畜牧業是我國農業的支柱產業，隨著畜禽規模化養殖水平逐步提升，由畜禽養殖高度集約化帶來的環境問題日益突出。畜禽糞污經厭氧消化處理后產生大量沼液，種養結合是一種常用的處理方式，但由于受納農田有限、養殖規模化程度高等因素，需要尋求有效的沼液處理技術。畜禽養殖場沼液具有高氨氮（NH4+-N為600~2000mg/L）、低碳氮比（COD/TN＜3）、可生化性差（BOD5/COD＜0.3）、成分復雜、水質波動大等特點，且冬季低溫會影響生物反應活性，因此對生物脫氮和工藝穩定性提出了更高的要求。
厭氧氨氧化（Anammox）技術以氨氮為電子供體、亞硝酸鹽為電子受體反應生成氮氣，適用于處理高氨氮、低碳氮比廢水，具有無需外加碳源、反應速度快、污泥產量低等優點。部分豬場污水處理工程中發現了厭氧氨氧化細菌（AnAOB）自富集現象，如何調試并發揮厭氧氨氧化作用成為需要解決的工程問題。Chen等通過調控曝氣并逐步降低外加碳源量，在連續流改良厭氧/缺氧/好氧工藝處理豬場沼液的工程中實現了厭氧氨氧化脫氮，TN去除率達到83%；Wang等在福建某豬場沼液處理工程中（水溫為22~28℃）發現厭氧氨氧化脫氮負荷為38.1gN/（m3·d），TN去除貢獻率為40%。另有研究發現，較高的有機物、溶解氧和亞硝酸鹽濃度對AnAOB具有抑制作用，且低溫（10~15℃）條件下AnAOB活性會顯著降低。而針對水質、溫度波動對厭氧氨氧化活性影響的研究大多在小試裝置中開展模擬試驗，缺乏實際污水、工程規模的試驗數據。因此，針對畜禽養殖污水水質和溫度波動等復雜條件，如何應用厭氧氨氧化技術提升脫氮性能并保障出水水質，是當前工程應用難題，需要開發相應組合工藝與配套設備。
針對豬場沼液低碳氮比、高氨氮的水質特點，為進一步尋求高效低耗的工藝解決路線，筆者構建了一體式污水高效處理裝置，由缺氧/好氧（AO）工藝和MBR深度處理工藝組成。其中，AO工藝中形成以厭氧氨氧化為核心的復合生物脫氮過程，MBR則為保障出水水質的深度處理技術。重點考察了在豬場沼液水質和溫度波動條件下，AO-MBR組合工藝對碳、氮污染物的轉化與去除效果，并利用高通量測序技術探究了微生物群落結構和功能微生物的作用機制，以期為規模化畜禽養殖污水的高效脫氮提供技術支持。
1、材料與方法
1.1 試驗裝置與工藝流程
一體式裝置的工藝流程如圖1所示。主反應區采用AO工藝，其中A區尺寸為1m×1m×2.2m、O區尺寸為3m×2m×2.2m，總有效容積為14m3，進水流量約為4~5m3/d，HRT為2.8~3.5d，進水COD和氨氮負荷分別為1.00~1.50kgCOD/（m3·d）和0.25~0.30kgN/（m3·d）。各反應池中部設置攪拌器、O區底部設置微孔曝氣系統，O區DO控制在0.2~0.3mg/L；通過氣提實現O區末端至A區的混合液回流，回流比為150%~200%，由二沉池至A池前端的污泥回流比為100%~150%。
為實現碳、氮污染物的進一步削減，采用浸沒式MBR作為深度處理工藝，池體尺寸為2m×1m×2.2m，有效容積為4m3，采用PVDF中空纖維膜組件，膜面積為80m2，通量為3~5L/（m2·h）。產水泵抽吸間隔為運行9min、停1min。當產水泵抽吸負壓達到-30kPa時，采用化學藥劑（2%檸檬酸）浸泡方式對膜組件進行清洗，膜組件下部穿孔管曝氣5min、停30min，維持6h。
1.2 接種污泥
裝置接種污泥為具有一定厭氧氨氧化活性的絮體污泥，AO各分區接種污泥一致。接種后系統污泥濃度為2860mg/L，厭氧氨氧化活性為0.29kgN/（kgMLVSS·d），氨氧化細菌（AOB）活性為0.58kgN/（kgMLVSS·d），亞硝酸鹽氧化細菌（NOB）活性為0.08kgN/（kgMLVSS·d）。
1.3 試驗用水與試驗設計
試驗用水為河北省衡水市某豬場沼液，未進行水質調控。試驗共運行171d（11月—次年4月，為冬季低溫期），試驗根據進水水質不同分為3個階段，3個階段的進水C/N均值分別為1.70、2.67和3.34，具體水質指標如表1所示。
1.4 水質分析方法
試驗過程中每天上午08：00采集進水、二沉池出水和MBR出水各500mL，用于水質指標的檢測，各項水質指標均參照國家標準方法進行測定。其中，NH4+-N采用納氏試劑分光光度法測定，NO2--N采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法測定，NO3--N采用紫外分光光度法測定，TN采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定，TP采用鉬酸銨分光光度法測定，COD采用重鉻酸鉀法測定。
NO2--N的積累率（NAR）和硝酸鹽產生比例（ΔNO3--N/ΔNH4+-N）計算公式如下：
式中：NO3--Neff、NO2--Neff、NH4+-Neff分別為出水硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮、氨氮濃度，mg/L；NO3--Nin、NH4+-Nin分別為進水硝酸鹽氮、氨氮濃度，mg/L。
1.5 典型功能微生物的活性測定
AOB和NOB活性采用離線方式測定。取混合液約1000mL，在有效容積為2L燒杯中，短時間充分曝氣使DO快速提升至4mg/L以上，開始計時。控制DO>4mg/L、溫度為37℃、pH約為7.5~8.0、初始氨氮濃度>100mg/L，進行AOB、NOB活性測定試驗，每隔20min取樣一次，試驗共進行2h，共計7個水樣。對水樣進行“三氮”濃度測定，根據氨氮隨時間的減少量計算AOB反應速率，根據硝酸鹽隨時間的產生量計算NOB反應速率。
AnAOB活性也采用離線方式測定。在混合均勻狀態下，取反應器內活性污泥100mL，控制攪拌轉速為100~120r/min、溫度為35℃，在氨氮過量（NH4+-N>50mg/L）情況下，加入亞硝酸鹽氮儲備液使NO2--N初始濃度在30mg/L，等時間間隔取樣5~10次，測定“三氮”濃度變化，繪制“三氮”濃度隨時間的變化曲線，在此基礎上計算厭氧氨氧化脫氮速率。
1.6 DNA提取與微生物群落測定
在試驗各階段采集1~2個典型污泥樣品，采樣間隔為20~30d。對接種污泥及運行第7、30、105、134和163天的反應器內混合液進行采樣，污泥樣品分別記作D0、D7、D30、D105、D134和D163。采用FastDNA®SPINKitforsoil（MPBiomedicals，SantaAna，CA）試劑盒提取污泥樣品的DNA，然后采用Nanodrop分光光度計測定DNA濃度和質量。對提取的DNA樣品進行515F/806R擴增，并對擴增子進行高通量測序。微生物群落結構采用QIIME2流程分析，采用最小樣本序列數抽平后每個樣品中含有41981條cleanreads，樣品中的ASV數量為881~1347個，采用silva138/16s_bacteria數據庫進行分類學比對。
2、結果與討論
2.1 碳、氮污染物的去除效果
2.1.1 COD去除效果
各階段進水、二沉池出水和MBR出水COD濃度如圖2所示。
3個階段的進水COD濃度整體上呈逐步升高的趨勢，二沉池出水COD濃度亦逐步升高，在階段1~3平均濃度分別為544、876和1027mg/L，AO工藝對COD的平均去除率分別為56%、41%和46%，AO工藝對COD的去除效果受進水水質波動影響較大。然而，3個階段MBR出水COD平均濃度分別為259、280和374mg/L，AO-MBR組合工藝對COD的平均去除率分別為79%、81%和80%。盡管AO出水COD濃度變化幅度較大，但AO-MBR組合工藝可維持穩定的COD去除率。楊培媛采用MBR處理奶牛場養殖污水時，在進水COD濃度為7135~7860mg/L條件下，出水COD濃度為（357±53）mg/L，與本研究結果相當，表明MBR可維持較高的COD去除率。值得注意的是，由于豬場沼液中含有大量腐殖質等物質，MBR出水COD濃度仍較高。
2.1.2 氨氮和TN去除效果
AO-MBR組合工藝對NH4+-N和TN的去除效果如圖3所示。階段1進水NH4+-N和TN濃度高于階段2和3，階段1進水COD/TN均值僅為1.71，AO工藝對NH4+-N和TN的平均去除率分別為93%和88%。Sui等分別通過硝化-反硝化和短程硝化反硝化處理豬場污水，當進水COD/TN分別為8.81和6.95時，TN去除率分別為94%和93%。隨著進水碳氮比的降低，反硝化碳源不足是限制總氮去除的主要因素。
如圖4所示，在階段1，AOB和AnAOB活性均值分別為0.60和0.30kgN/（kgMLVSS·d），遠高于NOB活性均值，因此NH4+-N和TN的去除是通過亞硝化-厭氧氨氧化（PN/A）反應實現的。如圖5所示，在階段1，NAR平均值維持在14%左右。基于PN/A工藝，高氨氮、低碳氮比污水可實現高效脫氮，且ΔNO3--N/ΔNH4+-N逐步降低，均值為1.44%，表明存在反硝化反應。PN/A的理論硝酸鹽產生比例為11%，通過混合液回流，在缺氧池中發生反硝化反應，降低了硝酸鹽濃度。經后續的MBR處理后，出水NH4+-N和TN濃度進一步降低。MBR中DO濃度在4.0~5.0mg/L，較高的DO使NH4+-N進一步被氧化為NO3--N，而MBR可能通過截留部分有機氮而使出水TN濃度略有削減。
在階段2，進水C/N均值升至2.67，在第66~72天存在進水濃度驟降的情況，同時伴隨低溫（約16℃），盡管AO工藝的COD去除率降低，但NH4+-N和TN的去除率維持在較高水平，且后續的MBR工藝進一步保證了系統氮素的穩定去除。在第84~110天存在低溫和運行管理疏忽等問題，導致AO工藝出水NH4+-N和TN濃度升高，但后續的MBR工藝可以進一步去除NH4+-N和TN。在階段2，由于進水C/N值升高、溫度降低，可能對AnAOB產生了抑制作用，NAR均值升至46%（見圖5）。如圖4所示，AnAOB活性在第104天明顯下降至0.08kgN/（kgMLVSS·d），而AOB活性較穩定，維持在0.7kgN/（kgMLVSS·d），進而導致二沉池中亞硝酸鹽的積累。AnAOB活性受低溫影響顯著，當溫度從30℃降至20和10℃時，AnAOB活性可分別降至原活性的39%和14%。有機物是抑制AnAOB活性的另一重要因素，有研究發現，當養殖污水COD濃度從121mg/L升至290mg/L時，AnAOB活性受到抑制，異養微生物大量增殖。有機物可能通過抑制NH4+和NO2-的跨膜傳輸以及聯氨合成酶（HZS）表達對AnAOB產生抑制作用。在階段2，AO工藝的硝酸鹽產生比例（ΔNO3--N/ΔNH4+-N）為3.27%，表明在該階段反硝化反應仍較為顯著。
在階段3，進水C/N均值進一步升至3.34，在第110天仍存在低溫現象，隨著溫度逐漸升高至20℃，脫氮活性逐步恢復（見圖4）。在該階段，AnAOB活性從0.09kgN/（kgMLVSS·d）升高至0.18kgN/（kgMLVSS·d），AOB活性從0.61kgN/（kgMLVSS·d）升至0.69kgN/（kgMLVSS·d），表明溫度可能是影響AnAOB和AOB活性的更重要因素。Lotti等研究發現，溫度從10℃升至15℃后，Anammox活性得到恢復，但長時間維持10℃會導致AnAOB活性不可逆性地降低。在階段3，AO工藝和AO-MBR組合工藝的NH4+-N去除率分別為86%和99%，TN去除率分別為74%和81%，從圖3可以看出，AO工藝出水水質波動大，這主要受進水水質、溫度、運行調控等因素的影響；而MBR出水水質穩定性高，是一種有效的水質保障工藝。
隨著進水C/N值的升高，MBR對NH4+-N和TN的去除貢獻逐步升高。在階段2，MBR對COD的去除貢獻高于階段1和3，可能與該階段水質波動大等因素有關。對不同進水C/N值條件下，AO工藝和AO-MBR組合工藝的污染物去除率進行了分析，結果如圖6所示（圖中條帶為95%置信區間）。隨C/N值的升高，AO工藝對NH4+-N的去除率降低，而COD和TN去除率在C/N值為3時最低。由于AOB和AnAOB是自養微生物，進水有機物濃度升高對其有抑制作用。當C/N值升高時，反硝化反應增強，可提升對COD和TN的去除率，而較低的C/N值（如小于1.5）條件下PN/A占主導作用，亦可實現較高的COD和TN去除率。而AO-MBR組合工藝在不同C/N值條件下均能維持較為穩定的COD、NH4+-N和TN去除率。在AO工藝后續設置MBR工藝，可保證出水水質穩定，降低因自養和異養功能微生物活性及群落變化而導致的出水水質波動。
2.2 微生物群落結構變化
AO反應池中微生物群落分布情況見圖7。由圖7（a）可知，在門水平上，Proteobacteria、Bacteroidota、Chloroflexi、Deinococcota、Firmicutes、Planctomycetota為主要的菌門。Chen等在處理豬場沼液的活性污泥系統中檢測到的優勢菌門為Proteobacteria、Bacteroidota、Chloroflexi、Firmicutes、Planctomycetota等，與本研究結果相似。其中，Planctomycetota相對豐度平均為3.3%，且其相對豐度在試驗后期逐步降低。
PN/A的典型功能微生物AOB和AnAOB的相對豐度如圖7（b）所示。經高通量測序檢測到的典型AOB和AnAOB分別為Nitrosomonas及Ca.Brocadia和Ca.Kuenenia。已有的研究指出，Ca.Kuenenia大多在高濃度底物條件下出現，而Ca.Brocadia的底物親和力強，適于低氨氮濃度環境。在處理豬場污水時底物濃度較高，反應器內NH4+-N濃度普遍維持在較高濃度，且存在一定的NO2--N積累現象，因此該底物條件適于Ca.Kuenenia富集。本研究中存在Ca.Brocadia和Ca.Kuenenia同時富集現象，這表明兩種AnAOB協同參與氮轉化過程。NOB如Nitrospira的相對豐度僅為0.033%，豐度極低。在D0和D7樣品中，Nitrosomonas的相對豐度分別為18.4%和14.4%，隨著試驗的進行，最終維持在6.6%左右。從接種污泥（D0）至階段2（D105）AnAOB相對豐度從2.1%降至0.3%，表明進水有機物、低溫等因素對AnAOB具有抑制作用。盡管AnAOB的相對豐度降低了86%，但其活性均值仍能維持為0.14kgN/（kgMLVSS·d）（約為原活性的50%），表明AnAOB盡管豐度較低，但仍能維持較好的脫氮效果。
樣品中高豐度的異養微生物分布如圖7（c）所示。不同階段富集的異養菌分為兩類，區域A為階段1富集的異養菌，區域B為階段2和3富集的異養菌。隨著試驗的進行，異養菌種類發生了較大變化。階段1中富集的異養菌主要為Thauera、OLB13和LD29，以及部分屬水平未分類的菌屬。Thauera是污水處理過程中常見的異養反硝化菌，在低碳氮比條件下可發生部分反硝化反應（NO3-→NO2-），為厭氧氨氧化提供底物NO2-。Zhang等通過宏基因組解析了Thauera與AnAOB的協作關系。階段2和3中富集的異養菌主要為Truepera、Denitratisoma、Limnobacter和Thiobacillus。隨著進水C/N值的增加，這些微生物大量富集。Truepera與Ca.Kuenenia在氮肥加工廢水和垃圾滲濾液等高濃度污水處理中協同發生脫氮反應。Denitratisoma為典型的異養反硝化菌，可在低溫條件下發生反硝化反應，大量文獻報道其與AnAOB共同參與脫氮反應。Limnobacter作為異養菌對有機物進行降解并防止AnAOB受到有機物抑制。Thiobacillus作為典型硫自養反硝化功能微生物，可以氧化沼液中的S2-并協同發生反硝化反應，從而提升TN去除率。
3、結論
①隨著豬場沼液的C/N均值從1.71提高至3.34，同時受低溫的影響，AO工藝對COD、NH4+-N和TN的去除效果受到影響，AnAOB活性大幅降低。后續采用MBR作為深度處理工藝，AO-MBR組合工藝可實現穩定的COD、NH4+-N和TN去除效果。
②當溫度從16℃升高至20℃時，AnAOB活性從0.09kgN/（kgMLVSS·d）升高至0.18kgN/（kgMLVSS·d），AO工藝的NH4+-N和TN去除效率快速恢復。反應器中厭氧氨氧化菌（Ca.Brocadia和Ca.Kuenenia）和異養菌（Truepera、Denitratisoma、Limnobacter和Thiobacillus）發生了協同脫氮反應。（來源：中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所農業農村部設施農業節能與廢棄物處理重點實驗室，安平縣弘嘉環保技術有限公司，中國科學院生態環境研究中心水污染控制實驗室）
