多種工業(yè)廢水及市政污水都同時(shí)含有碳、氮和硫系化合物.含氮化合物具有毒性和臭味，而且能夠引起水體的富營養(yǎng)化.基于目前的生物處理技術(shù)，銨鹽通常在好氧條件下被氧化為硝酸鹽，然后硝酸鹽在厭氧條件下通過反硝化作用被還原成氮?dú)?自然界多種異養(yǎng)微生物都能夠利用各種有機(jī)物作為碳源和能源進(jìn)行反硝化作用.它們具有豐富的生物多樣性，通常屬于變形菌門中不同的屬，例如：Rhodoferax、Dechloromonas和Sulfuritalea.

　　硫化物具有強(qiáng)烈的毒性和臭味，它的超標(biāo)排放是目前面臨的嚴(yán)峻的環(huán)境問題之一.它能夠和細(xì)胞色素中的金屬離子進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的呼吸作用.此外，它還具有腐蝕性并產(chǎn)生很高的化學(xué)需氧量(chemical oxygen demand，COD).硫化物通常在產(chǎn)甲烷的過程中伴隨產(chǎn)生，它也產(chǎn)生于多種工業(yè)加工過程，例如：石油化工、造紙、制革等.許多物理、化學(xué)和電化學(xué)方法已經(jīng)用來處理氣體和水中的硫化物，例如：沉淀法、氣提、離子交換、電催化氧化、有機(jī)溶劑和化學(xué)氧化.其中，利用無色硫細(xì)菌的生物處理技術(shù)具有低成本、低能耗和產(chǎn)物無害等優(yōu)勢.因此，它是一種國際上日益關(guān)注的熱門技術(shù).Thiobacillus denitrificans被發(fā)現(xiàn)能夠利用無機(jī)硫化合物作為能量來源，無機(jī)碳化合物作為碳源進(jìn)行生長.左劍惡等在升流式生物膜反應(yīng)器中，利用無色硫細(xì)菌處理廢水中的硫化物，去除率為90%，單質(zhì)硫轉(zhuǎn)化率為100%.這類能夠利用無機(jī)硫化合物的自養(yǎng)反硝化細(xì)菌具有較高的研究價(jià)值，因?yàn)樗�在反硝化過程中不需要再額外添加有機(jī)碳源并節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本.相關(guān)技術(shù)目前已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，例如：市政污水、地表水和垃圾滲濾液的處理.

　　近年來，多單元聯(lián)合生物技術(shù)快速發(fā)展并應(yīng)用于處理含有碳、氮和硫系化合物的廢水.此技術(shù)的過程原理為：厭氧發(fā)酵階段硫酸鹽還原所產(chǎn)生的硫化物及少量剩余COD在反硝化單元被來自硝化單元的硝酸鹽氧化去除.在香港特別行政區(qū)，應(yīng)用此技術(shù)已經(jīng)成功建立了示范工程，主要進(jìn)行沿海地區(qū)高硫酸鹽生活污水的脫氮處理.脫氮單元中的活性污泥通常含有自養(yǎng)和異養(yǎng)反硝化細(xì)菌，其中有些物種能夠利用含硫化合物還原硝化單元所產(chǎn)生的硝酸鹽.除能以含硫化合物作為能源的自養(yǎng)反硝化細(xì)菌以外，一些異養(yǎng)細(xì)菌也被發(fā)現(xiàn)具有這樣的功能.它們能夠利用硫化物和硝酸鹽進(jìn)行呼吸作用，并產(chǎn)生單質(zhì)硫和氮?dú)庾鳛榉磻?yīng)產(chǎn)物.這種生物基單質(zhì)硫具有親水的特性，能夠作為生產(chǎn)肥料和殺蟲劑的原料，具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值.

　　本研究分離1株能夠利用硝酸鹽作為電子受體，乙酸鹽和硫化物作為電子供體進(jìn)行生長代謝的細(xì)菌.在硫化物氧化過程中，單質(zhì)硫?yàn)橹饕�的反�?yīng)產(chǎn)物.已有的研究結(jié)果顯示Thauera屬的物種是污水處理系統(tǒng)中最活躍的反硝化細(xì)菌，但是其硫氧化的生理特性極少有研究報(bào)道.本研究揭示菌株HDD1在生態(tài)學(xué)以及污水處理技術(shù)應(yīng)用中的重要意義.

　　1 材料與方法1.1 菌株分離與培養(yǎng)條件

　　活性污泥來源于實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行的污水處理生物反應(yīng)器.分離培養(yǎng)基包括以下物質(zhì)(g·L-1)：Na2S·9H2O，1.5;CH3COONa，0.387 5;KNO3，0.757 5;NH4Cl，1.0;KH2PO4，1.8;Na2HPO4·12H2O，3.0;MgSO4·7H2O，0.1;Agar，1.5.培養(yǎng)基滅菌后加入過濾滅菌的微量元素液.采用亨蓋特厭氧培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合稀釋滅絕法進(jìn)行菌株的分離和純化.活性污泥經(jīng)過梯度稀釋以后，接種到含有固體培養(yǎng)基的厭氧管中.在30℃條件下靜置培養(yǎng)7 d后，單克隆被接種到液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng).液體培養(yǎng)基經(jīng)過煮沸和充入氬氣達(dá)到厭氧條件，加入L-半胱氨酸(0.5 g·L-1)和1 mL濃度為0.2%的刃天青作為除氧劑和指示劑.通過在固-液分離培養(yǎng)基中反復(fù)轉(zhuǎn)接得到細(xì)菌培養(yǎng)物.通過顯微鏡觀察和16S rRNA基因測序技術(shù)檢測其是否為純培養(yǎng).

　　1.2 菌株鑒定

　　采用Bacterial DNA Mini Kit (TianGen，中國)提取細(xì)菌基因組DNA.提取的基因組DNA經(jīng)分光光度計(jì)(Nanodrop 2000，Thermo，美國)定量后作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板.采用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物F27(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和R1492(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng).反應(yīng)體系(50 μL)包括Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (25 μL)(NEB，美國)，濃度為20 μmol·L-1的上下游引物(2 μL)，20 ng DNA模板(1 μL)和蒸餾水(22 μL).采用GeneAmp PCR system (9700，ABI，美國)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，具體步驟設(shè)置如下：94℃起始變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán).擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序后，用BLAST-N程序和原核生物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析.利用MEGA 5.0軟件包，采用鄰位相連算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)經(jīng)過1 000次引導(dǎo)重復(fù)取樣檢驗(yàn).

　　1.3 生理學(xué)和化學(xué)分析

　　細(xì)菌經(jīng)離心收集后，用磷酸鹽緩沖液清洗3次，用2.5%戊二醛固定30min.用30%、50%、70%、90%、100%的乙醇脫水后，以飽和叔丁醇做介質(zhì)進(jìn)行真空干燥.利用掃描電子顯微鏡(Quanta 200 FEG，F(xiàn)EI，美國)觀察細(xì)胞形態(tài).利用生化試劑條(API 20NE，BioMérieux，法國)檢測菌株的生理特征.細(xì)胞經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)革蘭氏染色后，用氫氧化鉀消散法復(fù)檢[25].菌體蛋白濃度測定采用Bradford Protein Assay Kit (Takara，日本)的標(biāo)準(zhǔn)方法.CH3COO-、NO3-、NO2-、SO42-和S2O32-的濃度由離子色譜(ICS-90A，DIONEX，美國)測定.S2-的測定采用標(biāo)準(zhǔn)亞甲基藍(lán)分光光度法.利用能量散射譜儀(EDAX，美國)測定單質(zhì)硫及其含量.菌株的16S rRNA基因序列的GenBank登錄號為KX242545.

　　2 結(jié)果與分析2.1 菌株的分離與鑒定

　　經(jīng)過5輪固-液分離培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接，得到菌株HDD1.在顯微鏡視野下，細(xì)菌的形態(tài)呈統(tǒng)一的桿狀;16S rRNA基因測序結(jié)果中不存在噪聲信號，這表明菌株HDD1為純培養(yǎng).提交長度為1 397bp的16S rRNA基因序列到數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示HDD1與Thauera aminoaromatica S2的相似度最高，達(dá)到98.7%.進(jìn)化樹結(jié)果顯示HDD1在Thauera屬中形成一個(gè)單源的進(jìn)化枝，并與Thauera humireducens和Thauera terpenica形成一個(gè)進(jìn)化群(圖 1).用最大似然算法對系統(tǒng)進(jìn)化樹驗(yàn)證，得到相同結(jié)果.這些結(jié)果表明菌株HDD1可能是Thauera屬的一個(gè)新種，但是還需多相分類結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證.

圖 1 鄰位相連法構(gòu)建16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

　　2.2 菌株的生理特性

　　菌株HDD1革蘭氏染色呈陰性，細(xì)胞呈桿狀(圖 2).反硝化作用、吲哚反應(yīng)和有機(jī)酸同化作用呈陽性;糖類水解酸化反應(yīng)呈陰性(表 1).通常Thauera屬的各個(gè)種是一類兼性厭氧，專性進(jìn)行呼吸作用的細(xì)菌.它們能夠利用氧氣、氮氧化物作為電子受體，在好氧呼吸和反硝化作用之間轉(zhuǎn)化代謝狀態(tài).有些種在厭氧條件下可以還原硒酸鹽.很多種能夠利用有機(jī)酸、氨基酸、芳香和脂肪類化合物進(jìn)行生長.它們通常在污水處理廠、江河、池塘沉積物等被污染的地區(qū)被發(fā)現(xiàn).菌株HDD1的生理特征結(jié)果和伯杰氏系統(tǒng)微生物學(xué)手冊中Thauera屬的描述相同.

圖 2 菌株HDD1掃描電子顯微鏡圖像

　　表 1 菌株HDD1的生理學(xué)特性

　　2.3 菌株的代謝特性

　　菌株HDD1在厭氧條件下利用硝酸鹽作為電子受體氧化乙酸鹽和硫化物.在15 h之內(nèi)，CH3COO-基本被完全代謝，其濃度由300 mg·L-1下降到20 mg·L-1，菌體蛋白濃度由1.5 μg·mL-1上升到11 μg·mL-1[圖 3(a)]，生物量有所增加;NO3-濃度由487 mg·L-1下降到38 mg·L-1，NO2-在第15~20 h之間有短暫的積累，最高濃度為67.7 mg·L-1 [圖 3(b)];濃度為200 mg·L-1的S2-被完全代謝，S2O32-(18.4~36.2 mg·L-1)和SO42-(85.5~127.8 mg·L-1)的濃度略有上升[圖 3(c)].S2O32-和SO42-的背景值可能是由于在滅菌過程中發(fā)生輕微的氧化導(dǎo)致的.在0~5 h，CH3COO-濃度快速地由300 mg·L-1下降到128 mg·L-1，菌體蛋白濃度由1.5 μg·mL-1上升到5.7 μg·mL-1.在代謝反應(yīng)初期，活化細(xì)菌直接進(jìn)入對數(shù)生長期，生物量快速增加，CH3COO-濃度相應(yīng)地快速下降.在此階段，NO3-(487~283 mg·L-1)作為電子受體并沒有相應(yīng)地大幅減少.這是由于在對數(shù)生長期，大部分CH3COO-通過同化作用直接合成細(xì)胞物質(zhì)，只有少部分通過與NO3-耦合進(jìn)行呼吸作用.進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期后，細(xì)菌同化作用速率減小，需要產(chǎn)生大量能量維持細(xì)胞的生命活動(dòng).CH3COO-和S2-作為電子供體耦合NO3-進(jìn)行呼吸作用，大部分NO3-(283~38 mg·L-1)被代謝消耗.為了限制S2-過度氧化成S2O32-和SO42-，增加單質(zhì)硫的產(chǎn)量，電子受體NO3-濃度(487 mg·L-1)的初始設(shè)置較低.它也是工藝實(shí)際運(yùn)行過程中一個(gè)重要的參數(shù)，根據(jù)進(jìn)水COD含量和活性污泥狀態(tài)而進(jìn)行調(diào)整.隨著硫化物被逐漸氧化，所形成的單質(zhì)硫逐漸聚集成為直徑不同的顆粒[圖 4(a)].這些顆粒主要是由C、O、S和P等元素組成.其中S元素占總含量的20%;由于樣品中存在菌體等有機(jī)物，C元素占總量的68.6%;由于培養(yǎng)基中存在磷酸鹽等物質(zhì)，O元素和P元素分別占總含量的9.2%和2.1%[圖 4(b)].由于S2O32-和SO42-含量很低，根據(jù)化學(xué)反應(yīng)元素平衡原理，硫化物氧化的主要產(chǎn)物為單質(zhì)硫.硫酸鹽被還原成硫化物，硫化物再被氧化，是硫元素生物地球化學(xué)循環(huán)中重要的過程.這個(gè)過程涉及到多種復(fù)雜的反應(yīng)、硫細(xì)菌和酶.無色硫細(xì)菌分為4個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化世系，3個(gè)屬于細(xì)菌域，1個(gè)屬于古細(xì)菌域.多數(shù)的無色硫細(xì)菌屬于Proteobacteria門的Gammaproteobacteria綱.根據(jù)碳源和能量代謝方式，無色硫細(xì)菌可以分為不同的生理類型，包括：專性化能無機(jī)營養(yǎng)型、兼性化能無機(jī)營養(yǎng)型、化能無機(jī)異養(yǎng)型和化能有機(jī)異養(yǎng)型.化能無機(jī)異養(yǎng)型是指能夠利用還原性含硫化合物作為能量來源，但是不能固定二氧化碳的細(xì)菌.根據(jù)生理學(xué)特性，菌株HDD1不能利用光能，且只能利用乙酸鹽等有機(jī)物作為碳源，所以它屬于化能異養(yǎng)型微生物.在氧化硫化物過程中其是否獲得能量還需進(jìn)一步驗(yàn)證.原位檢測技術(shù)結(jié)果顯示Thauera屬在污水處理系統(tǒng)中是一類活躍的反硝化細(xì)菌，但是很少有研究報(bào)道它們的硫氧化功能.微生物群落分析表明Thauera屬在反應(yīng)器的生態(tài)系統(tǒng)中具有很高的豐度，但是由于缺乏菌株的純培養(yǎng)，深入的生理學(xué)特征研究很難開展.在生理學(xué)研究中，菌株HDD1可以作為研究Thauera屬硫氧化功能的模式種為進(jìn)一步的研究提供基礎(chǔ);在生態(tài)學(xué)研究中，它的相關(guān)功能基因可以作為分子標(biāo)記，為搜索復(fù)雜群落中的功能微生物提供技術(shù)支撐.目前，造紙廠、煤氣廠和制藥廠等工業(yè)廢水都含有大量的硫化物.生物法短程氧化硫化物并回收單質(zhì)硫作為資源具備很多優(yōu)勢.首先，它是化學(xué)和化肥工業(yè)的原料.其次，和物理化學(xué)法相比，生物法更加節(jié)約能源和成本.分離并研究功能菌株的生理學(xué)特性是這項(xiàng)生物技術(shù)應(yīng)用的重要保障.在這項(xiàng)技術(shù)中，菌株HDD1和其他常見的硫氧化細(xì)菌，例如：Thiobacillus denitrificans和Paracoccus denitrificans起到關(guān)鍵作用并有待更深入地研究.具體參見污水寶商城資料或http://www.dongaorq.cn更多相關(guān)技術(shù)文檔。

圖 3 菌株HDD1的碳氮硫化合物代謝

(a)掃描電子顯微鏡圖像;(b)能量色散譜分析圖 4 菌株HDD1代謝產(chǎn)物分析

　　3 結(jié)論

　　在本研究中，從反應(yīng)器活性污泥中分離純化出1株細(xì)菌HDD1.基于16S rRNA基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，它與Thauera屬的物種具有親緣關(guān)系并形成一個(gè)單源的進(jìn)化枝.生理特征實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證表明菌株HDD1是Thauera屬的一個(gè)種.菌株HDD1能夠利用硝酸鹽作為電子受體同步氧化硫化物和乙酸鹽.在15 h之內(nèi)，濃度為300 mg·L-1的CH3COO-、200 mg·L-1的S2-和487 mg·L-1的NO3-被完全代謝去除.根據(jù)其特殊的生理特征，菌株HDD1可以同時(shí)應(yīng)用于處理含有碳、氮、硫系化合物的工業(yè)廢水及硫元素的資源化回收.