厭氧鐵氨氧化（Feammox）是一種在稻田、湖泊、濕地、海洋沉積物等自然生態系統中新發現的鐵和氮地球化學循環中的一個途徑，在厭氧環境下，以Fe（Ⅲ）為電子受體實現氨氮的氧化，產物可以是N2、NO2-、NO3-。因此，鐵氨氧化有望成為一種新型的厭氧氨氧化污水處理技術。根據理論反應式，Feammox實現氨氮氧化時鐵的消耗量較大，但反應器內存在的Fe（Ⅱ）/Fe（Ⅲ）循環可以使得Fe（Ⅲ）投加量僅為理論值的5.8%。Li等認為鐵氨氧化可以耦合硝酸鹽依賴型亞鐵氧化（NDFO），更有利于實現總氮的去除。Le等認為較高的有機物濃度會抑制鐵氨氧化，而在低碳氮比情況下則可以實現氨氮和COD的同步有效去除，這一現象引發了研究者對鐵氨氧化處理低碳氮比污水的關注。目前主要是通過厭氧消化污泥和厭氧氨氧化（Anammox）污泥馴化培養鐵氨氧化污泥，以厭氧消化污泥馴化的鐵氨氧化通常用于高有機物濃度下的氨氧化，而Anammox污泥馴化則更常用于低碳氮比污水的氨氧化，但有關兩種污泥馴化方式在脫氮上的差異仍缺乏了解，不利于對后續工藝脫氮效果的研究。
鐵氨氧化使用的鐵鹽是傳統的混凝除磷藥劑，同時反應過程中會生成亞鐵，也為通過藍鐵礦結晶的形式去除污水中的磷酸鹽提供了一個新的潛在途徑。藍鐵礦結晶是在污水處理以及厭氧消化過程中常見的一種現象，鐵鹽經過異化鐵還原過程形成亞鐵，過飽和后，亞鐵與磷酸鹽形成藍鐵礦結晶從而實現除磷。因此，鐵氨氧化有望在獲得氨氧化的同時實現同步除磷，可基于此開發一種無需人工曝氣、在同一個反應器內實現同步脫氮除磷的工藝。因此，本研究首先在序批式試驗中考察了接種污泥類型對鐵氨氧化脫氮效果的影響，選擇最適宜的污泥馴化方式；在連續流反應器中成功馴化鐵氨氧化污泥后，研究了同步脫氮除磷效果以及微生物群落結構的演替，并對除磷過程進行了分析。
1、材料與方法
1.1 接種污泥和鐵源
分別選用厭氧污泥和Anammox污泥作為接種污泥。厭氧污泥取自實驗室的厭氧污泥反應器的排泥，總懸浮顆粒物（TSS）濃度約為9000mg/L；Anammox污泥取自穩定運行的厭氧氨氧化中試設備，TSS濃度約為18000mg/L。分析純Fe2O3粉末和制備的Fe（OH）3用作Fe（Ⅲ）的來源。Fe（OH）3制備方法如下：取一定量FeCl3·6H2O，于去離子水中溶解，逐滴加入1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至6.5~7.5，重復離心3次，得到紅褐色膠狀Fe（OH）3。
1.2 試驗方法
1.2.1 兩種污泥馴化對比試驗
厭氧污泥作為接種污泥時，將脫氧去離子水以體積比為5∶1加入到接種污泥中，在25℃的黑暗環境靜置1d，離心去上清液，除去本底NH4+-N和NOx--N，重復3次。然后，將去除上清液后的污泥作為接種污泥。采用有效容積為250mL的厭氧瓶進行鐵氨氧化序批式試驗，并設置處理組和對照組，處理組加入Fe2O3，Fe（Ⅲ）濃度為25mmol/L，對照組不添加鐵源。每個反應器接種40mL厭氧污泥和210mL模擬配水（TSS約為600mg/L），并進行N2/CO（280%/20%）曝氣脫氧。厭氧瓶采用丁腈塞及鋁蓋密封，沖洗頂空30min以除去上部的氧氣，然后用錫紙包裹，放置在32℃的搖床（120r/min）中。每組試驗設置3個平行樣。模擬配水成分：NH4+-N（來自NH4Cl）為170mg/L（厭氧污泥）或100mg/L（Anammox污泥），NaHCO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgCl2·6H2O分別為500、27、136、200mg/L，微量元素、維生素均為1mL/L。
Anammox污泥作為接種污泥時，同厭氧污泥處理組和對照組的設置一致，每個反應器內接種20mLAnammox污泥和230mL模擬配水。
1.2.2 連續流運行試驗
以200mL洗凈后的Anammox污泥作為接種污泥，采用連續流反應器開展試驗。試驗裝置與團隊先前論文中一致，有效容積為0.76L，出水處設置U型管，反應器加蓋密封以防止氣體進入，反應器外部用錫紙包裹以減少光照。反應器啟動時投加5mmol/L的Fe2O3，之后在第83天和第160天分別補充投加5mmol/LFe（OH）3。由BT100-2J蠕動泵控制進水，水力停留時間為2d。
該反應器進水為稀釋40倍的尿液廢水，以此來模擬低碳氮比污水。其中，氨氮濃度為110~120mg/L，總氮濃度為110~120mg/L，磷酸鹽磷濃度為6~8mg/L，COD濃度為60~80mg/L，pH約為9，使用稀鹽酸調降至6.9~7.5。
1.3 分析方法
在序批式試驗中，在充分搖勻的狀態下用注射器從各小瓶取樣，用于NH4+−N、NO2−−N、NO3−−N、TN及PO43−−P的測定。所有樣品于離心機（TDL-40B）中以4000r/min的速度離心10min，再用0.45μm的濾頭（TGMF60）過濾。測定Fe（Ⅱ）時，吸取1mL懸液置于裝有5mL鹽酸溶液（0.6mol/L）的樣品管中，蓋上蓋子并搖勻，在搖床（THZ-98C）上于室溫下振蕩浸提16h。其中，NH4+−N采用納氏試劑分光光度法測定，NO2−−N采用重氮化法測定，NO3−−N采用鎘還原法測定，TN采用過硫酸鹽氧化分光光度法測定，PO43−−P采用抗壞血酸法測定，亞鐵和總鐵采用Ferrozine法測定，pH采用雷磁pH計測定，總懸浮顆粒物（TSS）采用重量法測定。
對反應器運行了0、130、190d的污泥進行取樣，于離心機中4000r/min離心10min，傾去上清液，在冷凍干燥機（FD-1A-50）中于−55℃下進行干燥。之后使用JSM-6700F場發射掃描電鏡（SEM）和島津XRD-7000X射線衍射儀進行檢測分析。
對原始Anammox污泥、馴化污泥樣品提取DNA。樣本的細菌豐度和群落通過聚合酶鏈反應和高通量測序進行測定。聚合酶鏈反應擴增通用引物為515F和907R，用2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增后的產物進行檢測；使用IlluminaMiSeq平臺對純化的聚合酶鏈反應產物進行測序分析。
2、結果與討論
2.1 鐵氨氧化污泥的馴化
以厭氧污泥馴化的鐵氨氧化序批式試驗結果如圖1所示。對照組和處理組的氨氮濃度均有下降，相比之下，處理組氨氮下降更為明顯，經過40d的馴化，氨氮濃度由最初的165mg/L降低至61mg/L，同時有亞鐵生成，這通常被視為鐵氨氧化的兩個典型特征，在該過程中亞硝態氮和硝態氮的生成量分別為36、84mg/L，這表明以厭氧污泥馴化的鐵氨氧化產物以硝態氮和亞硝態氮為主。對照組未添加鐵源，但仍然存在氨氮濃度的下降和亞鐵的檢出，因此對照組可能同樣存在鐵氨氧化過程，產物也是以硝態氮和亞硝態氮為主。從結果來看，處理組的氨氮氧化能力更強，且Fe（Ⅱ）濃度始終高于對照組，這表明投加鐵源后處理組的鐵氨氧化活性更強。
以Anammox污泥接種的序批式試驗結果見圖2。在前6d對照組和處理組的氨氮濃度都略有升高，這表明菌種適應過程中存在菌體自溶，因此導致氨氮濃度上升。對照組氨氮濃度在6d后雖然略有變化，但是趨勢并不明顯，亞鐵濃度則略有下降，一直維持在40mg/L以下；相比之下，處理組的氨氮濃度在約6d后則開始顯著下降，同時，體系中Fe（Ⅱ）和硝態氮濃度隨反應的進行而增加，亞硝態氮濃度則都在0.4mg/L以下。因為中性pH下亞鐵極易氧化，而處理組能檢測到較高濃度的亞鐵，說明該體系處于缺氧狀態。在缺氧條件下微生物以Fe（Ⅲ）作為電子受體，Fe（Ⅲ）被還原為Fe（Ⅱ），屬于典型的異化鐵還原過程，而同時氨氮濃度下降，硝態氮和亞硝態氮濃度上升，則意味著氨的氧化，缺氧條件下異化鐵還原和氨氧化是鐵氨氧化的兩個典型特征，因此，缺氧條件下氨氮濃度下降和Fe（Ⅱ）的生成表明發生了鐵氨氧化。反應后期出現了Fe（Ⅱ）和硝態氮濃度持續下降的現象，可能是發生了硝酸鹽依賴型亞鐵氧化（NDFO）反應，硝態氮被還原，并伴隨亞鐵的氧化。就整體而言，處理組氨氮氧化產物有硝態氮、亞硝態氮，去除的氨氮中分別有33%和1%被轉化硝態氮和亞硝態氮。亞硝態氮濃度較低有兩種可能，一是鐵氨氧化不生成亞硝態氮，另一個是生成的亞硝態氮很快通過Anammox過程去除。但是無論怎樣，這都有利于脫氮效率的提升，通過物料平衡可知，最終去除的氨氮中約有66%轉化為了N2。因此，通過Anammox污泥馴化的鐵氨氧化中氨氮主要以N2形式被去除，更適合致力于脫氮處理的鐵氨氧化污泥馴化。
2.2 連續流鐵氨氧化反應器的脫氮除磷效果
以Anammox污泥馴化的連續流鐵氨氧化反應器對低碳氮比污水的處理效果見圖3，反應器運行初期，出水氨氮濃度相比進水僅略有下降。從前述序批式試驗結果可知馴化早期菌體自溶會使得氨氮濃度略有升高，但是考慮到在760mL有效容積中接種了200mL洗凈后的Anammox污泥，因此，這也使得進水中的氨氮被稀釋，從而導致出水氨氮濃度比進水略低。之后，隨著鐵氨氧化功能菌的馴化，氨氮被氧化，出水氨氮濃度持續下降。60d后，出水氨氮濃度由110mg/L降低至84mg/L，去除率提升至23.8%。在第90天向反應器中加入Fe（OH）3，發現更換鐵源后，氨氮的去除率有了明顯的上升。Fe2O3結晶度大，微生物較難利用，而比表面積大的鐵羥基氧化物更容易被微生物利用，于是提升了鐵氨氧化的氨氧化效率。穩定運行階段（125~196d），氨氮去除率在40%~60%之間，最高可去除66mg/L的氨氮，出水硝態氮濃度在12~22mg/L之間，亞硝態氮平均濃度為1mg/L。計算可知，去除的氨氮中約有72%轉化為N2，與序批式試驗結果一致。但是，與課題組前期鐵氨氧化脫氮結果相比，本研究中氨氮去除率降低了約20%，相比于文獻中的配水，稀釋后的尿液廢水含有一定濃度的有機物（COD約為60~80mg/L），其會與氨氮競爭鐵源，從而可能抑制鐵氨氧化的氨氧化效率。出水COD約為10~20mg/L，去除率約為79%，可見鐵氨氧化反應器適用于低碳氮比污水的處理。
在穩定運行階段，進水磷濃度為6.5mg/L，去除率在40%左右，去除磷的平均值約為2.6mg/L。Fe（OH）3表面有大量活性吸附位點，是除磷的優良吸附劑，Fe（OH）3吸附可能是一個除磷的途徑。對鐵氨氧化反應器中的污泥進行了分析，結果表明，污泥中存在晶體類物質，菱形片狀晶體互相交叉聚集在一起（見圖4），與文獻中報道的藍鐵礦晶體形貌相似。進一步分析發現，產物的XRD衍射峰部分與Fe2O3標準卡片的衍射峰相符合，說明污泥中存在Fe2O3，這是第一次投加鐵源的緣故。同時，XRD衍射峰與藍鐵礦的標準卡片峰位置一致，說明存在藍鐵礦晶體，即反應器中有藍鐵礦晶體生成。這表明，鐵氨氧化形成的亞鐵可以與磷酸鹽結合形成藍鐵礦結晶，從而成為另一個除磷途徑。
稀釋尿液進水pH在6.9~7.5之間，出水pH為6.8~7.4，略有降低，主要是因為鐵氨氧化過程會消耗堿度，使得pH略有下降。反應器出水Fe（Ⅱ）濃度為4.6~42.8mg/L，這說明Fe（Ⅲ）被還原為Fe（Ⅱ），氨氧化和鐵還原同時發生，間接證明了鐵氨氧化過程的存在。以上結果表明，通過鐵氨氧化可以實現氮和磷的同步去除，但是目前脫氮除磷效率仍然不高，有待進一步研究優化。
2.3 微生物群落演化
在門水平上，與接種污泥相比，反應器中污泥的微生物種類更加多樣化，優勢菌仍然為變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidota）和浮霉菌門（Planctomycetota），但是經過馴化后綠彎菌門和酸桿菌門（Acidobacteriota）兩種微生物豐度明顯增加（見圖5）。有研究表明，Proteobacteria、Acidobacteriota、Bacteroidota等存在具有鐵氨氧化功能的微生物，其中，Acidobacteriota與厭氧氨氧化和鐵還原直接相關，馴化前后（0、130、190d）的豐度分別為0.96%、3.77%、4.23%，豐度顯著增加，說明鐵氨氧化的馴化過程是成功的。
在屬水平上，經過馴化后微生物群落結構也發生了較大的變化，如圖6所示。
接種污泥中，處于優勢的微生物主要有norank_f__norank_o__SBR1031、Denitratisoma、Mali⁃kia、OLB13、norank_f__PHOS-HE36，而馴化后的優勢菌為norank_f__norank_o__SBR1031、Denitratiso⁃ma、OLB13、norank_f__PHOS-HE36、SM1A02。馴化后Malikia這種反硝化菌的數量大大減少，相對豐度由25.59%降低至0，表明因為反應器中有機物濃度較低，反硝化被抑制。Candidatus_Brocadia和Candidatus_Kuenenia都是參與厭氧氨氧化的重要微生物，它們的相對豐度由初始的3.70%和1.62%降低至0.50%和0.65%，亞硝酸鹽是厭氧氨氧化菌最重要的電子受體，在本研究中，由于缺少亞硝酸鹽，導致Anammox菌豐度降低。Pseudomonas和Geobacter都是對鐵氨氧化過程起重要作用的鐵還原菌，在處理過程中實現了這兩種鐵還原菌等功能微生物的富集。馴化后，Geobacter豐度達到0.099%，Pseudomonas的豐度由初始的0逐漸升高到2.47%。Thiobacillus是一種鐵氧化細菌，有助于NDFO過程進行硝酸鹽的還原，相對豐度由0.04%上升到2.38%，間接證明了反應器中存在NDFO過程。
2.4 新技術的應用前景
鐵氨氧化是一種新發現的鐵和氮地球化學循環路徑，近年來在污水處理中的脫氮效果也為一些研究所證實，本研究發現Fe（OH）3是一種比Fe2O3更有效促進鐵氨氧化的鐵源，可以提升鐵氨氧化的效率，但是仍然需要進一步更深層次的分析，哪些微生物起作用、氨氮的氧化途徑以及電子傳遞途徑等作用機制仍然不清晰，這都會限制氨氧化效率的進一步提升。鐵氨氧化除了實現氨氮的氧化，同時也包含著鐵的異化還原過程，本研究在反應器中檢測到了藍鐵礦的生成，證實了最初的假設，可以為開發新型的厭氧同步脫氮除磷技術提供理論基礎。
該技術無需曝氣為氨氧化提供氧氣，甚至不需要缺氧反硝化，也不需要生物除磷中的厭氧釋磷和好氧吸磷的復雜過程，可以在同一個反應器中實現同步脫氮除磷，因此，與傳統的污水生物脫氮除磷工藝相比，它具有典型的低碳排放優勢。但是，該新型脫氮除磷技術的脫氮效率和除磷效率并不高，從已有研究來看，鐵氨氧化可以針對100mg/L的進水氨氮實現90%以上的氨氧化效率，一方面，可能是進水含有的有機物抑制了鐵氨氧化效果，另一方面也可能是藍鐵礦結晶的生成占用了部分鐵，導致NDFO過程受限，進而削弱了鐵氨氧化效果。鑒于有機物的潛在負面影響，該技術可能更適用于低碳氮比污水的脫氮除磷處理，比如農村污水、厭氧消化液等。在將來可以針對鐵氨氧化的作用機制以及影響因素開展更多研究以實現同步脫氮除磷效果的優化，促進新技術的成熟與應用。
3、結論
①經厭氧污泥馴化后，鐵氨氧化產物主要是硝態氮和亞硝態氮，而Anammox污泥馴化后的鐵氨氧化產物主要是N2，因此，Anammox污泥更適合作為鐵氨氧化的接種污泥。
②鐵氨氧化連續流反應器可以實現對低碳氮比污水中氮和磷的同步去除。在穩定運行階段，氨氮去除率在40%~60%之間，去除的氨氮中約72%轉化為N2，磷的去除率約為40%。
③反應器中Anammox菌群豐度下降，鐵還原菌逐漸富集，Pseudomonas的豐度最高可達到2.47%，同時，參與NDFO過程的Thiobacillus菌屬相對豐度由0.04%上升到2.38%，這表明反應器中鐵氨氧化、Anammox和NDFO過程可以共同作用于脫氮。
④反應器中檢測到藍鐵礦晶體的生成，表明鐵氨氧化形成的亞鐵可以與磷酸鹽發生藍鐵礦結晶反應，從而促進除磷。
⑤鐵氨氧化技術不僅可以同步脫氮除磷，而且不需要供氧，因此具有低碳排放優勢，尤其適用于低碳氮比污水的脫氮除磷處理，可以與污水中碳源利用技術結合構建更可持續的污水處理技術體系。（來源：北京林業大學環境科學與工程學院北京市水體污染源控制技術重點實驗室，北京國環清華環境工程設計研究院有限公司，清華大學環境學院）
