為預防和治療畜禽疾病，獸用抗生素被廣泛用作飼料添加劑。在畜禽養殖業中，磺胺類是常用抗生素之一，大約占磺胺類抗生素總使用量的45%。所使用的抗生素在動物腸道中不能完全代謝，最終通過糞便和尿液排出體外進入到環境中。在畜禽養殖廢水中，該類藥物的檢出濃度較高。抗生素的增加，使抗性基因在非致病和致病性細菌之間傳播，會危害人類健康。
畜禽養殖場通常建有完整的生化處理工藝。但其不能有效去除抗生素，特別是磺胺類抗生素在尾水中仍保持高濃度，需另做處理再排放到環境中。由于人工濕地建設和維護成本低、操作簡單、環境友好、污染物去除率高，因此被廣泛應用于污水二級或三級處理，也是目前處理畜禽廢水的常見工藝之一。垂直流人工濕地是人工濕地技術的主流工藝之一，其對污染物的去除效率及可承受的污染負荷都普遍高于表面流和水平潛流人工濕地，但抗生素會對垂直流人工濕地的運行處理狀況產生負面影響。因此，在人工濕地中如何應對可能的抗生素影響，保障系統正常運行，實現抗生素和常規污染物的有效去除，需要做進一步研究。
鐵碳微電解作為廣泛使用的高級氧化技術之一，已被證明是一種高效處理制藥廢水、重金屬廢水、養殖廢水和其他類型廢水的低成本技術。鐵碳微電解法是將一定比例的鐵和碳浸入廢水中而形成無數微小的原電池，廢水作為電解質溶液產生氧化還原反應，對污染物進行氧化，從而使污染物分解為易降解物質。鐵碳材料具有良好的吸附能力，在微電解和吸附的共同作用下，可以有效去除廢水中的各種污染物。因此，有研究利用鐵碳微電解技術對抗生素廢水進行預處理，并取得了良好的效果。同時，有研究將微電解技術引入人工濕地后，發現其能有效應對農藥等污染物的沖擊，保證了人工濕地系統的穩定運行。
為了提高人工濕地系統對抗生素的適應性調整，筆者將鐵碳微電解技術與人工濕地相結合，構建了微電解耦合上升垂直流人工濕地系統，同時構建普通上升垂直流人工濕地系統作為對照，研究兩種人工濕地系統對畜禽養殖廢水中磺胺二甲基嘧啶（SM2）的去除效果與凈化機理，并通過酶活性測定和高通量測序系統分析了濕地系統中基質酶活性和微生物群落的變化，明確了磺胺二甲基嘧啶對兩種人工濕地微生態系統的影響規律，旨在為畜禽養殖廢水尾水中抗生素的去除探索有效途徑。
1、材料與方法
1.1 實驗裝置
采用PVC材料制成兩個尺寸相同的人工濕地實驗裝置（見圖1）。裝置長為70cm，寬為50cm，高為65cm。微電解耦合上升垂直流人工濕地系統（簡稱為A）自下而上依次填充鵝卵石（粒徑為2~3cm）、鐵碳（粒徑為1~1.5cm）、沸石（粒徑為0.5~1cm）；普通上升垂直流人工濕地系統（簡稱為B）自下而上依次填充鵝卵石（粒徑為2~3cm）、礫石（粒徑為1~1.5cm）、沸石（粒徑為0.5~1cm）；并用鋁箔包裹避光，在A、B系統的沸石層分別種植6株長勢相似的美人蕉。植物生長補光燈日照時長為10h。
鐵碳的制備參照文獻，鐵粉、碳粉、高嶺土和氯化銨按照質量比為2.40∶3.60∶4.00∶0.05攪拌均勻后加水調勻，其含水率控制在10%~12%之間，采用球形造粒機制成粒徑為1~1.5cm的球狀填料，并在110℃的烘箱中干燥2h，將其放在馬福爐中，在900℃下焙燒4h，自然冷卻至室溫后制成。
1.2 實驗運行及采樣
采用桂林市雁山污水處理廠出水啟動系統，使用蠕動泵連續進水，HRT設置為48h，待兩個系統中植物生長正常，且對常規污染物的去除率穩定運行至少一個月后視為啟動完成，可開始后續實驗。
用葡萄糖（400mg/L）、磷酸二氫鉀（15mg/L）、三水合乙酸鈉（54mg/L）、碳酸氫鈉（111mg/L）、硫酸銨（108mg/L）、二水合氯化鈣（30mg/L）配制成實驗廢水，進水COD、NH4+-N和TP平均濃度分別為（400.99±4.28）、（26.23±0.28）和（3.90±0.23）mg/L。采用連續流運行方式，每2d測定一次進出水中污染物濃度。選用磺胺二甲基嘧啶作為目標抗生素，其在模擬廢水中的添加濃度設定為100μg/L。具體實驗步驟分三個階段，其中第一階段為向A、B系統連續進實驗廢水兩個月后，將濕地系統基質分為三等份，從基質上表面往下5~10、30~40cm兩個范圍設6個取樣點，把所取基質放入無菌錐形瓶中，用無菌緩沖液淹沒基質，充分振蕩后，用0.22μm孔徑濾膜過濾緩沖液，濾膜上的沉淀作為測試微生物多樣性和基質酶活性的樣品；繼續向A、B系統進實驗廢水兩個月（第二階段），向廢水中加入SM2并混勻，再次連續進水兩個月后，提取基質，測試微生物多樣性和基質酶活性（第三階段），提取方法與第一階段相同。
1.3 分析項目及方法
COD采用重鉻酸鹽法測定，NH4+-N采用納氏試劑分光光度法測定，TP采用鉬酸銨分光光度法測定，TN采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定。
水樣中的SM2采用HLB小柱凈化富集，結合高效液相色譜法（HPLC）進行分析，具體操作如下：取300mL水樣用0.45μm水系濾膜抽濾，然后用鹽酸調節pH為3.0，加入0.3g的Na2EDTA；HLB小柱用5mL甲醇、5mL超純水預洗，將備用水樣過柱，以5mL/min的流速流經HLB小柱，擠干；用10mL甲醇洗脫，收集；用氮氣吹干，加入1mL流動相旋渦溶解，過0.22μm濾膜，隨后用于HPLC分析。色譜條件：色譜柱為AgilentTC-C18（4.6mm×250mm，5μm），流動相乙腈（A）∶0.1%甲酸（B）為15∶85，流速為1mL/min，柱溫為30℃，進樣量為20μL，檢測波長為270nm。
脲酶活性采用靛酚藍比色法進行測定；脫氫酶活性采用TTC比色法進行測定；堿性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法進行測定。微生物DNA提取采用FastDNASPINKitForSoil（MPBiotechnology）試劑盒來完成。PCR擴增所用的引物為338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCA）和806R（GGAC TACHVGGGTWTCTAAT），利用IlluminaMiSeq250儀器完成測序分析，測序由上海派森諾生物科技有限公司來完成。使用Vsearch軟件過濾高質量的嵌合序列。采用UPARCE以97%的序列同一性對操作單元（OTU）進行聚類。
2、結果與討論
2.1 污染物去除效果
進出水中COD、NH4+-N、TP和TN濃度的變化見圖2。A系統對常規污染物的去除率顯著高于B系統。第一階段，A系統對COD、NH4+-N、TP和TN的去除率分別為（93.74±7.46）%、（70.79±3.67）%、（90.50±13.78）%和（62.86±4.07）%，而B系統的相應去除率分別為（67.27±7.71）%、（55.10±4.23）%、（61.94±8.23）%和（47.47±4.71）%。在第二階段發現，提取基質后對兩種濕地系統中微生物群落均造成了影響。對于外界影響，Ａ系統可以更快地調整適應，所以歷經較短時間就恢復了高效處理能力；而B系統抵抗外界影響的能力較弱，去除率波動較大。第三階段，A系統對幾種常規污染物的去除率與第一階段幾乎相同，總體保持了穩定且高效的處理效果；B系統對常規污染物的去除率下降較明顯且波動較大，COD、NH4+-N、TP和TN分別平均下降了3.80%、14.94%、30.97%和10.63%。這一過程表明在SM2的脅迫下，微電解耦合上升垂直流人工濕地系統可以穩定且有效地去除常規污染物，而普通上升垂直流人工濕地系統則受到了較大的沖擊。
進出水中SM2濃度的變化如圖3所示。
從圖3可知，與B系統相比，A系統出水中SM2濃度更低，系統穩定運行后對SM2的去除率為（76.64±2.04）%，且能在10d左右達到穩定，而B系統對SM2的去除率為（36.37±19.45）%，且一直處于波動狀態，50d后依舊難以穩定。因此，從對SM2的去除效果來看，A系統不僅在去除率方面優勢明顯，而且系統的穩定性也顯著強于B系統，這也顯示了B系統缺乏應對SM2沖擊的能力，在相對較高濃度SM2的長期脅迫下難以實現穩定運行。
2.2 基質酶活性的變化
基質酶在污水凈化中起關鍵作用，其是微生物分泌的一類非常重要的生物催化劑，能參與多種有機物反應，進而提高人工濕地系統對污染物的去除效率。其中脲酶、磷酸酶和脫氫酶與污水中氮、磷和有機物的去除密切相關。在模擬廢水中投加SM2后，A、B系統中基質酶活性的變化見表1。
總體來看，A、B系統在投加SM2后，各項酶指標均有下降，表明SM2作為一種廣譜性抗生素對微生物群落的影響是明確的。在A系統中脲酶、堿性磷酸酶和脫氫酶活性的變化率顯著低于B系統。鐵碳微電解可有效降解磺胺類抗生素的作用機理已有報道，推測微電解首先作用于S—N鍵，使其斷裂，然后分別作用于苯環和特征官能團，得到一系列最終產物和中間產物。鐵碳對SM2的分解作用能夠大幅降低其對A系統的毒性脅迫，這在很大程度上保障了系統的原有功效。B系統則缺乏有效的應對機制，受到較高濃度SM2的沖擊時微生物種群受到較大程度的影響，導致脲酶、堿性磷酸酶和脫氫酶活性大幅度降低，系統對常規污染物的去除效果下降得也比較顯著。
A系統中，位于上層的沸石層酶活性的變化率略小于下層的鐵碳層。圖4為A系統中不同基質層SM2濃度的變化。可知，A系統中，SM2在鐵碳層和沸石層的平均濃度分別為67.23和31.96μg/L，表明鐵碳層確實降低了SM2濃度。因此，上層沸石層的SM2濃度更低，上層中微生物受到的影響也更小，體現出來的酶活性的變化率也更小一些。
2.3 微生物群落的變化
圖5為A、B系統在屬水平上的微生物Heatmap圖（1為投加SM2前，2為投加SM2后）。
從圖5可以看出，投加SM2前，A系統的主要優勢菌屬分別為Trichococcus和Bacillus。投加SM2后，A系統中以去除常規有機污染物為主的主要優勢屬Trichococcus的豐度（5.28%）降低至0.31%，而OPB41的豐度由7.12%升高至10.20%，此外Cloacibacterium的豐度（0.02%）升高至19.89%，成為主要優勢屬。檢測到除氮菌Desulfomicrobium（3.69%）和Cupriavidus（0.58%）的豐度分別升高至5.41%和4.69%。反硝化細菌Bacillus（8.24%）和Rhodopseudomonas（4.37%）的豐度分別降低至2.12%和0.12%，Acinetobacter、Brevundimonas、Pseudomonas、Thermomonas和Thiobacillus的豐度由0.34%、0.14%、0.33%、0.03%和0.18%分別升高至16.69%、10.44%、3.09%、5.81%和2.83%，其中Acinetobacter、Pseudomonas和Bacillus也是常見的除磷菌。系統中存在豐富的功能微生物屬，對常規污染物有良好的去除效果，且SM2在不同程度上影響著細菌結構。
投加SM2后，A系統經短暫波動后即達到平穩、高效的運行狀態。經分析，系統的上、中兩層微生物的Chao1指數分別為3533.06和2706.69，仍然維持了較高的微生物豐度。實驗中檢測到影響抗生素去除的微生物屬包括Cloacibacterium、Lysobacter、Acinetobacter和Brevundimonas等，其豐度均有顯著增加，這些耐藥菌是去除抗生素的優勢菌屬，可以直接破壞和修飾抗生素使其失活。推測其原因很可能是鐵碳微電解有效降解了磺胺類抗生素，導致對微生物種群的脅迫效應下降，低濃度的SM2和鐵碳微電解作用刺激了功能微生物的活性，促進以Cloacibacterium為代表的菌屬生長，使A系統中微生物群落結構得到適應性調整和二次馴化。經過該過程，A系統中再次形成了豐富的功能菌屬，并能夠維持對污染物的有效去除，保證系統穩定運行。
投加SM2前，B系統的主要優勢菌屬分別為Chlorobaculum和Chlorobium。投加SM2后，B系統中主要優勢屬Chlorobaculum（10.93%）和Chlorobium（29.53%）的豐度分別降低至3.89%和0.58%，而Trichococcus和Halomonas的豐度分別由2.54%和0.13%升高至7.14%和11.21%，成為新的主要優勢菌屬。脫氮菌Chlorobium的豐度降低了28.95%。反硝化細菌Hydrogenophaga的豐度（2.29%）升高至2.31%，硝化細菌Azospira的豐度由0.28%增加至2.30%。與抗生素去除有關的微生物Lysobacter的豐度由0.11%升高至5.12%。
投加SM2后，B系統去除常規污染物時產生了大幅度波動，去除效果下降明顯。該系統上、中兩層微生物的Chao1指數分別由3695.20和3704.07降低至3054.57和1199.88，總體微生物量明顯下降。在B系統中也僅發現了一種與抗生素去除有關的優勢菌屬（Lysobacter），表明在高濃度SM2的脅迫下，該系統受到顯著沖擊，難以進行微生物群落結構的適應性調整，因此B系統的穩定性及對污染物的去除效果均大幅度下降。
3、結論
①在SM2的脅迫下，微電解耦合上升垂直流人工濕地系統仍能維持穩定、高效的運行狀態，對常規污染物與SM2均表現出了更好的去除效果，而普通上升垂直流人工濕地系統難以實現穩定運行，其對常規污染物與SM2的去除效果均顯著低于微電解耦合上升垂直流人工濕地系統。
②基質酶活性的變化情況表明，微電解耦合上升垂直流人工濕地系統中脲酶、堿性磷酸酶和脫氫酶活性的變化率顯著低于普通上升垂直流人工濕地系統。主要原因是微電解耦合上升垂直流人工濕地系統中鐵碳微電解作用降低了SM2對系統的毒性脅迫，有效維持了基質酶的活性，而普通上升垂直流人工濕地系統受到較高濃度SM2的沖擊，微生物種群受到較大程度的影響，脲酶、堿性磷酸酶和脫氫酶活性大幅度降低。
③鐵碳微電解對SM2的分解作用降低了脅迫效應，較低濃度的SM2可能促使微生物屬發生二次馴化，致使去除抗生素的微生物屬Cloacibacterium、Lysobacter、Acinetobacter和Brevundimonas等的豐度均顯著增加，群落結構的適應性調整保證了微電解耦合上升垂直流人工濕地系統穩定、高效的運行狀態；普通上升垂直流人工濕地系統在高濃度SM2的脅迫下，難以實現微生物結構適應性調整和二次馴化，對污染物的去除效果明顯下降。（來源：廣西師范大學環境與資源學院，珍稀瀕危動植物生態與環境保護教育部重點實驗室，桂林電子科技大學生命與環境科學學院）
