厭氧氨氧化(anaerobicammoniumoxidation，ANAMMOX)相較于傳統硝化反硝化工藝，具有不消耗有機碳源、污泥產率低和能源消耗低等特點，作為一種應用前景廣闊的生物脫氮技術，吸引了大量國內外學者的關注。然而在低總氮濃度條件下厭氧氨氧化脫氮效率低的問題限制了其在污水處理中的應用。呂愷等的研究采用一段式亞硝化厭氧氨氧化SMBBR處理濃度為100mg·L-1的氨氮廢水，總氮去除率(NRE)為(51.58±6.80)%。Akaboci等的研究采用PNA-SBR反應器處理75mg·L-1的氨氮廢水，結果表明，在進水總氮負荷(NLR)為(0.61±0.25)kg·(m3·d)-1的條件下，僅獲得(52.5±12.5)%的總氮去除率。此外在低氨氮濃度條件下游離氨(FA)和游離亞硝酸(FNA)濃度較低，對亞硝酸鹽氧化菌(NOB)的抑制減弱甚至消失，厭氧氨氧化菌(AnAOB)活性受到抑制，難以維持高效穩定脫氮。因此，提高AnAOB活性和系統穩定性有助于促進ANAMMOX工藝在低氨氮濃度條件下的實際應用。
Fe2+是含氮廢水最常見的金屬離子，也是微生物生長的必要營養元素。在ANAMMOX過程中，適宜濃度的Fe2+能夠促進AnAOB對鐵的積累和亞鐵血紅素c的合成，從而提高AnAOB活性和脫氮能力。張黎等的研究發現，當c(Fe2+)為0.085mmol·L-1時，樣品中亞鐵血紅素c達0.143μmol·mg-1，是同期對照反應器的2.04倍。Zhang等的試驗結果表明，低濃度的Fe2+(1~5mg·L-1)可以有效促進AnAOB活性，而高濃度Fe2+(10~30mg·L-1)則會不同程度地抑制ANAMMOX過程。相比于單級ANAMMOX系統，兩級ANAMMOX系統處理低氨氮廢水可以實現進一步脫氮從而獲得更高的總體脫氮效率。然而，關于Fe2+是否能促進低總氮濃度條件下的厭氧氨氧化脫氮效率鮮有報道，此研究對于推進厭氧氨氧化工藝的應用具有較大的科學價值和應用指導意義。
本研究考察了不同濃度Fe2+條件對串聯兩級ANAMMOX生物膜反應器在低總氮濃度下的脫氮性能，并探究不同濃度Fe2+對系統EPS、亞鐵血紅素c含量、AnAOB活性和微生物群落結構變化等影響情況，以期為利用Fe2+促進厭氧氨氧化菌活性以實現厭氧氨氧化生物膜系統在低總氮濃度下的高效穩定脫氮提供理論指導。
1、材料與方法
1.1 試驗裝置與運行條件
本試驗裝置如圖1所示。兩個ANAMMOX生物膜反應器(R1和R2)尺寸設計完全一樣，均由有機玻璃制成，長和寬均為30cm，高為70cm，持水高度為60cm，有效容積為54L。反應器采用溫控加熱棒將溫度控制在(31±2)℃，R1反應器和Fe2+進水瓶外部用黑色塑料包裹以避光。兩個反應器內都裝有纖維材質填料。本試驗過程R1出水和R2進水串聯運行，利用高度差使水流通過，氮素和Fe2+進水均通過蠕動泵進行調控。本試驗共分為兩個階段進行。第一個階段(第1~132d，包括啟動和負荷提升)通過縮短水力停留時間(HRT)的方式逐步提升NLR，探索反應器脫氮性能大小。第二個階段(第133~202d)為Fe2+影響試驗階段，此階段保持NLR不變，分別在進水ρ(Fe2+)為5、10和15mg·L-1的條件下考察Fe2+對兩級ANAMMOX生物膜系統脫氮性能的影響，每個濃度連續運行至少3周。
1.2 試驗用水與接種污泥
本試驗用水采用人工配水，NH4+-N(65mg·L-1)和NO2--N(85mg·L-1)分別用NH4Cl和NaNO2進行配置，采用NaHCO3作為堿度，濃度為400mg·L-1.其他組分包括：KH2PO4 68mg·L-1、MgSO4·7H2O150mg·L-1和CaCl2 68mg·L-1.微量元素按EDTA5g·L-1和FeSO4·7H2O5g·L-1配置，投加量為1mL·L-1.不同濃度Fe2+用FeSO4·7H2O提供，濃度按需配置。
接種污泥取自實驗室培養成熟的厭氧氨氧化污泥，混合液懸浮揮發性固體濃度為4240mg·L-1.
1.3 亞鐵濃度對AnAOB活性影響批次試驗
從運行穩定的ANAMMOX反應器取一定量污泥加入200mL血清瓶中，試驗前先用蒸餾水清洗3遍以去除雜質，分別向5個血清瓶中各加入50mL均質污泥和150mL蒸餾水，然后以純度99.9%以上的N2曝氣30min以排除氧氣影響，加入ρ(NH4+-N)和ρ(NO2--N)均分別為21.55mg·L-1和28.45mg·L-1， ρ(Fe2+)分別按照0、5、10、15和20mg·L-1添加。為保證系統密閉性，瓶口用橡膠塞密封，瓶身用黑布包裹。血清瓶底部配有磁力攪拌裝置，轉速為140r·min-1.在常溫條件下每個Fe2+濃度下做3組平行脫氮試驗，用注射器間隔取樣分析NH4+-N、NO2--N和NO3--N濃度變化，試驗結束后取50mL混合液測定MLVSS并計算比厭氧氨氧化活性(SAA)。
1.4 胞外聚合物(EPS)的提取與測定方法
EPS的提取與測定參照文獻來進行。反應運行到132、159、180和202d時，分別在R1和R2反應器中取出污泥樣品5mL，在8000r·min-1條件下離心15min，棄去上清液，加入10mL的PBS緩沖液，然后在超聲波(40kHz，120W)條件下超聲3min，再將混合物置于80℃水浴加熱30min，最后在8000r·min-1條件下快速離心15min，取出上清液通過0.45μm微孔濾膜過濾后即可完成EPS的提取。對上述提取的EPS進行蛋白質(PN)和多糖(PS)含量的測定。PN采用修正的Folin-Lowry法測定，PS采用蒽酮比色法測定。
1.5 亞鐵血紅素c的測定
亞鐵血紅素c的提取與測定參照文獻來進行。反應運行到132、159、180和202d時，分別在R1和R2反應器中取出污泥樣品5mL，將污泥懸浮于10mLPBS緩沖液，然后在冰浴中超聲污泥混合液5min，最后在12000r·min-1，4℃下離心15min，過濾溶液后，用Pyridine-NaOH分光光度法在紫外分光光度計上測定。
1.6 分析與計算方法
NH4+-N、NO2--N和NO3--N均采用國家標準方法測定;pH值采用PHS-3C型pH計測定;溶解氧(DO)和溫度采用HQ-30d便攜式溶氧儀;MLVSS采用重量法測定。單因素方差分析(ANOVA，置信水平95%)基于SPSS25.0軟件完成。NLR、總氮去除負荷(NRR)和NRE參照文獻的公式計算得到。SAA參照文獻計算得到。
1.7 高通量測序
采用高通量測序方法分析不同運行階段條件下反應器生物膜樣品中微生物群落結構和變化情況。測試方法如下：取適量污泥樣品，用PowersoilDNA試劑盒進行DNA提取。采用細菌通用引物對污泥樣品進行16SrRNA擴增，引物序列和擴增體系參照文獻，引物為16SrRNAV4高變區通用引物，PCR擴增片段大小為480bp。最后通過Novasep-PE250測序平臺對樣品進行測序。整個測序過程委托上海派森諾生物科技有限公司完成。
2、結果與討論
2.1 投加Fe2+前后兩級ANAMMOX生物膜反應器運行效果對比
兩個試驗階段反應器氮素濃度、負荷和去除率的變化如圖2所示。在第一階段，R1反應器的NLR由0.12kg·(m3·d)-1提高到了0.62kg·(m3·d)-1，R1的NRR由0.07kg·(m3·d)-1提高到了0.32kg·(m3·d)-1，R2的NRR由0.01kg·(m3·d)-1提高到了0.11kg·(m3·d)-1.隨著NLR的提高，R1和R2出水NH4+-N、NO2--N和總氮(TN)濃度均表現出先降低后逐漸升高的趨勢。其中R1出水ρ(TN)從64.40mg·L-1下降到最低時的32.55mg·L-1再逐漸升高到72.46mg·L-1，R2出水ρ(TN)從31.67mg·L-1下降到最低時的18.90mg·L-1再逐漸升高到51.69mg·L-1.此現象可能是由于反應器初期AnAOB處于適應階段，處理能力有限，R1和R2的出水氮素較高;隨著運行時長的增加AnAOB逐漸富集，反應器穩定性和脫氮能力得以增強，反應器出水氮素濃度逐漸降低。隨著HRT縮短，過快的流速使得進水底物與反應器內微生物的接觸反應時間大大縮短，導致該階段后期出水氮素濃度明顯升高。在第1~119d，隨著NLR不斷升高，兩級NRE由87.40%逐步降低到階段末期的70.17%，而R1和R2的NRR均逐漸升高。從圖2(a)和2(b)可知，即使R1出水各氮素濃度隨NLR升高而不斷升高，R2的平均出水ρ(NH4+-N)和ρ(NO2--N)分別在5.52mg·L-1和5.32mg·L-1以下(最低時均接近0mg·L-1)。這說明在一定NLR范圍內，R2反應器可以進一步脫除R1反應器出水剩余氮素，這也驗證了兩級ANAMMOX生物膜反應器處理低濃度氨氮廢水的可行性和穩定性。隨著在第119~132d將NLR提高到0.62kg·(m3·d)-1，反應器脫氮性能出現惡化，R1和R2的NRR均降低，且R2平均出水ρ(NH4+-N)和ρ(NO2--N)明顯升至12.06mg·L-1和10.53mg·L-1，NRE也進一步降至66.25%。
有研究表明，Fe2+對厭氧氨氧化反應有顯著影響，本試驗第二階段考察了不同濃度Fe2+促進兩級ANAMMOX生物膜反應器脫氮性能的可行性。表1的單因素ANOVA方差分析結果進一步顯示了不同濃度Fe2+對ANAMMOX脫氮性能的影響存在極顯著性差異(P＜0.01)。而由圖2可知，投加Fe2+條件下反應器氮素濃度相比于未投加Fe2+時都有明顯下降。結合圖2(c)和2(d)可以發現，當ρ(Fe2+)為10mg·L-1時，R1的出水TN、NRR和NRE均低于ρ(Fe2+)為5mg·L-1時的相應數值;但當ρ(Fe2+)為15mg·L-1時，系統脫氮性能反而開始變差，這一變化趨勢與Zhang等的研究結果一致，表明Fe2+較高時會對AnAOB活性產生抑制，使反應器脫氮性能變差。由圖2(a)和2(b)還可發現，進水ρ(Fe2+)為5和10mg·L-1時，第1d的出水總氮會出現急劇升高的趨勢，但隨后R1和R2出水各氮素濃度逐漸降低，最終經過兩級ANAMMOX處理后的R2出水NH4+-N和NO2--N均能降至5mg·L-1以下，且隨著ρ(Fe2+)升至10mg·L-1，R2出水NO3--N濃度也逐漸降低，兩級ANAMMOX膜生物反應器的出水TN濃度更低，NRE升至81.71%。此結果表明R1系統消耗剩余的低濃度Fe2+可以有效提高R2反應器中AnAOB活性從而提高系統脫氮性能，兩級ANAMMOX生物膜反應器的串聯模式具備一定的Fe2+抗沖擊能力。隨著ρ(Fe2+)升高至15mg·L-1，R2平均出水ρ(NO2--N)為2.61mg·L-1，但平均出水ρ(NH4+-N)升高至7.53mg·L-1，導致R2出水TN濃度升高，脫氮性能下降。根據Strous等的報道， n(NO2--N)∶n(NH4+-N)=1.32是厭氧氨氧化反應適宜的摩爾比，而R2出水NH4+-N濃度偏高，NO2--N濃度較低可能是因為投加較高濃度Fe2+抑制AnAOB的活性，NH4+-N基質難以進一步被利用。
2.2 Fe2+對ANAMMOX脫氮性能的影響
2.2.1反應器不同運行條件下EPS的變化
EPS是指一定條件下，由微生物代謝產生并黏附在細胞壁外的一種高分子聚合物，其主要成分有PS、PN和核酸。EPS不僅能夠提供細胞生長的結構基質，而且在抵抗環境壓力等方面起著重要作用。此外，EPS中PN/PS的比值在污泥的顆粒化和穩定過程也起著至關重要的作用。PN/PS越高，污泥穩定性越好。不同進水Fe2+濃度下反應器的生物膜PN和PS含量變化如圖3所示。
由圖3可知，投加了Fe2+之后，兩級反應器的PN和PS含量都有所提高，且隨著Fe2+濃度的升高，PN/PS比值越來越高。在R1反應器中， ρ(Fe2+)為0mg·L-1時，生物膜ω(PN)和ω(PS)分別為115.68mg·g-1和36.88mg·g-1.當ρ(Fe2+)升高到5mg·L-1時，生物膜ω(PN)和ω(PS)分別升至196.64mg·g-1和40.25mg·g-1;隨著ρ(Fe2+)繼續升高到10mg·L-1和15mg·L-1，PN和PS含量均有所下降但仍高于ρ(Fe2+)為0mg·L-1時的PN和PS含量。結合圖2結果可推測，由于低濃度Fe2+有利于污泥絮體的混凝和沉降，生物膜會分泌大量PN和PS來抵御這種環境變化以提升污泥環境抗性，從而促進脫氮，但較高濃度的Fe2+對微生物的毒性抑制作用增強會導致反應器脫氮性能下降。相比于R1，R2反應器中的PN和PS含量提升得則比較緩和，可能是因為R1出水Fe2+濃度較低，污泥絮體的混凝和沉降作用不明顯。
2.2.2 亞鐵血紅素c含量的變化
Fe2+參與亞鐵血紅素c的形成過程，而亞鐵血紅素c在厭氧氨氧化代謝過程中作為聯胺合成酶(HZS)和亞硝酸鹽還原酶(NIR)等主要酶蛋白的輔因子，在厭氧氨氧化脫氮過程發揮著重要作用。在每個階段亞鐵血紅素c的含量(以VSS計，下同)和AnAOB活性有直接關系。由圖4可見，在R1反應器中，當ρ(Fe2+)為0mg·L-1時， mB(亞鐵血紅素c)為(3.99±0.35)μmol·g-1，當ρ(Fe2+)提升到10mg·L-1時， c(亞鐵血紅素c)達到(8.49±0.34)μmol·g-1，是對照組的2.1倍。隨著ρ(Fe2+)進一步升高到15mg·L-1， mB(亞鐵血紅素c)降低到(5.20±0.29)μmol·g-1，此結果與反應器脫氮性能的變化一致。因此，適宜濃度Fe2+的添加補充了厭氧氨氧化系統的微量元素Fe，能夠提高亞鐵血紅素c含量以及功能酶活性，從而促進厭氧氨氧化脫氮，而Fe2+過高時反而抑制酶活性，抑制脫氮作用。在R2反應器中，隨著ρ(Fe2+)由0mg·L-1逐漸提升到15mg·L-1， mB(亞鐵血紅素c)由(1.00±0.24)μmol·g-1逐漸升高到(2.48±0.22)μmol·g-1，這說明起始Fe2+濃度的升高能夠提高R2反應器內Fe2+的濃度，從而促進亞鐵血紅素c的合成。
2.2.3 Fe2+對ANAMMOX菌活性的影響
對于厭氧氨氧化生物膜系統，當Fe2+濃度過高時，Fe2+會通過微生物吸附、跨膜轉運和胞內積累等方式進入微生物，當Fe2+濃度超過生物膜的吸附能力，反應器微生物活性會受到抑制，進而導致脫氮性能下降。為進一步驗證不同濃度Fe2+作用下對厭氧氨氧化過程的影響和響應差異，采用了穩定運行的R1反應器生物膜樣品進行了Fe2+單因素影響批次試驗，結果如表2和圖5所示。由表2的單因素ANOVA分析結果可以確定：起始ρ(Fe2+)為0、5、10、15和20mg·L-1時對ANAMMOX菌活性的影響存在極顯著性差異(P＜0.01)。由圖5可知，當起始投加ρ(Fe2+)為0mg·L-1時，SAA為(31.03±3.38)mg·(g·d)-1，當ρ(Fe2+)提高到5mg·L-1和10mg·L-1時，SAA分別升至(95.52±5.26)mg·(g·d)-1和(111.15±20.02)mg·(g·d)-1.這說明此低濃度Fe2+范圍內對厭氧氨氧化污泥的活性有著明顯的促進作用。其中ρ(Fe2+)為10mg·L-1對污泥活性的促進效果相較于對照組的污泥活性提升了3.6倍，略高于ρ(Fe2+)為5mg·L-1時的3.1倍。當ρ(Fe2+)提升到15mg·L-1時，Fe2+對系統整體脫氮性能的促進作用開始減弱，SAA降低到了(65.65±14.18)mg·(g·d)-1.而當ρ(Fe2+)進一步升至20mg·L-1時表現出明顯抑制作用，SAA降低到(11.83±2.51)mg·(g·d)-1，僅為對照組的38%。此結果與前述兩級ANAMMOX生物膜反應器在不同濃度Fe2+投加條件對脫氮性能的影響情況相吻合。
2.3 微生物群落分析
圖6為Fe2+投加前后R1和R2反應器污泥屬水平下優勢菌群分布變化。由圖6(a)可知， Candidatus_Kuenenia是具有厭氧氨氧化能力的優勢菌群。在各Fe2+濃度條件下，R1中Candidatus_Kuenenia的相對豐度分別為3.83%、19.27%、16.18%和16.25%，表明適當濃度Fe2+的添加有效促進了厭氧氨氧化菌的富集生長。由圖6(b)可知，各Fe2+濃度條件下R2中Candidatus_Kuenenia相對豐度分別為3.09%、3.74%、4.22%和3.30%。ρ(Fe2+)為10mg·L-1時的厭氧氨氧化菌富集效果最好，這與污泥活性和反應器運行效能的變化一致。綜上可以推測，Fe2+可以促進Candidatus_Kuenenia豐度的增加，加上系統異養反硝化菌的存在，從而實現兩級ANAMMOX生物膜反應器在低總氮濃度下高效穩定地脫氮。此外，有研究表明Candidatus_Kuenenia菌屬下的一些ANAMMOX菌能夠在發生厭氧氨氧化反應的同時利用NO3--N氧化Fe2+，本研究中是否存在此現象還需后續進一步探索。
3、結論
(1)采用兩級ANAMMOX生物膜系統處理低濃度總氮廢水，最高NLR可達0.62kg·(m3·d)-1，NRE平均值為67.13%。
(2)長期投加5、10和15mg·L-1的Fe2+能夠有效提高兩級ANAMMOX生物膜系統脫氮性能。其中ρ(Fe2+)為10mg·L-1的促進作用最明顯，最高NRE可達81.71%。添加適量的Fe2+有助于EPS的分泌和亞鐵血紅素c的合成，以進一步提高反應器的污泥穩定性和脫氮性能。
(3)不同濃度Fe2+對AnAOB活性的短期影響存在顯著性差異。 ρ(Fe2+)為5、10和15mg·L-1時，對AnAOB活性有明顯促進作用，其中ρ(Fe2+)為10mg·L-1時的SAA是對照組的3.6倍。當ρ(Fe2+)為20mg·L-1時，AnAOB活性受到明顯抑制，其SAA僅為對照組的38%。
(4)不同Fe2+濃度條件下能促使優勢菌屬Candidatus_Kuenenia相對豐度發生變化。 ρ(Fe2+)為10mg·L-1時，R1和R2中Candidatus_Kuenenia的相對豐度分別從ρ(Fe2+)為0mg·L-1時的3.83%和3.09%增至16.18%和4.22%。（來源：華南理工大學環境與能源學院，工業聚集區污染控制與生態修復教育部重點實驗室，佛山市化爾銨生物科技有限公司，華南理工大學化學與化工學院）
