申請日2015.07.24

　　公開(公告)日2015.11.04

　　IPC分類號C12N1/21; C12N15/75; C02F101/38; C12R1/01; C02F3/34

　　摘要

　　本發明公開了一種基因工程好氧硝化細菌及其構建方法和在處理高濃度氨氮污水中的應用。基因工程硝化菌是表達AMO和HAO基因的重組好氧硝化細菌(具有高效去除氨氮的性能)，拉丁文學名為Brevibacillus?reuszeri，命名為Biodehiammonia菌株;保藏單位：中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏時間：30年，保藏編號CMGCC10254。基因工程好氧硝化細菌中插入外源基因AMO和HAO的核苷酸序列分別如序列編號1和2所示，基因工程硝化菌的AMO氨基酸序列如序列編號3所示，基因工程硝化菌的HAO氨基酸序列如序列編號4所示，基因工程好氧硝化細菌的AMO基因前帶有分泌型信號肽，其中信號肽的氨基酸序列如編號5所示。該基因工程好氧硝化細菌與膜生物反應器聯合用于污水的處理，能取得非常好的處理效果。

　　權利要求書

　　1.一種基因工程好氧硝化細菌，其特征在于，所述基因工程好氧硝化菌是 Biodeammonianitrogen工程菌，拉丁文學名為Brevibacillus reuszeri，在中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CMGCC No.10254。

　　2.根據權利要求1所述的基因工程好氧硝化細菌，其特征在于，所述基因工程 好氧硝化細菌中轉化的外源基因的核苷酸序列如序列編號1和2所示。

　　3.根據權利要求1或2所述的基因工程好氧硝化細菌，其特征在于，所述基因 工程好氧硝化細菌的氨單加氧酶基因和羥胺氧化酶的氨基酸序列如序列編號3 和4所示。

　　4.根據權利要求3所述的基因工程好氧硝化細菌，其特征在于，所述基因工程 好氧硝化細菌的氨單加氧酶基因前帶有分泌型信號肽，其中信號肽的氨基酸序列 如編號5所示。

　　5.權利要求1至4任一所述的基因工程好氧硝化細菌的構建方法，其特征在于， 包括如下步驟：

　　(1)利用細菌分離技術分離具有氨氮去除效果的硝化細菌基因組;

　　(2)利用PCR技術克隆氨單加氧酶基因和羥胺氧化酶，與pSIM6載體連 接后重組至步驟(1)的好氧硝化細菌基因組的特定位點中;

　　(3)利用基因工程技術從步驟(2)的產物中篩選出表達氨單加氧酶和羥胺 氧化酶基因的好氧硝化細菌;

　　(4)將步驟(3)的產物在高濃度氨氮條件下馴化，得到具有處理高濃度氨 氮污水能力的基因工程好氧硝化細菌;

　　(5)利用發酵技術將步驟(4)所述具有處理高濃度氨氮污水能力的基因工 程硝化細菌進行擴增，得到所述基因工程好氧硝化細菌。

　　6.權利要求1至4任一所述的基因工程好氧硝化細菌的應用，其特征在于，將 膜生物反應系統與所述基因工程好氧硝化細菌聯合，在高濃度氨氮條件下，有效 去除污水中的高濃度氨氮;

　　所述膜生物反應系統為流動的需氧膜生物反應系統，膜的材質為樹脂;

　　所述高濃度氨氮在所述污水中的含量是3000～6000mg/L。

　　7.根據權利要求6所述的基因工程好氧硝化細菌的應用，其特征在于，所述污 水中COD的去除率為98.44～99.84%。

　　8.根據權利要求6所述的基因工程好氧硝化細菌的應用，其特征在于，所述污 水中氨氮去除率為98.86～99.94%。

　　9.根據權利要求6～8任一所述的基因工程好氧硝化細菌的應用，其特征在于， 所述污水包括生活污水、工業廢水、垃圾滲濾液以及高濃度氨氮廢水。

　　說明書

　　一種基因工程好氧硝化細菌及其構建方法和在處理高濃度氨氮污水中的應用

　　發明領域

　　本發明涉及表達兩種外源基因的重組好氧硝化細菌菌劑及其構建方法和在高 濃度氨氮污水處理中的應用，具體地說涉及表達亞硝酸鹽還原酶和羥胺氧化酶的 基因工程好氧硝化細菌。

　　背景技術

　　本發明中提到的膜生物反應系統是流動的需氧的膜生物反應系統(fluidized bed membrance bioreactor,AFMBR)，基因工程好氧硝化細菌是在低溫條件下具有高 效去除高濃度氨氮的Biodehiammtrogen工程菌。

　　隨著人類活動的增多，產生的污水日益增加，高濃度氨氮污水的處理以成為 我國急需解決的問題之一。雖然現在使用的微生物處理污水，取得一定的效果， 但是大多數均不能穩定的運行。綜上所述，急需新的技術和方案來解決此問題。

　　生物脫氮法是現代工業污水處理中最有效的去除污水中氨氮的方法，其中由 硝化細菌和反硝化細菌完成的硝化反應和反硝化反應是將氨氮從污水中去除最為 關鍵的步驟。自然狀況下的化能無機自養硝化細菌具有生長速率低、生物量小和 對環境因子敏感等生理特點，使得污水處理廠的脫氮效果很不穩定，尤其是在處 理高濃度氨氮污水時，對硝化細菌的數量及硝化反應速率要求更高。

　　污水除氮的第一步就是在亞硝化細菌的作用下將銨離子轉化為羥氨，在這一 步中，發揮催化作用的是氨單加氧酶和羥胺氧化酶。氨單加氧酶和羥胺氧化酶就 是異養硝化菌代謝過程中的關鍵酶是AMO和HAO，AMO主要催化NH3氧化形成 羥胺(NH2OH)，而羥氨又在異養硝化菌特有的不含血紅素的羥氨氧化酶(HAO)的 作用下轉化為亞硝酸鹽或N2O。

　　MBR可以達到與活性污泥系統相似的處理效果，如COD的去除、硝化、反 硝化以及化學或者生物除磷。作為摸分離技術與生物技術結合的污水處理新工藝， MBR由于其出水水質優良穩定，裝置占地面積小等顯著優點，使其在城市污水、 工業廢水、垃圾滲濾液的處理和回用方面表現出良好的競爭力，并在全球范圍受 到高度重視，是公認的21世紀最具有吸引力和競爭力的污水處理與回用技術。我 國對MBR的應用與研究起步相對較晚，但是發展很快。本設計使用MBR/活性污 泥混合系統結合基因工程好氧硝化細菌增強對高濃度氨氮污水的處理的效果。

　　綜上所述，通過本發明構建的基因工程好氧硝化細菌使MBR/基因工程細菌混 合系統對高濃度氨氮污水的處理效果得到了增強，提高了出水質量。

　　發明內容

　　鑒于以上問題，本發明的目的是提供一種基因工程好氧硝化細菌及其構建方 法和在處理高濃度氨氮污水處理中的應用。具體技術方案如下：

　　一種基因工程好氧硝化細菌，所述基因工程硝化菌是Biodeammonianitrogen工程 菌，拉丁文學名為Brevibacillus reuszeri，命名為Biodehiammonia菌株;保藏單位： 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地點：北京市朝陽區北辰 西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏時間：2014年12月29日，保藏 編號CGMCC No.10254。

　　所述基因工程硝化菌中轉化的外源基因的核苷酸序列如序列編號1和2所示。

　　所述基因工程好氧硝化細菌表達的氨單加氧酶基因(ammonia monooxygenase，AMO)的氨基酸序列如序列編號3所示，基因工程好氧硝化細菌 表達的氨羥胺氧化酶(Hydroxylamine oxidase,HAO)的氨基酸序列如序列編號4 所示。

　　所述基因工程硝化菌的氨單加氧酶基因前帶有分泌型信號肽，其中信號肽的 氨基酸序列如編號5所示。

　　上述任一所述的基因工程硝化菌的構建方法，包括如下步驟：

　　(1)利用細菌分離技術分離具有氨氮去除效果的硝化細菌基因組;

　　(2)利用PCR技術克隆氨單加氧酶基因和羥胺氧化酶，與pSIM6載體連 接后重組至步驟(1)的好氧硝化細菌基因組的特定位點中;

　　(3)利用基因工程技術從步驟(2)的產物中篩選出表達氨單加氧酶和羥胺 氧化酶基因的好氧硝化細菌;

　　(4)將步驟(3)的產物在高濃度氨氮條件下馴化，得到具有處理高濃度氨 氮污水能力的基因工程好氧硝化細菌;

　　(5)利用發酵技術將步驟(4)所述具有處理高濃度氨氮污水能力的基因工 程硝化細菌進行擴增，得到所述基因工程好氧硝化細菌。

　　上述任一所述的基因工程硝化菌的應用，將膜生物反應系統與所述基因工程 硝化菌聯合，在高濃度氨氮條件下，有效去除污水中的高濃度氨氮;

　　所述膜生物反應系統為流動的需氧膜生物反應系統，膜的材質為樹脂;

　　所述高濃度氨氮在所述污水中的氨氮含量是3000～6000mg/L。

　　所述污水中COD的去除率為98.44～99.84%。

　　所述污水中氨氮去除率為98.86～99.94%。

　　所述污水包括生活污水、工業廢水、垃圾滲濾液以及高濃度氨氮廢水等。

　　本發明通過應用基因工程操作技術，獲得了具有高效去除污水中高濃度氨氮 的基因工程硝化細菌。實驗表明表的達外源基因重組到細菌基因組中，沒有影響 硝化細菌的增值。高濃度氨氮污水處理實驗研究結果表明，重組硝化細菌可以有 效去除工業廢水、垃圾滲濾液中的高濃度氨氮，達到國家要求出水標準。說明表 達功能基因的重組硝化細菌可作為理想高濃度氨氮去除菌劑。