抗生素是一類在低濃度下就能選擇性抑制某些生物生命活動的微生物次級代謝產物及其化學合成或半合成的衍生物(衛生學大辭典).基于其良好的抑菌效果及生長促進作用, 該類物質在醫療、畜牧和水產養殖等行業得到了廣泛使用.但大量甚至過量使用及低代謝率也導致了其在環境中較高的檢出率.雖然環境中該類物質的檢出濃度一般為ng~μg級別, 但由此誘導產生的抗生素抗性基因及伴隨的基因水平轉移很可能使包括致病菌在內的其他微生物獲得抗生素抗性, 最終對人體健康和生態安全造成威脅.研究顯示, 抗生素的大量輸入還可使環境中原有的微生物群落發生轉變, 而微生物群落是生物地球化學循環的重要組成部分, 其結構和功能的改變很可能對原有物質循環過程產生影響.氟喹諾酮是應用十分廣泛的一類廣譜抗生素, 通過抑制細菌體內的DNA復制達到抑菌目的, 對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有較好抑制效果.良好的穩定性使其在沉積物、水生植物、河流湖泊、土壤中均呈現較高的檢出率和濃度.
人工濕地是一種模擬自然系統并經過人工強化的凈水系統, 因成本低、管理容易而獲得了廣泛的關注和應用, 其在抗生素去除方面同樣表現良好. Liu等分別采用火山巖和沸石作為基質的人工濕地去除獸用抗生素和抗性基因.結果顯示, 環丙沙星的去除率達到78%以上, 且以沸石作為基質的濕地表現更佳. Huang等發現垂直流人工濕地可以去除養豬廢水中69%~99%的土霉素、四環素和金霉素且土壤中抗生素的含量與總氮和氨氮的去除效果存在負相關關系.但人工濕地對抗生素的去除效果還會受到濕地基質類型、植物種類、pH、溶解氧和溫度等環境因素的影響.目前, 大多研究關注了濕地對抗生素及抗性基因的去除、散播和影響因素等, 對濕地中微生物群落在氟喹諾酮壓力下的變化關注不足.
目前, 關于抗生素對微生物群落的影響已有不少研究, 但大多研究采用的是單一抗生素或不同種類抗生素的混合物, 針對同類多種抗生素的研究較為欠缺.氟喹諾酮具有良好的吸附性, 但其混合物在吸附過程中會產生競爭效應從而減小單個氟喹諾酮藥物的Kd值, 進而影響到單個氟喹諾酮藥物的吸附性.因此, 氟喹諾酮混合物對微生物產生的影響可能與單個氟喹諾酮藥物存在差異.本實驗選擇環境中檢出率較高的3種氟喹諾酮：氧氟沙星(ofloxacin, OFL)、諾氟沙星(norfloxacin, NOR)和環丙沙星(ciprofloxacin, CIP)的混合物作為添加物, 研究了人工濕地凈化能力及微生物群落在其壓力下的變化, 以揭示該類抗生素對人工濕地的潛在影響.
1 材料與方法1.1 實驗裝置及運行
本實驗中采用由PVC制成的圓柱形人工濕地實驗裝置(如圖 1), 裝置直徑為40 cm, 高為80 cm.柱體自下而上依次填充卵石(高約3 cm)、陶粒(粒徑為5~8 mm和3~6 mm約1:1混合; 高12 cm)、沸石(粒徑為3~6 mm; 高30 cm)、土壤與蛭石的混合物(體積比約1:1混合, 高15 cm).裝置最上層種植兩株美人蕉, 外圍有鋁箔包裹.
圖 1
實驗進水采用人工配水, 每10.0 L水中含有4.40 g葡萄糖, 0.77 g氯化銨, 0.24 g磷酸二氫鉀, 0.14 g二水氯化鈣, 0.20 g七水硫酸鎂, 0.45 g六水三氯化鐵, 4.00 g碳酸氫鈉, 由蠕動泵實現連續進水, 每日進水量為9.2 L, 水力停留時間約為39 h.裝置前期運行3個月以構建穩定的系統及微生物體系, 之后開始在進水中添加抗生素, 使3種抗生素在進水中的濃度分別為氧氟沙星100 μg·L-1、諾氟沙星50 μg·L-1、環丙沙星50 μg·L-1.氧氟沙星(純度99%)、諾氟沙星(純度99%)、環丙沙星(純度≥98%)均購買于上海源葉生物科技有限公司, 配水所用其他試劑均為分析純.抗生素儲備液用含有0.2%乙酸的去離子水于棕色瓶中分別配置并存于冰箱中, 每月更新一次.進水中添加抗生素的時間為2017年4~6月.
1.2 水質指標測定
本實驗中, 進出水的COD、氨氮、TP濃度每3 d測定一次, COD濃度測定采用快速消解分光光度法, 氨氮濃度采用納氏試劑分光光度法, TP濃度采用鉬酸銨分光光度法.出水抗生素濃度每周測定一次, 參考文獻[25]采用UPLC-MS/MS完成.
1.3 16S rRNA測序分析
在未添加抗生素前(C組)和添加抗生素兩個月后(T組)分別取3份最上層基質進行16S rRNA測序分析, 每次取樣間隔1 d, 取樣深度為表面下4~5 cm.樣品中的DNA提取采用Fast DNA SPIN Kit For Soil(MP Biotechnology)試劑盒完成.采用引物338F和806R對V3-V4可變區進行PCR擴增, 反應條件為95℃預變性3 min, 95℃變性0.5 min, 55℃退火0.5 min, 72℃延伸0.5 min, 循環27次, 并在72℃最終延伸5 min.擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行質量檢測, 然后在Illumina MiSeq平臺完成測序分析.測序由美吉生物醫藥公司完成.測序結果按照97%的相似度進行OTU分類, 采用RDP classfier進行分類學統計, 然后計算每組樣本的Shannon指數、Shannoneven指數和Chao1指數.采用非度量多維尺度分析(non-metric multidimensional scaling, NMDS)判斷兩組樣本整體差異.顯著性水平為P < 0.05.
2 結果與討論2.1 人工濕地運行效果
系統進出水COD、氨氮、TP的濃度變化如圖 2所示.整個實驗過程中, 氨氮去除率始終大于95.40%, 未受到抗生素的明顯影響. COD和TP的去除效果變化較為明顯.未添加抗生素階段, COD去除率大于97.88%;抗生素添加初期, 出水COD濃度未呈現較大變化, 但從添加后的第16 d開始, 出水COD濃度開始逐漸上升, 直至第34 d達到最大值120.4 mg·L-1, 去除率為70.94%.之后, 出水COD濃度逐漸下降直至實驗末期.對于TP, 未添加抗生素期間, TP去除率大于84.52%;添加抗生素后, 出水TP濃度呈現上升趨勢并伴隨較大幅度波動.綜上, 氟喹諾酮對人工濕地的凈化性能產生了負面影響且主要體現在COD和TP去除方面.本實驗中, 除有4周的出水中有抗生素檢出外, 其余出水中抗生素的濃度均低于檢出限, 因此, 垂直流人工濕地對氟喹諾酮具有良好的去除效果.
圖 2
類似結果已有報道. Amorim等[26]研究氧氟沙星、諾氟沙星和環丙沙星對好氧顆粒污泥SBR系統的影響時發現當進水中添加抗生素后, 出水COD濃度和TP濃度呈現上升趨勢, 而氨氮濃度未受明顯影響. SBR添加氧氟沙星后, COD、氨氮和TP的去除效果與本實驗相似. Zheng等發現當諾氟沙星濃度為0~6 mg·L-1時, SBR對COD和氨氮的去除效果保持穩定, 當諾氟沙星濃度上升至35 mg·L-1時, COD和氨氮去除率由90.7%和94.1%下降至76.5%和73.6%.可見, 氟喹諾酮會對工藝出水水質產生消極影響.氟喹諾酮具有良好的吸附性, 可通過靜電作用力、氫鍵、疏水力等被有機質、無機礦物顆粒強烈吸附, 在人工濕地、污水處理廠, 吸附都是該類抗生素的重要去除途徑.本實驗中, 土蛭混合層和其中的有機質均具備良好的吸附性, 因此系統展現了良好的抗生素凈化能力.同時, 基質對氟喹諾酮的強烈吸附也對微生物產生了一定的保護作用, 避免了抗生素添加初期出水水質的劇烈變化.隨著添加時間的延長, 系統中抗生素的積累量逐漸上升, 其負面影響也逐漸顯現, 與之伴隨的便是出水COD濃度和TP濃度的上升.盡管氟喹諾酮是一類廣譜抗生素, 但微生物亦可通過外排泵機制、改變細胞內的抗生素敏感部位、使抗生素失活等方式增加自身對抗生素的耐受性和適應性.值得注意的是, 某些抗生素還可以作為微生物代謝的碳源.另外, 微生物群落還可通過調整內部結構逐步適應抗生素的存在.這些原因都可能使系統的凈化性能在抗生素添加后期逐步恢復.因此, 雖然氟喹諾酮會對人工濕地的凈化能力產生影響, 但其可以隨著時間的延長逐步恢復.
2.2 微生物群落變化2.2.1 微生物群落概況
測序后得到各分類水平的微生物數目如圖 3所示, 樣本的Shannon指數、Shannoneven指數、Chao1指數如表 1所示.對比兩組結果發現, T組樣本的Chao1指數顯著高于C組, 但Shannon指數和Shannoneven指數變化并不顯著(P>0.05)(表 1). NMDS分析結果(如圖 4)顯示, 不同組樣本點間距離較大, 同組樣本點間距離較小, 兩組樣本點呈現明顯分離趨勢.可見, 氟喹諾酮確實使系統中的微生物群落產生了轉變.
圖 3
表 1 α多樣性指數1)
圖 4
2.2.2 門水平微生物群落變化
抗生素添加前后各樣本的門水平微生物群落構成如圖 5所示, 其中C組的優勢種群為Proteobacteria (44.90%)、Actinobacteria (24.61%)、Chloroflexi (7.37%)、Acidobacteria (7.93%)、Bacteroidetes (4.37%), T組的優勢種群為Proteobacteria (34.12%)、Actinobacteria (21.82%)、Firmicutes (10.55%)、Acidobacteria (8.31%)、Chloroflexi (7.99%)和Bacteroidetes (5.25%). Proteobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi、Acidobacteria與Bacteroidetes始終為優勢種群, 其總豐度在C組和T組中分別占比89.17%、77.49%, 這與其他研究中的結果類似.具體聯系污水寶或參見http://www.dongaorq.cn更多相關技術文檔。
圖 5
從圖 5中可看出, Proteobacteria的相對豐度明顯減少而Firmicutes的相對豐度明顯上升. Kim等研究恩諾沙星對人體腸道微生物群落影響時發現, 隨著恩諾沙星濃度的增加, Proteobacteria和Bacteroidetes的比例逐漸減小, 而Firmicutes所占比例逐漸增加.本實驗所用的諾氟沙星和環丙沙星為恩諾沙星的生物降解中間體. Xiong等發現糞肥中的氟喹諾酮會對土壤中的Proteobacteria產生抑制, 且施用了含氟喹諾酮肥料的土壤中Firmicutes的豐度要高于對照組. Yan等發現氧氟沙星、磺胺甲唑可使人工濕地中Firmicutes的相對豐度隨抗生素濃度逐漸增加.可見, 氟喹諾酮對Proteobacteria有抑制作用而對Firmicutes有促進作用.在眾多水處理工藝中, Proteobacteria均是發揮重要功能的優勢種群, 與系統凈化能力密切相關, 因此本實驗中COD和TP凈化效果的下降很可能與Proteobacteria相對豐度的明顯下降有關.
2.2.3 綱水平微生物群落變化
C組和T組各樣本綱水平的微生物群落構成如圖 6所示, 其中C組的優勢種群是Actinobacteria (24.61%)、β-Proteobacteria (17.03%)、α-Proteobacteria (11.69%)、δ-Proteobacteria (8.84%)、Acidobacteria (7.93%)、γ-Proteobacteria (7.05%), T組的優勢種群是Actinobacteria (21.82%)、α-Proteobacteria (12.53%)、β-Proteobacteria (8.36%)、Acidobacteria (8.31%)、δ-Proteobacteria (7.52%)和γ-Proteobacteria (5.65%).比較兩組的構成發現, 相對豐度大于5%的優勢種群中, β-Proteobacteria和γ-Proteobacteria的相對豐度變化較大(如圖 6).有研究顯示, 廢水中的四環素類、磺胺類和喹諾酮類抗生素與β-Proteobacteria和γ-Proteobacteria之間存在負相關關系.另外, 當同樣具有苯環結構的三氯生進入到水-沉積物系統中時, β-Proteobacteria的相對豐度也發生了大幅下降.可見, β-Proteobacteria對該類物質的出現比較敏感. β-Proteobacteria是Proteobacteria的重要組成部分, 其中含有大量可以實現有機物降解、脫氮除磷等功能的微生物, 因此其豐度的減小可能與出水COD濃度和TP濃度上升之間存在相關關系.與β-Proteobacteria的變化趨勢相反, Clostridia、Bacilli、Bacteroidia的相對豐度呈現了比較明顯的增加(如圖 6), 分別從C組的0.50%、1.85%、0.10%增加到了T組的4.21%、4.64%和2.56%.有報道稱, Clostridia和Bacilli在盤尼西林和土霉素污染環境中呈現出很高的豐度, 且四環素類和磺胺類對Clostridia有選擇性優勢.因此, Clostridia和Bacilli可能與抗生素污染環境之間存在潛在聯系. Liao等還發現Bacteroidia中含有能夠降解環丙沙星的菌種.可見, Clostridia、Bacilli和Bacteroidia對氟喹諾酮具有較強適應性.綜上, 氟喹諾酮對Clostridia、Bacilli和Bacteroidia具有選擇性優勢, 對β-Proteobacteria具有選擇性抑制作用.
圖 6
2.2.4 屬水平微生物群落變化
本實驗中, C組和T組分別檢測到585個屬和670個屬, 其中551個屬為兩組共有, 其中42.65%、15.79%、9.44%、7.26%、5.26%的屬分別包含于Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Chloroflexi.在屬的分類水平上, C組的優勢種群為Dechloromonas (8.56%)、Pseudarthrobacter (5.10%)、Pseudomonas(3.37%)、Skermanella (2.28%)、Nitrospira (2.03%), T組的優勢種群為Trichococcus (3.84%)、Tessaracoccus (3.83%)、Dechloromonas (3.16%)、Pseudomonas (3.15%)、Desulfovibrio (2.06%).兩組樣本中豐度前15位屬的Heatmap圖如圖 7所示, 從中可看出Dechloromonas(屬于Proteobacteria)、Pseudarthrobacter(屬于Actinobacteria)的豐度下降明顯, 而Trichococcus(屬于Firmicutes)、Tessaracoccus(屬于Actinobacteria)、Desulfovibrio(屬于Proteobacteria)的豐度則出現明顯上升, 因此群落中不同種類的微生物在氟喹諾酮壓力下呈現了不同的豐度變化趨勢.其中, Dechloromonas可以還原高氯酸鹽, 是生物水處理系統中常見的聚磷菌, 因此該屬豐度的減小可能與出水TP濃度上升有關.另一個豐度減小的屬Pseudarthrobacter中的部分菌種(如Pseudarthrobacter sulfonivorans strain Ar51)可在低溫下降解原油和多苯化合物, 但本實驗期間氣溫較高, 可能抑制了其對復雜有機物的適應能力. Trichococcus具有良好的抗生素適應性, Trichococcus flocculiformi更是在各類抗生素環境中廣泛存在的一類微生物, 因此該屬在氟喹諾酮的選擇性壓力下呈現了更高的豐度. Tessaracoccus是一類兼性厭氧(除T. lubricantis外)的革蘭氏陽性菌, 在活性污泥、海底沉積物、被油污染的含鹽土中均有被分離出來的菌株, 因此, 該屬對環境良好的適應能力使其未受到抗生素的負面影響. Desulfovibrio可以將有機物或者分子氫的氧化與硫酸鹽還原過程聯系起來生成硫化氫并從中獲得能量, 是嚴格厭氧菌.有報道顯示, 包括Desulfovibrio在內的多種硫酸鹽還原菌都可以受到環丙沙星的促進作用, 這與本實驗中的結果類似. Nitrosomonas和Nitrosospira是重要的氨氧化菌, 其豐度在前后兩組未出現較大變化, 這與出水氨氮濃度一直保持穩定狀態的結果相一致.
圖 7
3 結論
(1) 氟喹諾酮會對人工濕地凈化性能產生負面影響, 主要體現在對COD和TP的去除方面, 但其可以隨著時間的延長逐步恢復; 同時垂直流人工濕地對氟喹諾酮具有良好的凈化效果.
(2) 氟喹諾酮使人工濕地中的微生物群落發生了轉變. Shannon指數和Shannoneven指數無顯著變化, Chao1指數顯著增加; 群落結構也發生了明顯轉變.(來源：環境科學 作者：李新慧)
