反應方程式(1)所示.此外, 本實驗中含C2H2實驗組中產氮氣速率減少了0.19 mg·(kg·d)-1, 同Ding等的報道數據接近. Yang等的研究發現在培養24 h熱帶森林土壤后Feammox產生氮氣速率大約為0.32 mg·(kg·d)-1, Li等的研究發現在培養24 h潮汐帶濕地沉積物中Feammox產生氮氣速率大約為0.24~0.36 mg·(kg·d)-1, 且潮汐對Feammox有著一定的影響, 大潮時期Feammox活性更強.
2.2 水鐵礦的影響
在NH4+組和NH4++C2H2組中, Fe(Ⅲ)還原速率提高, Fe(Ⅱ)生成量高于空白對照組(圖 2), 說明氨氮的加入能夠促進Fe(Ⅲ)還原.此外, 在NH4++Fe(Ⅲ)組和NH4++Fe(Ⅲ)+C2H2組體系中, Fe(Ⅱ)生成量分別為(3 394.10±286.34) mg·kg-1和(2 730.81±442.11) mg·kg-1, Fe(Ⅲ)還原速率顯著提高.在NH4+組和NH4++C2H2組體系中Fe(Ⅱ)生成量分別為(1 139.97±123.93) mg·kg-1和(1 043.50±54.69) mg·kg-1, 加入外源鐵體系的Fe(Ⅱ)生成量明顯高于其他沒有加入外源鐵體系組(圖 2). NH4++Fe(Ⅲ)組比NH4+組高出197.36%, NH4++Fe(Ⅲ)+C2H2組比NH4++C2H2組高出161.70%, 說明水鐵礦能夠被微生物利用進而促進了Feammox生物化學過程.本實驗中NH4++C2H2組和NH4++Fe(Ⅲ)+C2H2組體系中Feammox產生氮氣量為(25.35±3.32) mg·kg-1和(38.18±1.23) mg·kg-1, 說明鐵氧化物的生物可利用性和還原速率能夠對Feammox起到明顯的調控作用, 氨氮氧化速率從1.69 mg·(kg·d)-1增強到2.72 mg·(kg·d)-1.文獻報道Feammox種群對土壤中生物可利用鐵氧化物含量有很大的依賴性. Fe(Ⅲ)還原程度和速率與比表面積有著顯著的關系. Fe(Ⅲ)可利用性很高, 能夠促進Feammox生化過程同時還原生成Fe(Ⅱ).
圖 2
如圖 1所示, NH4+組體系的N2量明顯高于NH4++Fe(Ⅲ)組的反應體系(P < 0.01), 表明水鐵礦的加入影響沉積物生物化學過程, 進而顯著降低系統的氨氮流失量.以Fe(Ⅲ)為電子受體的厭氧自養型微生物群落與以NO2-為電子受體的ANAMMOX菌群在電子傳遞上存在競爭關系.Fe(Ⅱ)與反硝化產生的NO2-通過表面催化作用將Fe(Ⅱ)氧化成Fe(Ⅲ), 礦化成針鐵礦, 使其附著在細菌表面, 阻止了基質NO2-和NO3-進入細胞內, 即形成鈍化, 進而抑制了ANAMMOX和反硝化過程.由于實驗中NH4++Fe(Ⅲ)組和NH4++Fe(Ⅲ)+C2H2組中以NO2-為電子受體的ANAMMOX過程可能受到鐵還原過程抑制. NH4++Fe(Ⅲ)組的氮氣主要產生于反硝化和Feammox過程, 其中反硝化速率較低, 約為0.19 μg·(kg·d)-1, 這主要是由于水鐵礦的加入抑制了反硝化微生物與繁殖.
2.3 一氧化二氮氣(N2O)和硝酸鹽的產生
土壤生態系統中NO2-和NO3-的主要產生途徑是有機質礦化作用和硝化作用, 消耗途徑是反硝化過程及厭氧氨氧化過程.研究發現厭氧環境下有機大分子礦化作用產生硝酸鹽的效率遠低于好氧環境, 通常小于1 μmol·L-1.本實驗條件為厭氧環境, 有機質礦化過程效率較低, 產生的硝酸鹽含量可以忽略不計.因此, 沉積物中NO3-的含量改變主要受到反硝化過程的影響.具體聯系污水寶或參見http://www.dongaorq.cn更多相關技術文檔。
在空白組和其他實驗組, 在任何時間段都沒有檢測到NO2-.加入NH4Cl溶液的4組體系在培養15 d后, 均檢測到了NO3-的產出, 含量約為4.43 mg·kg-1, 平均產生速率約為0.288 μg·(kg·d)-1, 而空白對照組沒有檢測到. Yang等的研究發現在熱帶森林土壤中Feammox現象, 并且可以產生N2、NO2-或者NO3-[方程式(1)~(3)].本實驗可以發生Feammox生物代謝過程, 以及檢測到了NO3-的產出, 說明NH4Cl溶液的加入影響了NO3-的產出, 反應體系中的NO3-主要來源于Feammox過程, 即反應方程式(3).
如圖 3所示, NH4+、NH4++C2H2、NH4++Fe(Ⅲ)和NH4++Fe(Ⅲ)+C2H2組體系中均產生了N2O, 其產量從(16.22±1.07)~(31.46±1.67) mg·kg-1, 空白對照組沒有檢測到N2O的產生.氨氮的加入提高了微生物群落活性, 進而促進了N2O的產出.如前所述, C2H2的加入抑制反硝化過程, 從而導致N2O的累積.另外, NH4++Fe(Ⅲ)+C2H2組體系中N2O產量顯著高于NH4++C2H2組體系(P < 0.01), 這表明水鐵礦的加入顯著促進了N2O的產生.王慶等的研究發現, 水稻土在添加外源鐵對N2O的產生和排放產生了顯著的影響, 高添加量水鐵礦處理導致硝態氮含量明顯高于對照和N2O排放速率先低后高于對照, 外源鐵抑制了反硝化功能微生物種群數量. Feammox生物代謝過程可能產生N2O, 此外在實驗中也發現了向土壤添加水鐵礦能夠促進N2O的產生.盧燕宇等經過多年建立農田N2O年度排放數據庫, 分析發現N2O排放與溫度及降水呈現顯著相關性, 與土壤pH值、有機碳及氮含量無顯著相關性.因此, 將盧燕宇等利用統計學和經溫度因子修正后的N2O排放估算方法運用到本實驗數據中, 本實驗條件下得到N2O的理論排放量為5.74 mg·kg-1, 而本實驗N2O的實際排放量遠高于此數值.另外, 本實驗反硝化產氮氣速率約為0.19 μg·(kg·d)-1, 說明了N2O的產生可能存在新途徑, 來自Feammox過程[反應方程式(4)].
圖 3
2.4 沉積物中Fe參與的氮循環途徑分析
在好氧環境中, 硝化過程主導氮的轉化, 先將氨氮氧化成NO2-再氧化成NO3-.在厭氧環境下, NH4+的濃度是隨著有機氮礦化程度增加而得到積累以及NOx-被ANAMMOX和反硝化還原。但是, 本實驗中NH4+的濃度在4個厭氧體系中均逐漸減少, 而NOx-存在積累現象. 4組體系中均發生了Fe(Ⅲ)的還原, Fe(Ⅱ)隨著水鐵礦的加入而顯著升高(圖 2).同時, ANAMMOX及反硝化過程受水鐵礦抑制作用, 氨氮的轉化率僅僅降低了20%.這表明Fe(Ⅲ)在處理采礦廢水濕地沉積物中作為電子受體, 改變了氨氮轉化途徑, 發生了氮循環新途徑——Feammox過程.
培養15 d后NH4+和NH4++Fe(Ⅲ)組體系中氨氮剩余量從20%增加到40%, 其他途徑也有所改變(圖 4).其中, ANAMMOX和反硝化過程在NH4+組體系中消耗氨氮24.99 mg·kg-1和12.83 mg·kg-1, 占比28%和14%, 而在NH4++Fe(Ⅲ)組體系中ANAMMOX過程完全消失, 反硝化過程也降低到了2.88 mg·kg-1, 占比3%.同時, NH4+組和NH4++Fe(Ⅲ)組體系沉積物氮損失分別達到了76%和51%, 說明水鐵礦的加入在一定程度上減少了處理采礦廢水濕地沉積物氮損失, 這與水鐵礦二次成礦抑制了ANAMMOX和反硝化過程有著顯著的關系. Feammox過程在NH4+組體系中消耗氨氮25.35 mg·kg-1, 占比28%, 而在NH4++Fe(Ⅲ)組體系中Feammox過程增加到了38.18 mg·kg-1, 占比42%, 說明水鐵礦促進了Feammox過程, 其中氧化氨氮速率從1.68 mg·(kg·d)-1增強到2.72 mg·(kg·d)-1, 對氮損失貢獻率從40%增加到了82%.因此, 在凹山濕地沉積物氨氮的厭氧氧化過程中, NH4+被轉化成N2、N2O或者NO3-進一步進行脫氮, 而水鐵礦的加入改變了氨氮的轉化途徑和減少了氮損失, 這也為貧瘠濕地的水生生物和植物保留氮源提供一定的參考價值.
圖 4
本實驗證明氮氣直接產生于Feammox過程, 乙炔抑制劑的添加直接將其與通過反硝化和ANAMMOX產生的氮氣所區分.一些證據說明Feammox可能直接產生NO3-及N2O.但是, Feammox直接產生NO3-和N2O的速率需要進一步研究, 這可能對全球變暖氣體的產生途徑有所影響.濕地中氨氮的轉化是以Feammox產生氮氣為主要過程, 而不是將還原價態氨氮氧化成高價態的亞硝酸鹽或硝酸鹽, 再被還原成氮氣.因此, Feammox過程對氮損失有著不可忽視的重要性, 在特定環境中比反硝化和ANAMMOX的影響更為顯著.比如, 富鐵水稻土過量施肥可能會影響濕地植物和水稻的生長[8].
3 結論
(1) 培養期間發現了Feammox過程直接產生了氮氣, 以及可能直接產生NO3-及N2O.
(2) 乙炔抑制劑很大程度上使ANAMMOX過程得到抑制, 而對Feammox過程沒有顯著影響, 兩個過程產氮量區分效果明顯, ANAMMOX產生氮氣量為24.99 mg·kg-1, Feammox產生氮氣量為25.35 mg·kg-1, 為接下來通過乙炔抑制劑技術研究Feammox過程提供較為可靠的依據.
(3) 水鐵礦通過二次成礦抑制了ANAMMOX和反硝化過程, 以及通過促進Feammox過程氧化氨氮速率而改變了氨氮的轉化途徑和減少了氮損失.但是, 水鐵礦在一定程度上抑制了人工濕地去除硫酸鹽效率.因此在后續研究中為提高人工濕地去除硫酸鹽效率, 需更深一步探討水鐵礦的添加量.(來源：環境科學學報 作者：汪海波)
