強化生物除磷(EBPR)是目前應用最為廣泛的生物除磷工藝.該工藝利用聚磷菌(PAO)在厭氧條件下將儲存于體內的聚磷酸鹽(Poly-P)水解獲取能量, 用以吸收水中的揮發性脂肪酸(VFA), 并以聚羥基烷酸酯(PHAs)的形式儲存在細胞內; 在好氧條件下PAO以儲存于細胞內的PHAs作為碳源和能源, 吸收水中的磷并將其合成為Poly-P進行細胞增殖, 最終通過排除富磷污泥達到污水除磷的目的.在EBPR系統中, 還存在與PAO代謝機制相似的聚糖菌(GAO), 在厭氧條件下GAO與PAO競爭基質(VFA), 但在好氧條件下并不攝取磷, 因此, 如何提高PAO的活性和強化其與GAO對基質的競爭能力是保證EBPR工藝穩定運行的重要內容.
有研究表明, 影響EBPR系統穩定運行的因素主要有碳源、pH、溫度、DO等, 其中, 溫度的影響一直存在爭議.一般認為, 當溫度低于20℃時, 有利于PAO的競爭, 從而提升EBPR系統的性能; 當溫度高于20℃時, GAO占據競爭優勢, 導致污泥中PAO的份額逐漸減少, 除磷效率逐漸降低, 甚至EBPR系統的崩潰.然而, 最新的研究表明, EBPR系統在高溫條件下仍可高效除磷. Freitas等在SBR中采用短期循環(厭氧20 min, 好氧10 min, 靜置1 min)實現了30℃高溫條件下EBPR的穩定運行. Winkler等利用PAO顆粒污泥與GAO顆粒污泥密度的差異, 通過排除污泥床上部密度較小的GAO, 在USB反應器內富集可以適應高溫的PAO, 在30℃條件下實現了較好的除磷效果. Ong等研究表明, 在28~32℃的條件下, 長期運行的EBPR反應器可以實現95%的磷的去除率, qPCR檢測結果表明污泥中的PAO為Accumulibacter的亞種Clade IIF.但是目前關于溫度對EBPR系統中PAO的活性以及與GAO關于基質的競爭能力的影響尚無定論, 因此需要開展相同試驗條件下不同溫度對PAO與GAO之間的競爭影響研究, 尤其是高溫條件下對其競爭過程的具體研究顯得更加重要.
為了更好地理解高溫條件下EBPR系統中PAOHT的活性及基質競爭的影響, 本研究以實驗室中30℃高溫條件下長期運行的具有較好除磷功能的SBR反應器中的污泥為對象, 結合FISH技術, 探討15~30℃(基于南方全年污水溫度范圍約為10~30℃)溫度條件下高溫聚磷菌(PAOHT)的釋磷、吸磷以及乙酸吸收速率, 以期為溫度變化幅度較大的地區和接收較高溫度工業廢水的生物除磷系統的穩定運行提供依據.
1 材料與方法1.1 污泥來源
試驗污泥取自實驗室30℃高溫條件下長期運行(430 d)的SBR反應器[15].該反應器采用A/O方式運行, 每天6個周期, 每個周期為4 h, 其中, 進水7 min, 厭氧1 h, 好氧2 h, 沉淀40 min, 排水10 min, 閑置3 min.控制水力停留時間(HRT)為8 h, 污泥停留時間(SRT)為8 d.反應器溫度一直維持在30℃.進水COD(乙酸)濃度為300 mg·L-1, 磷(PO43--P)濃度10 mg·L-1, 而出水磷(PO43--P)始終小于0.1 mg·L-1, 磷的去除率高達99%以上.反應器中的懸浮固體(SS)和揮發性懸浮固體(VSS)濃度分別穩定在2.36 g·L-1和1.63 g·L-1, 運行高效穩定.
1.2 活性污泥釋磷吸磷速率測定
活性污泥釋磷吸磷速率測定采用間歇試驗法.試驗裝置見圖 1.試驗開始前, 先采用經脫氧處理的自來水對污泥進行陶洗, 然后將其倒入反應瓶中, 加入配制好的基質溶液(與SBR反應器進水水質保持一致), 反應瓶底部置有磁力轉子保證完全混合狀態, 反應過程中的溫度利用水浴槽進行控制.在厭氧階段, 通入氮氣隔絕空氣, 確保反應瓶處于厭氧狀態; 在好氧階段, 以60 L·h-1的速率通入空氣, 保證混合液中的溶解氧(DO)大于2 mg·L-1.在不同反應時間點取樣, 測定相應的磷及乙酸濃度, 試驗結束時測定混合液的SS和VSS, 用于計算厭氧釋磷速率[以P/VSS計, mg·(g·h)-1, 下同]、好氧吸磷速率[以P/VSS計, mg·(g·h)-1, 下同]和乙酸吸收速率[以HAc/VSS計, mg·(g·h)-1, 下同].
1.氮氣瓶; 2.曝氣機; 3.進水管; 4.取樣管; 5.排氣管; 6.磁力攪拌器; 7.轉子; 8.反應瓶; 9.溫度計; 10.水浴槽
圖 1 間歇試驗裝置示意
1.3 分析方法
磷(PO43--P)采用鉬銻抗分光光度法; 懸浮固體(SS)和揮發性懸浮固體(VSS)采用重量法; 化學需氧量(COD)采用重鉻酸鉀法; pH采用玻璃電極法.揮發性脂肪酸(VFAs)采用氣相色譜法(型號：安捷倫6890N), 檢測器為氫火焰離子(FID)檢測器, 色譜柱型號為DB-FFAP.
1.4 FISH分析方法
樣品預處理：取好氧末污泥混合液離去上清液, 加入1 mL的1×PBS緩沖溶液重懸, 重復操作兩次后, 加入1 mL的4%的多聚甲醛溶液重懸, 置于4℃條件下固定2 h, 然后離去上清液, 加入1×PBS緩沖溶液離心, 重復3次, 以洗去多余的多聚甲醛溶液, 分別加入0.5 mL的1×PBS緩沖溶液和無水乙醇, 搖勻置于-20℃下保存.
脫水和雜交：將涂好的載玻片放置于培養箱中干燥, 干燥好的載玻片依次放于75%、95%、100%的乙醇溶液中脫水3 min, 取出后風干.將事先配好的雜交緩沖液和探針使用液以體積比8：1的比例混合, 避光, 涂于載玻片的樣品上, 將載玻片迅速移回到雜交管中, 于46℃條件下雜交2~4 h, 雜交完成后取出載玻片進行洗脫處理并立即風干封片.
樣品觀測及分析方法：采用激光共聚焦顯微鏡(德國萊卡SP8) 觀察樣品和圖像采集, 用Image-ProPlus 6.0軟件對所采集的圖像進行統計分析, 從而確定樣品中PAO、GAO和EUB所占比例.
有關熒光探針和雜交的詳細操作參見文獻.
2 結果與討論2.1 試驗污泥的活性
圖 2為試驗污泥在30℃下的活性測定結果.該污泥在厭氧段的最大釋磷速率為239.46 mg·(g·h)-1, 好氧段的最大吸磷速率為79.90 mg·(g·h)-1, 厭氧段的乙酸吸收速率為357.47 mg·(g·h)-1, 對應的吸收單位乙酸釋磷量(ΔP/ΔHAc)為0.628.說明該污泥中的聚磷菌在高溫下具有較好的釋磷、吸磷以及對基質的吸收能力.
圖 2 試驗污泥30℃時厭氧釋磷、乙酸吸收及好氧吸磷的變化
Brdjanovic等關于溫度對生物除磷的影響性研究表明, 在30℃時其污泥最大釋磷速率為68 mg·(g·h)-1, 好氧最大吸磷速率為57 mg·(g·h)-1, 乙酸吸收速率為180 mg·(g·h)-1, ΔP/ΔHAc為0.376.相較之下, 本研究的試驗污泥在30℃高溫條件下運行長達一年多, 有更好的釋磷和吸磷能力, 屬于已經適應高溫的PAO, ΔP/ΔHAc的值達到了0.628, 即每吸收1 mol的乙酸, 釋放0.628 mol的磷, 這也就進一步表明了PAO為試驗污泥中的優勢菌群, 且具有更強的基質競爭能力.
2.2 試驗污泥中聚磷菌及其份額
圖 3為利用目前普遍采用的PAOMIX探針對試驗活性污泥的FISH檢測結果.從中可見, 試驗污泥中的聚磷菌屬于Accumulibacter. He等采用宏基因分析對12個具有除磷功能的城市污水處理廠污泥種群結構進行測定, 結果表明Accumulibacter下存在5個亞種, 分別為clade Ⅰ、ⅡA、ⅡB、ⅡC和ⅡD, 不同的污水處理廠由于水質和運行條件不同存在著不同種屬的PAO. Ong等[14]研究了高溫條件下(28~32℃)以乙酸為基質的EBPR系統除磷效率, 結果表明, 即使溫度高達32℃, EBPR仍獲得了較好的處理效果, 利用qPCR技術分析得出, 污泥中聚磷菌的優勢菌屬為Accumulibacter的亞種clade IIF.而Peterson等發現Accumulibacter的不同亞種具有不同的生態生理學特性.由此說明本系統出現的適應高溫的聚磷菌為Accumulibacter的亞種.
圖 3 試驗活性污泥中微生物的群落結構
表 1為試驗活性污泥中PAOs和GAOs份額以及與Ong等結果的比較.從中可見, 試驗污泥中PAO份額高達86%, 遠高于Ong等培養的污泥, 說明本研究試驗污泥在高溫條件下具備更好的增殖和基質競爭能力.以上結果說明, 試驗污泥中的優勢菌為PAO, 這與活性試驗結果相印證, 進一步證明了試驗污泥具有較好的釋磷和吸磷能力, 為溫度試驗奠定了良好的基礎.
表 1 試驗活性污泥與Ong等采用的污泥中PAOs和GAOs份額比較
2.3 溫度對活性的影響
不同溫度下污泥的厭氧釋磷和好氧吸磷試驗結果見圖 4, 相應的反應速率見表 2.從數據可知, 隨著溫度的升高, PAOHT的厭氧釋磷和好氧吸磷速率逐漸增大, 當溫度為15、20、23、25、27、30℃時, 厭氧段最大釋磷速率分別為76.50、95.86、150.69、150.78、171.74、239.46 mg·(g·h)-1, 好氧段最大吸磷速率分別為27.36、44.72、49.61、51.52、61.73、79.90 mg·(g·h)-1.現有研究表明, 常溫PAO在溫度低于20℃時, 厭氧釋磷和好氧吸磷速率隨溫度的增加而增大, 高于20℃時, 反應速率不再隨溫度的增加而變化.而本研究中的高溫聚磷菌(PAOHT)在15~30℃溫度范圍內, 活性隨溫度的升高而增強.
圖 4 不同溫度下試驗污泥的厭氧釋磷和好氧吸磷歷時變化
表 2 不同溫度下的釋磷吸磷速率
在15~30℃溫度范圍內, PAOHT對乙酸的最大吸收速率分別為176.70、233.14、241.59、247.22、313.37、357.47 mg·(g·h)-1, 乙酸的最大吸收速率隨溫度的升高而增大.該試驗結果與Brdjanovic等關于溫度對最大乙酸利用速率的影響所得出的結論有所不同, 其認為當溫度超過20℃時, PAO和GAO對乙酸的最大吸收速率不再隨溫度變化, 其值為常數, 并且Lopez-Vazquez等研究表明當溫度為30℃時, PAO在厭氧狀態下對乙酸的最大吸收速率為0.20 mol·(mol·h)-1, 而本研究的PAOHT在厭氧狀態下對乙酸的最大吸收速率為0.357 g·(g·h)-1, 其中VSS(以C5H7NO2計)的摩爾質量為113 g·mol-1, 對應的碳摩爾質量為22.6 g·mol-1, 同理可得乙酸的摩爾質量為30 g·mol-1, 則對應的以碳摩爾質量計量的最大乙酸利用速率為0.269 mol·(mol·h)-1, 結果高于Lopez-Vazquez等得出的數據, 這也就說明了本系統培養的PAOHT對乙酸具有較高的吸收和競爭能力.
2.4 溫度系數的確定
溫度對化學反應速率常數的影響常用簡化的阿倫尼烏斯公式進行描述, 具體表達式為：
式中, qi為反應速率(i=1, 2, 3, 分別代表厭氧釋磷、好氧吸磷和乙酸吸收速率); qi(30)為30℃時的反應速率; T為水溫(℃); θi為溫度系數.
利用式(1) 對15~30℃溫度范圍內相應的反應速率進行擬合(圖 5~6), 得出PAOHT的厭氧釋磷速率、好氧吸磷速率以及乙酸吸收速率的溫度系數分別為1.08、1.07和1.05. Brdjanovic等利用20℃下富集培養的除磷污泥, 對其在不同溫度條件下的變化特性進行了擬合, 厭氧釋磷和好氧吸磷速率的溫度系數分別為1.078(5℃＜T＜20℃)和1.057(5℃＜T＜30℃). Lopez-Vazquez等對PAO的代謝研究得出, 當溫度小于20℃時, 不同溫度下PAO對乙酸吸收速率的溫度系數為1.095.而本研究在15~30℃溫度范圍內, 無論是厭氧釋磷、好氧吸磷還是乙酸的吸收速率, 其數值都隨溫度的升高而升高, 故而溫度系數的確定都是以30℃為基準進行擬合的, 與前人研究得出的結果相比較, 兩者數值相差較小.具體參見 圖 5 不同溫度下試驗污泥厭氧釋磷速率和好氧吸磷速率 圖 6 不同溫度下試驗污泥乙酸吸收速率 3 結論 (1) 反應器長期在30℃高溫條件下運行時, 磷的去除率高達99%以上, 此時污泥的釋磷、吸磷速率分別為239.46 mg·(g·h)-1、79.90 mg·(g·h)-1, ΔP/ΔHAc為0.628, PAO占總細菌的比例高達86%±1%, 而GAO的比例僅占5%左右, 反應器運行高效穩定, 出現了適應高溫的PAOHT. (2) 在15~30℃溫度范圍內, PAOHT的活性以其對基質的競爭能力隨溫度升高不斷增強, 當溫度為30℃時, PAOHT的最大乙酸利用速率高于前人所研究的數值, 其值約為0.269 mmol·(mmol·h)-1. (3) 利用簡化的阿倫尼烏斯公式對15~30℃溫度范圍內PAOHT的反應速率進行擬合, 得出厭氧釋磷速率、好氧吸磷速率和乙酸的吸收速率的溫度系數分別為1.08、1.07和1.05.
