1 引言(Introduction)

　　長期以來, 好氧生物處理工藝始終存在高耗能的弊端.一方面, 污水處理廠60%的能耗來自于鼓風機消耗, 目前我國污水處理廠的平均電耗為0.292 kW·h·m-3, 13%以上的污水廠電耗超過0.48 kW·h·m-3, 即使在美國, 其城市污水處理的電耗也要占總電耗的3%以上(曲久輝, 2014).另一方面, 城市污水作為資源循環利用的重要載體, 潛在能量巨大, 有待開發.然而, 目前我國城市污水的循環利用僅限于水資源的循環利用, 忽視了污水處理過程中有機質的循環利用.厭氧處理作為一種低成本的廢水處理技術, 不僅可以進行污水處理, 而且可以實現能源回收, 近年來得到國內外學者的密切關注.

　　厭氧生物處理技術一般應用于處理高濃度有機廢水, 而有關其用于處理低濃度生活污水的研究相對較少(McCarty, 1981).早在1989年, Sanz等就將厭氧流化床反應器(AFBR)應用于生活污水處理, 發現即使在低于10 ℃的低溫環境下, COD去除率也能達到70%以上(Sanz et al., 1989; 1990), 但其COD與SS仍不能滿足嚴格的污水處理排放標準.隨著膜技術的發展, Fang等將膜技術與厭氧生物處理相結合, 開發了厭氧膜生物反應器(AMBR), 膜組件的加入有效地截留了固體懸浮物且避免了活性污泥的流失, 極大地提高了出水水質(Fang et al., 2006;Bérubé et al., 2006), 然而膜污染問題接踵而至.Kim等(2011)針對此問題, 加入顆�；钚蕴�, 利用顆�；钚蕴孔鳛樯�物載體, 并將其充分流化使其對膜組件進行沖刷, 開發了厭氧流化床膜生物反應器(AFMBR), 實驗證明, 膜污染得到了一定程度的控制且出水狀況良好.

　　然而, 這些厭氧膜生物反應器配水使用的有機物是醋酸鹽或丙酸鹽, 相對于生活污水中復雜的有機污染物來說更容易被降解利用.為此, 本研究以蔗糖、蛋白胨為碳源對AFMBR的運行進行探究.張博康等(2018)對AFMBR的能耗及產能進行了實驗分析, 結果表明, 若只考慮氣態甲烷產能, 當HRT降至10 h時, 該系統產能已是能耗需求的2倍, 因此, AFMBR作為一種低耗高效的廢水處理系統, 具有良好的發展潛力.

　　厭氧微生物是污水厭氧消化的主體.在厭氧消化反應器中, 底物的差異對污泥中微生物群落結構的形成及代謝過程有重要影響(Fernandez et al., 2008).即使在處理相同底物的不同厭氧消化反應器中, 微生物群落仍呈現不同結構(劉君寒等, 2011).本實驗系統采用的碳源為蔗糖、蛋白胨, 相對于醋酸鹽和丙酸鹽這類碳源更復雜、更難降解與利用, 且目前有關AFMBR系統微生物的研究較少.因此, 本研究利用宏基因組測序及高通量技術, 從微生物菌群、功能基因、代謝途徑等不同角度對AFMBR系統進行分析, 探尋微生物群落結構變化規律與厭氧消化的內在關系, 以期為AFMBR高效穩定的運行提供科學依據, 同時推動厭氧污水處理技術的進步與發展.

　　2 材料與方法(Materials and method)

2.1 反應器的構造及運行條件

　　厭氧流化床膜生物反應器(AFMBR)如圖 1所示(張博康等, 2018).AFMBR由一個主反應柱和兩個沉淀室組成, 其有效容積為30 L.在主反應柱內部設置有60根1 m長的聚偏氟乙烯(PVDF)中空纖維膜(公稱孔徑為0.4 μm), 總有效面積為0.2475 m2.

　　圖 1

　　圖 1 AFMBR系統示意圖(1.進水蠕動泵, 2.反應柱, 3.沉淀室, 4.循環磁力泵, 5.轉子流量計, 6.壓力傳感器, 7.出水蠕動泵, 8.顆�；钚蕴�, 9.中空纖維膜, 10.pH電極, 11.ORP電極, 12.DO電極, 13.液位控制器, 14.集氣) 

　　AFMBR的實驗用水為模擬生活污水, 其水質組成參照馮華軍等(2011)對浙江省典型地區生活污水水質檢測數據, 進行人工模擬配水, 其配水水質如表 1所示, 其中, 有機碳源組分主要為蔗糖和蛋白胨, 此外, 還包含有NH4HCO3、尿素、K2HPO4、KH2PO4、NaHCO3.

　　表 1 本次研究中試驗廢水水質

 　　AFMBR系統連續運行218 d, 整個過程分為4個階段.系統內的pH維持中性, 溫度為20~38 ℃, ORP在-506 mV左右, 均滿足厭氧微生物的需要, 不需人為調整.

　　2.2 樣品采集

　　AFMBR的接種污泥取自北京市某污水廠的污泥濃縮池, 污泥濃度(MLVSS)為80.35 g·L-1.AFMBR運行前, 取種泥經離心后放入超低溫冰箱中(-76 ℃)以備高通量測序.AFMBR運行結束時, 自取樣口2、3、4(圖 1)取泥樣.從取樣口2、3、4采集顆�；钚蕴�, 經液氮冷凍、研磨后放入超低溫冰箱中以備宏基因組測序.

　　2.3 高通量測序

　　接種污泥委托上海生工公司進行高通量測序, 具體步驟參照譚瀟等(2017)的研究.首先提取DNA, 對種泥細菌16S rDNA基因的V3區進行PCR兩輪擴增, 引物如表 2所示.對種泥古菌16S rDNA基因的V3~V4區進行3輪擴增, 引物如表 3所示.細菌和古菌擴增的PCR產物和正常擴增片段在400 bp以上的PCR產物, 選用0.6倍的磁珠(Agencourt AMPure XP)進行處理.繼而利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量, 按照1:1等量混合后測序.等量混合時, 每個樣品DNA量取10 ng, 最終上機測序濃度為20 pmol.

　　表 2 AFMBR系統接種菌群細菌所用引物

 　　表 3 AFMBR系統接種菌群古菌所用引物

　　2.4 宏基因組測序

　　AFMBR系統連續運行結束后的泥樣委托上海生工公司進行宏基因組測序.宏基因組測序是對系統內的功能基因進行進一步的分析, 從基因角度分析系統的代謝過程, 同時也對系統內微生物組分進行分析.宏基因組測序的DNA提取方法與高通量測序方法相同, DNA在瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 使用Covaris儀器通過超聲波將DNA片段化, 選擇合適的打斷參數條件使打斷的DNA片段大小集中在300~500 bp范圍內.樣品片段化結束后, 對其進行末端修復并再次進行片段化.連接接頭后, 采用NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix擴增PCR.PCR結束后, 利用0.6倍的Agencourt AMPure XP-核酸純化磁珠對PCR反應產物進行純化, 并通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測構建完整的文庫PCR純化產物.使用DIAMOND將基因集蛋白序列與Nr (NCBI non-redundant protein sequences)數據庫進行blastp同源性比對, 得到功能注釋和同源物種信息, 篩選條件：E-value < 1×10-5, Score>60.同時根據NCBI的微生物分類學信息數據庫, 獲得基因的物種分類注釋信息, 并在Kingdom (界)、Phylum (門)、Class (綱)、Order (目)、Family (科)、Genus (屬)、Species(種)各個分類學水平上統計物種的相對豐度.使用GhostKOALA將基因集蛋白序列與KEGG數據庫進行比對, 得到序列對應的KO號, 根據KO與Pathway和Module的聯系得到序列的Pathway、Module注釋信息, 并統計KEGG各功能層級在各個樣本中的豐度.

　　3 結果與討論(Results and discussion)

3.1 AFMBR系統運行特性

　　AFMBR反應器的運行工況及條件如表 4所示(張博康等, 2018).AFMBR系統連續運行結束時的數據表明, 經過馴化富集后系統的出水COD能穩定維持在30 mg·L-1以下, COD滿足一級A出水標準(GB18918—2002);其中, 進水COD約有50%轉化為甲烷;污泥產量為0.076 g·g-1 (以每克COD中的VSS計), 遠低于典型的好氧系統的污泥產量;如若只考慮氣態甲烷產能, HRT為10 h時產能已是能耗需求的2倍(張博康等, 2018).

　　表 4 AFMBR系統的運行特性

 　　3.2 AFMBR系統運行前后菌群在屬水平的變化

　　AFMBR接種污泥的微生物菌群在屬水平上的相對豐度(>1%)如表 5所示.從表 5中可以看出, 接種菌群中細菌在屬水平的相對豐度以Petrimonas、Syntrophomonas、Alkaliphilus占比較高, 分別為7.71%、5.78%、5.42%;此外, 還有Tissierella、Nitrobacter等許多其它菌屬.接種菌群中古菌在屬水平的相對豐度以Methanoculleus菌屬占比較高, 占所有古菌的76.49%.Methanobacterium、Methanobrevibacter、Thermogymnomonas等菌屬占比較小.

　　表 5 AFMBR系統接種菌群屬水平的相對豐度

　　AFMBR系統運行結束時菌群在屬水平的平均相對豐度(>1%)如表 6所示.從表 6中可以看出, 與種泥相比, 運行結束時細菌與古菌的優勢菌屬變化均較大.細菌菌屬除去未命名的菌屬, 占比較高的Synergistes、Dehalobacter、Treponema分別占3.95%、3.64%、3.54%.古菌菌屬主要為Methanosarcina(甲烷八疊球菌屬)和Methanobacterium(甲烷桿菌屬), 分別占62.95%、28.01%.AFMBR系統接種細菌菌屬中的Petrimonas必須以單質硫和硝酸鹽為電子受體(Grabowski et al., 2015);Syntrophomonas以質子為電子受體, H2作為電子吸收產物, 且在有H2存在的環境中會受到明顯抑制(Mcinerney et al., 1981);Alkaliphilus是一種極度嗜堿微生物(Takai, 2001);Nitrobacter為硝化菌, 需在好氧條件下生存.Petrimonas、Syntrophomonas、Alkaliphilus與Nitrobacter皆因AFMBR系統無法提供相應的生存條件而被篩選淘汰.AFMBR系統運行結束時細菌菌屬中的Synergistes、Dehalobacter皆為專性厭氧細菌, Dehalobacter可利用乳酸產氫產乙酸, 且可通過產生的氫氣脫氯(Yoshida et al., 2009;Kato et al., 2010;Li et al., 2015), Synergistes也恰好須與耗氫微生物互養.系統的嚴格厭氧條件更有利于這些菌屬生長, 其代謝途徑也與厭氧微生物的碳代謝過程相吻合, 因此, 屬水平上的種群變化是該反應器高效能的直接體現.

　　表 6 AFMBR系統運行結束時菌群屬水平的平均相對豐度

 　　從古菌菌屬來看, 系統運行前后的產甲烷菌屬占比分別為90.94%與91.01%, 但優勢菌屬由接種時的Methanoculleus(76.49%)轉變為Methanosarcina(62.95%)與Methanobacterium(28.01%).基于代謝基質差異分類, Methanoculleus、Methanosarcina與Methanobacterium分別屬于氫營養型產甲烷菌群、乙酸營養型產甲烷菌群與多營養型產甲烷菌群.由此可得出AFMBR系統產甲烷基質由最初的主要以氫氣提供為主轉變為以乙酸為主.具體聯系污水寶或參見http://www.dongaorq.cn更多相關技術文檔。

　　3.3 AFMBR系統運行結束時菌群在種水平的特性

　　依據宏基因組分析, AFMBR系統運行結束時菌群在種水平的相對豐度如表 7所示.從表 7中可以看出, 各菌種所占的比例相差不大, Bacteroidales_bacterium_CF、Synergistaceae_noname、Dehalobacter_sp._FTH1、Methanosarcina_barkeri等菌種的占比略高于其他菌種.

　　表 7 AFMBR系統運行后菌群在種水平的相對豐度

　　對表 7中的微生物菌種進行分析, 依據厭氧消化三階段理論進行分類, 具體如表 8所示.水解發酵菌群中Cloacibacillus_evryensis、Synergistes_jonesi能夠發酵氨基酸, 不能在糖類、有機酸/醇內生長(Ganesan et al., 2008).而Treponema_caldarium、Endomicrobium_proavitum、Lentimicrobium_saccharophilum則能夠發酵碳水化合物, 不同底物的發酵產物也不盡相同(Bravo et al., 2013;Sun et al., 2016;Zheng et al., 2016).Synergistes_sp._3_1_syn1能夠產生天冬氨酸蛋白酶分解蛋白質(Kumar et al., 2010;Walsh et al., 2015).Syntrophorhabdus_aromaticivorans在與氫營養型產甲烷菌共培養時能夠降解苯酚, 代謝產物為乙酸和甲烷(Qiu et al., 2008).Melioribacter_roseu是兼性厭氧菌, 可以通過好氧呼吸在單糖、二糖及多糖中生長, 也可以通過還原不同的電子受體(亞硝酸鹽、Fe(Ⅲ)、As(Ⅴ))進行發酵(Kadnikov et al., 2013;Tsapekos et al., 2017).

　　表 8 AFMBR系統內厭氧菌群分類

 　　產氫產乙酸菌群中Bacteroidales_bacterium_CF可以發酵乳酸和乙醇(Tang et al., 2013).Dehalobacter_sp._FTH1是厭氧脫鹵桿菌的一種, 可以利用乳酸產氫產乙酸, 并且可以通過產生的氫氣脫氯(Yoshida et al., 2009;Kato et al., 2010;Li et al., 2015).Pelotomaculum_thermopropionicum是一種厭氧生物降解系統中典型的互養菌, 能夠促進中間產物的轉化, 且能夠將發酵細菌產生的VFA和乙醇轉化為乙酸鹽、氫氣和二氧化碳(Kato et al., 2010;Leng et al., 2017).

　　產甲烷菌群中, Methanosarcina_barkeri、巴氏甲烷八疊球菌屬可以利用甲醇、醋酸、甲胺及不同形式的氫和二氧化碳, 雖然其生長緩慢, 但能適應環境中各種可用的能源, M. barkeri可以在低pH的生態系統存活, 并且能夠有效地中和酸性環境, 相對于其他的產甲烷菌抗沖擊性更強(Rocheleau, 1999;Lin et al., 2017);Methanobacterium_formicicum是甲酸甲烷桿菌, 利用分子態氮為氮源進行生長, 細菌產生甲烷的速率與氮氣濃度有關, 在沒有氮氣或其他氮源的情況下, 細菌完全停止生長(Schauer et al., 1980;Magingo et al., 1991).

　　通過對AFMBR運行后的菌群進行分析可以看出, 在AFMBR運行一段時間后, 各菌種之間相互影響, 不存在較明顯的優勢菌種, 各菌種的占比相差不大.空間上從下至上分別取樣品2、3、4, 從相對豐度比例>1%的菌種來看, 樣品2、3、4中屬于水解發酵菌群的相對豐度分別為11.75%、12.05%、11.57%, 屬于產氫產乙酸菌群的相對豐度分別為10.81%、11.64%、10.20%, 屬于產甲烷菌群的相對豐度分別為9.05%、7.26%、10.55%.從中可以看出, 水解發酵菌群相對較多, 其次是產氫產乙酸菌群, 產甲烷菌群相對最少, 但它們之間差距較小.造成這種趨勢的原因與厭氧消化過程密切相關, 水解發酵菌群為產氫產乙酸菌群提供反應底物, 產氫產乙酸菌群為產甲烷菌群提供反應底物.因此, 在一個穩定的系統內, 各類菌群的相對數量不會相差過大, 這也是該系統為何能達到90%以上COD去除率的原因之一.

　　樣品2、3、4在species水平上的多樣本比較Venn圖如圖 2所示.從圖 2中可以看出, 樣本2、3、4共有菌種8061種, 占據絕大多數, 表明各樣本間的菌種沒有太大差別, 系統內的菌群分布比較均勻, 幾乎不存在空間差異.這與AFMBR系統采用水流循環的形式, 使顆�；钚蕴砍浞至骰�, 加大了水與微生物之間的傳質有關, 從而促進了反應器的高效運行.

　　圖 2

　　圖 2樣品2、3、4在species水平上的多樣本比較Venn圖 

　　3.4 基因的KEGG功能注釋

　　KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是有關生物系統較完善的數據庫, 整合了基因組、化學物質和系統功能信息.其中, KEGG GENES搜集了所有已知的完整的基因組的基因蛋白序列, 包含每個基因的最低限度信息.KEGG Pathway存儲了各種生物學通路信息, 包括代謝通路、合成通路、膜轉運、信號傳遞、細胞周期及疾病相關通路等.樣品2、3、4的KEGG Pathway基因豐度統計如表 9所示.Pathway Level1的Metabolism中, 基因豐度最高的是Overview, 其次依次分別為Carbohydrate metabolism、Amino acid metabolism和Energy metabolism.其中, Carbohydrate metabolism為碳水化合物代謝, 樣品2、3、4的相對豐度分別為5.62%、5.74%、5.47%;Amino acid metabolism為氨基酸代謝, 樣品2、3、4的相對豐度分別為5.62%、5.64%、5.48%.這與本次實驗用水水質有關, 實驗廢水中的有機物分別為蔗糖和蛋白胨, 因此, 針對這兩部分的功能基因數目較多, 較為活躍.關于Energy metabolism, 樣品2、3、4的相對豐度分別為4.90%、4.72%、4.78%, 其中大部分功能基因與厭氧消化菌群中產甲烷菌的產甲烷過程有關, 這使得反應器有較高的甲烷產率及COD去除率.

　　表 9 KEGG Pathway Metabolism基因豐度統計

 　　樣品2、3、4的Pathway Level 3分類統計柱狀圖如圖 3所示.從圖 3中可以看出, ko01230、ko01200的基因豐度明顯高于其他類別, 其中, ko01230(Biosynthesis of amino acids)為氨基酸的生物合成, 樣品2、3、4的相對豐度分別為3.78%、3.71%、3.67%;ko01200(Carbon metabolism)為碳代謝, 樣品2、3、4的相對豐度分別為3.72%、3.64%、3.63%.ko01230、ko01200均屬于Pathway Level2中的Overview.此外, 圖 3中ko00680(Methane metabolism)為甲烷代謝, 樣品2、3、4的相對豐度分別為1.72%、1.54%、1.73%.

　　圖 3

　　圖 3樣品2、3、4的Pathway Level3分類統計柱狀圖 

　　甲烷代謝過程中的產甲烷途徑有4種, 分別是二氧化碳轉化為甲烷、甲醇轉化為甲烷、乙酸轉化為甲烷及甲胺/二甲胺/三甲胺轉化為甲烷.樣品中各產甲烷途徑的基因相對豐度如表 10所示.從表 10中可以看出, 二氧化碳轉化為甲烷、乙酸轉化為甲烷的基因豐度相對較高, 是系統產甲烷的主要途徑;其次, 甲醇轉化為甲烷、甲胺/二甲胺/三甲胺轉化為甲烷的基因豐度也占有較大比例, 也是系統產甲烷過程的重要組分.

　　表 10 樣品中各產甲烷途徑的基因相對豐度

 　　4 結論(Conclusions)

　　1) 與接種菌群相比, AFMBR運行一段時間后微生物的優勢菌屬發生了較大的變化.其中, 細菌優勢菌屬由接種時的Petrimonas轉變為Bacteria_noname(未命名的細菌菌屬), 古菌菌屬由接種時的甲烷囊菌屬轉變為甲烷八疊球菌屬和甲烷桿菌屬, 可以推測產甲烷基質由最初的氫氣為主轉變為乙酸為主.

　　2) AFMBR運行一段時間后, 從相對豐度≥1%的菌種來看, 其中, 水解發酵菌群的相對豐度最高, 其次為產氫產乙酸菌群, 產甲烷菌群相對最少, 但各菌群之間相對豐度的差距較小.

　　3) AFMBR運行一段時間后, 系統內的菌群分布比較均勻, 空間上不存在明顯的菌群結構差異.這與AFMBR系統采用水流循環的形式, 使顆�；钚蕴砍浞至骰�, 加大了水與微生物之間的傳質有關.

　　4) AFMBR系統內與代謝通路相關的碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝基因豐度較高.二氧化碳轉化為甲烷、乙酸轉化為甲烷是系統產甲烷的主要途徑.此外, 甲醇轉化為甲烷、甲胺/二甲胺/三甲胺轉化為甲烷也是系統產甲烷過程的重要組分.(來源：環境科學學報 作者：陳昌明)