在污水處理過程中，碳源作為微生物新陳代謝的必需物質(zhì)和能量來源，對(duì)系統(tǒng)內(nèi)各種污染物(氮、磷)的去除和污泥性能(吸附性能、沉降性能)有著非常重要的影響。由于雨水、河水、地下水的滲透稀釋，我國5476座城鎮(zhèn)污水處理廠中有2052座(數(shù)量占比37.5%)的進(jìn)水耗氧有機(jī)污染物濃度(以COD計(jì))小于150mg·L−1，與設(shè)計(jì)進(jìn)水水質(zhì)相差甚遠(yuǎn)。特別地，南方地區(qū)多個(gè)城鎮(zhèn)污水處理廠的BOD5實(shí)際進(jìn)水值比設(shè)計(jì)進(jìn)水低，為設(shè)計(jì)值的1/2~1/3倍。除此以外，對(duì)廣東省60多座污水處理廠調(diào)查發(fā)現(xiàn)，40多座污水處理廠存在進(jìn)水耗氧有機(jī)物濃度(以COD計(jì))偏低的現(xiàn)象，其中23座污水廠進(jìn)水COD值小于100mg·L−1，10座污水廠進(jìn)水COD值小于60mg·L−1。可見，我國南方地區(qū)污水處理廠低濃度進(jìn)水現(xiàn)象較為普遍。低濃度污水往往需外加碳源來保證脫氮，增加了處理成本，同時(shí)會(huì)使絲狀菌生長速率超過菌膠團(tuán)細(xì)菌，容易引發(fā)污泥膨脹，增加污水處理難度。
在現(xiàn)有的污水處理工藝中，循環(huán)式活性污泥法(cyclicactivatedsludgesystem，CASS)能很好地處理低濃度污水，出水水質(zhì)穩(wěn)定達(dá)標(biāo)。CASS工藝是序批式活性污泥法的改良工藝，通常功能區(qū)分為污泥選擇區(qū)和主反應(yīng)區(qū)，體積比為1∶5，污泥選擇區(qū)進(jìn)行反硝化脫氮和厭氧釋磷，主反應(yīng)區(qū)進(jìn)行硝化和好氧聚磷。該工藝具有反應(yīng)器配置靈活、操作簡便、污泥絲狀膨脹少和占地面積小等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于處理城市污水、工業(yè)廢水和農(nóng)村生活污水等。在處理低濃度污水時(shí)，通過梯級(jí)非限制曝氣等方式，能有效緩解反硝化碳源不足的問題，促進(jìn)同步硝化反硝化，在出水達(dá)標(biāo)的前提下顯著增強(qiáng)脫氮效率。同時(shí)CASS工藝前端的污泥選擇區(qū)能有效抑制污泥絲狀膨脹，活性污泥體積指數(shù)一般較低(20~40mg·L−1)，污泥沉降性能良好。
盡管CASS工藝對(duì)低濃度進(jìn)水有良好的適應(yīng)性，但當(dāng)進(jìn)水濃度過低時(shí)，會(huì)對(duì)其沿程污染物降解特征和微生物群落響應(yīng)機(jī)制造成顯著影響。有研究表明，當(dāng)進(jìn)水COD值為98mg·L−1時(shí)，耗氧有機(jī)物濃度(以COD計(jì))在進(jìn)水曝氣0.5h大幅降低，隨后微生物以內(nèi)源呼吸為主，細(xì)胞衰亡釋放代謝產(chǎn)物造成水體有機(jī)物濃度緩慢升高，有機(jī)物、氨氮、總氮和總磷的去除主要發(fā)生在運(yùn)行前期，曝氣結(jié)束后污染物濃度基本不變，曝氣階段主反應(yīng)區(qū)變形菌門的相對(duì)豐度最高，污染物濃度變化的主要原因是由于活性污泥與污水接觸初期具有快速吸附的性能，吸附作用通常在5~15min內(nèi)完成。污染物去除與微生物群落結(jié)構(gòu)變化密切相關(guān)，這些沿程變化的特征必然會(huì)引起微生物群落結(jié)構(gòu)的沿程差異；同時(shí)，進(jìn)料方式的改變會(huì)富集不同的脫氮功能菌，當(dāng)進(jìn)水COD值為150mg·L−1時(shí)，序批式進(jìn)料生化池的硝化螺旋菌屬和黃桿菌屬豐度較高，而連續(xù)式進(jìn)料的硝化菌屬和脫氯單胞菌屬豐度較高。可見，對(duì)于CASS工藝，微生物的群落特征與污水處理性能密切相關(guān)。然而，現(xiàn)有研究大多集中在反應(yīng)器的整體微生物變化，鮮有涉及沿程(分區(qū)、分階段)微生物群落結(jié)構(gòu)變化方面的研究。而揭示低進(jìn)水濃度下CASS工藝微生物群落結(jié)構(gòu)的沿程變化特征，是了解污染物降解沿程變化過程機(jī)理的關(guān)鍵。
因此，本研究選取廣東省某CASS工藝城鎮(zhèn)污水處理廠作為研究對(duì)象，統(tǒng)計(jì)歷年運(yùn)行數(shù)據(jù)，分析工藝處理效果，沿程布點(diǎn)采集完整周期內(nèi)不同的反應(yīng)區(qū)域與運(yùn)行階段的污水和污泥樣品，綜合研究CASS生化池沿程污染物變化與沿程微生物群落結(jié)構(gòu)變化，從微生物學(xué)角度揭示低負(fù)荷CASS工藝的污水處理機(jī)理與運(yùn)行機(jī)制，為長期處于低負(fù)荷進(jìn)水條件CASS工藝的設(shè)計(jì)及運(yùn)行優(yōu)化提供參考。
1、材料與方法
1.1 工程概況
廣東省某CASS城鎮(zhèn)污水廠處理規(guī)模為6×104m³·d−1。該污水廠未采取外加碳源與化學(xué)除磷劑的方式，出水執(zhí)行《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB18918-2002)一級(jí)A排放標(biāo)準(zhǔn)。該污水廠預(yù)處理段由粗格柵、細(xì)格柵及旋流沉砂池組成，二級(jí)處理單元為CASS生化池，深度處理采用反硝化深床濾池和加氯消毒工藝。CASS生化池分為污泥選擇區(qū)和主反應(yīng)區(qū)兩部分，體積比1∶5，有效水深6m，換水率30%，進(jìn)水時(shí)污泥選擇區(qū)啟動(dòng)潛流攪拌，主反應(yīng)區(qū)啟動(dòng)潛流攪拌和鼓風(fēng)曝氣，完整1周期時(shí)長為4h，進(jìn)水2h，沉淀1h，潷水40min，閑置20min。進(jìn)水5min后開始污泥回流至進(jìn)水結(jié)束，流量為130m3·h−1，回流比為18.8%。沉淀5min后開始排剩余污泥至沉淀結(jié)束，流量為20m3·h−1。水力停留時(shí)間為17.1h，污泥齡為15.1d，MLSS為4064~5615mg·L−1，MLVSS為1986~2969mg·L−1，SVI為28.9~39.9mg·L−1，曝氣時(shí)主反應(yīng)區(qū)溶解氧為1~2mg·L−1。實(shí)驗(yàn)時(shí)生化池內(nèi)溫度為20~25℃。工藝流程如圖1所示，月均水質(zhì)指標(biāo)如表1所示。該廠月均進(jìn)水COD值均小于150mg·L−1，屬于典型的低進(jìn)水濃度污水處理廠。
1.2 沿程污染物變化實(shí)驗(yàn)方法
采集不同區(qū)域與不同運(yùn)行階段的污水樣品，采樣點(diǎn)分別布設(shè)在配水井出水、細(xì)格柵出水、旋流沉砂池出水、污泥選擇區(qū)中段(進(jìn)水10min、進(jìn)水1h、進(jìn)水結(jié)束、沉淀1h、潷水結(jié)束、閑置結(jié)束)、主反應(yīng)區(qū)出水段(進(jìn)水10min、進(jìn)水1h、進(jìn)水結(jié)束、沉淀1h、潷水結(jié)束、閑置結(jié)束)，每個(gè)采樣點(diǎn)均分析化學(xué)需氧量(COD)、總氮(TN)、硝態(tài)氮(NO3−-N)、銨態(tài)氮(NH4+-N)、總磷(TP)水質(zhì)指標(biāo)，采集6次完整周期樣本，對(duì)每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測定3次取均值，對(duì)各污染物的沿程變化進(jìn)行研究。
1.3 沿程微生物群落分析
采集CASS生化池污泥選擇區(qū)和主反應(yīng)區(qū)不同運(yùn)行階段(進(jìn)水1h、進(jìn)水結(jié)束、沉淀1h、閑置結(jié)束)的活性污泥樣品，用250mL塑料瓶儲(chǔ)存，置于−80℃的冰箱保存待測。樣品DNA使用PowerWater®SterivexTMDNAIsolationKit(MoBio,USA)試劑盒按說明書進(jìn)行提取，使用Nanodrop(ThermoScientific,USA)檢測DNA濃度和純度，使用瓊脂糖凝膠電泳法檢測蛋白污染及DNA完整度。質(zhì)檢合格的DNA樣品通過引物515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和907R(5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’)對(duì)DNAV4~V5可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，條件為94℃預(yù)變形5min，94℃變形30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。完成擴(kuò)增后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，每個(gè)擴(kuò)增子的主帶長度均不小于420bp，按等質(zhì)量原則計(jì)算樣品體積，將各PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合，在IlluminaNova6000平臺(tái)進(jìn)行PE250測序，獲得的原始序列經(jīng)質(zhì)控過濾后得到有效的高質(zhì)量序列，采用UPARSE方法將有效序列進(jìn)行OTU聚類，并與SILVA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析。
1.4 檢測及分析方法
水樣COD、BOD5、TN、TP、NH4+-N、NO3−-N、MLSS、MLVSS、SVI等指標(biāo)均根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測定。溶解氧和溫度由雷磁DZB-718-A型便攜式多參數(shù)分析儀測定。
使用Origin2022軟件對(duì)理化數(shù)據(jù)與微生物相對(duì)豐度進(jìn)行繪圖，利用STAMP軟件進(jìn)行優(yōu)勢微生物差異分析。將OTU信息導(dǎo)入Excel2022，使用USEARCH軟件計(jì)算多樣性指數(shù)。使用TBtools軟件繪制微生物菌屬聚類熱圖。使用R軟件(版本4.2.2)vegan程序包對(duì)微生物菌屬和環(huán)境因子進(jìn)行RDA冗余分析，ggplot2程序包進(jìn)行繪圖。通過PICRUSt軟件對(duì)OTU豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，比對(duì)KEGG數(shù)據(jù)庫信息進(jìn)行功能基因預(yù)測分析。
2、結(jié)果與討論
2.1 沿程污染物變化特征
按照CASS工藝功能區(qū)劃分，通過對(duì)預(yù)處理段和生化池的沿程布點(diǎn)，分析COD、TN、NO3−-N、NH4+-N、TP污染物的沿程變化特征，研究各功能區(qū)不同運(yùn)行階段的污染物去除性能。
1)耗氧有機(jī)物(以COD計(jì))沿程變化分析。圖2揭示了預(yù)處理段、污泥選擇區(qū)和主反應(yīng)區(qū)COD值變化特征。從配水井到旋流沉砂池通過物理作用去除污水中18.36%的耗氧有機(jī)物(以COD計(jì))，進(jìn)入生化池前初始的COD值為59.33mg·L−1，污水進(jìn)入污泥選擇區(qū)后，進(jìn)水10minCOD值迅速降低至32.33mg·L−1，主要原因是由于生物吸附，吸附一般進(jìn)行5~15min后即達(dá)到飽和，該過程也存在回流液的混合稀釋。進(jìn)水1h異養(yǎng)菌降解吸附的有機(jī)物，部分有機(jī)碳源用于脫氮除磷，COD值達(dá)到最低18.67mg·L−1。吸附飽和后活性污泥若未及時(shí)完成泥水分離，會(huì)重新釋放有機(jī)物至上覆水流，同時(shí)存在進(jìn)水有機(jī)物補(bǔ)充，共同導(dǎo)致進(jìn)水結(jié)束時(shí)COD值上升至21mg·L−1。進(jìn)水結(jié)束至閑置結(jié)束污泥選擇區(qū)COD值持續(xù)上升至41.67mg·L−1，原因是進(jìn)水有機(jī)物含量低，可生物利用組分很快被降解完，當(dāng)水中有機(jī)物濃度過低時(shí)，微生物開始進(jìn)行內(nèi)源呼吸，部分細(xì)胞衰亡釋放代謝物到水中，導(dǎo)致COD值上升，同時(shí)可能存在部分固態(tài)有機(jī)物厭氧分解。
主反應(yīng)區(qū)COD值變化不明顯，表明有機(jī)物的吸附降解主要發(fā)生在污泥選擇區(qū)。將旋流沉砂池出水與主反應(yīng)區(qū)潷水結(jié)束的耗氧有機(jī)物濃度(以COD計(jì))對(duì)比，CASS生化池可去除污水中56.42%的耗氧有機(jī)物(以COD計(jì))，出水COD值為18.33mg·L−1。
2)氮素沿程變化分析。圖3(a)、圖3(b)、圖3(c)揭示了預(yù)處理段、污泥選擇區(qū)和主反應(yīng)區(qū)TN、NH4+-N及NO3−-N質(zhì)量濃度變化特征。經(jīng)細(xì)格柵和旋流沉砂池處理去除8.09%的TN與5.48%的NH4+-N，進(jìn)入生化池初始的TN、NH4+-N及NO3−-N質(zhì)量濃度分別為10.57、5.69、0.07mg·L−1。污泥選擇區(qū)進(jìn)水階段TN變化情況與COD相似，進(jìn)水10min主要發(fā)生吸附，進(jìn)水1h主要進(jìn)行反硝化脫氮，進(jìn)水結(jié)束時(shí)TN質(zhì)量濃度上升至7.14mg·L−1，主要由于進(jìn)水補(bǔ)充、NO3−-N內(nèi)回流和吸附的TN解吸導(dǎo)致，隨后階段主要以反硝化為主，閑置結(jié)束TN質(zhì)量濃度降低至5.77mg·L−1。同樣，污泥選擇區(qū)NH4+-N質(zhì)量濃度在進(jìn)水1h降至最低值2.91mg·L−1。有研究表明，當(dāng)溶解氧較低時(shí)硝化主要以短程硝化為主，由于內(nèi)回流液中含有少量溶解氧，故該階段主要發(fā)生短程硝化導(dǎo)致NH4+-N質(zhì)量濃度降低。沉淀過程底部溶解氧含量較低，厭氧條件下NH4+-N的釋放速率與釋放量比好氧條件下高，沉淀1h選擇區(qū)NH4+-N質(zhì)量濃度上升至3.94mg·L−1。進(jìn)水NO3−-N質(zhì)量濃度幾乎為0mg·L−1，污泥選擇區(qū)的NO3−-N絕大部分來自主反應(yīng)區(qū)內(nèi)回流的NO3−-N，進(jìn)水階段NO3−-N質(zhì)量濃度始終低于主反應(yīng)區(qū)，進(jìn)水結(jié)束后NO3−-N質(zhì)量濃度持續(xù)降低至0.69mg·L−1，說明選擇區(qū)沿程均存在反硝化脫氮。
主反應(yīng)區(qū)TN質(zhì)量濃度在進(jìn)水曝氣1h降低至5.84mg·L−1，好氧硝化使NH4+-N質(zhì)量濃度在進(jìn)水結(jié)束時(shí)下降至最低值0.55mg·L−1，與選擇區(qū)沿程NH4+-N質(zhì)量濃度維持在較高水平相比，表明NH4+-N的降解去除主要發(fā)生在主反應(yīng)區(qū)，進(jìn)水結(jié)束時(shí)NO3−-N上升至最高值4.47mg·L−1；進(jìn)水結(jié)束后發(fā)生反硝化脫氮使TN降低，NH4+-N因含氮物質(zhì)分解釋放而上升，與污泥選擇區(qū)沿程變化一致。潷水階段氧傳質(zhì)增強(qiáng)，NO3−-N質(zhì)量濃度上升至4mg·L−1，此時(shí)TN質(zhì)量濃度降低至5.77mg·L−1，說明出現(xiàn)同步硝化反硝化脫氮現(xiàn)象。閑置階段主反應(yīng)區(qū)NO3−-N質(zhì)量濃度仍維持在較高水平，表明NO3−-N的去除主要發(fā)生在污泥選擇區(qū)。比較旋流沉砂池出水與主反應(yīng)區(qū)潷水結(jié)束的TN與NH4+-N質(zhì)量濃度可知，CASS生化池可去除41.71%的TN與77.78%的NH4+-N。以進(jìn)水10min與閑置結(jié)束的TN質(zhì)量濃度為始末值計(jì)算，污泥選擇區(qū)脫氮效率為23.23%，主反應(yīng)區(qū)脫氮效率為8.80%，表明污泥選擇區(qū)具有更高的脫氮效能。
3)TP沿程變化分析。圖4揭示了預(yù)處理段、污泥選擇區(qū)和主反應(yīng)區(qū)TP質(zhì)量濃度變化特征。在預(yù)處理段通過物理作用去除污水TP效果不明顯，進(jìn)入生化池初始的TP質(zhì)量濃度為0.87mg·L−1。進(jìn)水10min由于聚磷菌厭氧釋磷導(dǎo)致污泥選擇區(qū)的TP升至最高值1.1mg·L−1。進(jìn)水1h由于從主反應(yīng)區(qū)內(nèi)回流的混合液中含有NO3−-N，聚磷菌能以NO3−-N作為電子受體替代氧進(jìn)行生物除磷，使得污泥選擇區(qū)TP質(zhì)量濃度顯著下降至最低值0.19mg·L−1。進(jìn)水結(jié)束時(shí)生物吸附趨于飽和，部分有機(jī)磷分解釋放到水體中，伴有進(jìn)水補(bǔ)充，TP質(zhì)量濃度升高至0.31mg·L−1。
由于主反應(yīng)區(qū)進(jìn)水時(shí)曝氣充氧，聚磷菌超量吸磷，TP質(zhì)量濃度顯著降低，沉淀1hTP質(zhì)量濃度達(dá)到最低值0.06mg·L−1，該過程NO3−-N和TP同步降低，出現(xiàn)反硝化除磷現(xiàn)象。污泥選擇區(qū)與主反應(yīng)區(qū)在進(jìn)水結(jié)束后TP質(zhì)量濃度基本不變，在活性污泥DNA檢測中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)區(qū)域均存在藍(lán)藻菌，磷是藍(lán)藻生長的關(guān)鍵營養(yǎng)元素，說明維持出水TP質(zhì)量濃度較低的原因除了聚磷菌好氧吸磷外還包括藍(lán)藻吸磷。對(duì)比兩個(gè)區(qū)域進(jìn)水10min和進(jìn)水1h的TP降低幅度可知，TP的去除主要發(fā)生在污泥選擇區(qū)。將旋流沉砂池出水與主反應(yīng)區(qū)潷水結(jié)束的TP質(zhì)量濃度進(jìn)行對(duì)比，可知CASS生化池可去除99.59%的TP，出水TP質(zhì)量濃度為0.063mg·L−1。
2.2 沿程微生物群落變化特征
1)微生物多樣性分析。基于OTU數(shù)據(jù)，從α多樣性特點(diǎn)綜合分析微生物多樣性，各功能區(qū)及其不同運(yùn)行階段活性污泥的α多樣性指數(shù)如表2所示。8組樣品的覆蓋率指數(shù)均大于0.99，說明數(shù)據(jù)的可靠性非常高。微生物相對(duì)數(shù)量使用OTUs數(shù)值來評(píng)估，比較不同區(qū)域同一階段，污泥選擇區(qū)活性污泥的OTUs數(shù)值除進(jìn)水1h較低外，其余階段均高于主反應(yīng)區(qū)，污泥選擇區(qū)微生物總量普遍較多；從同一區(qū)域沿程變化看，污泥選擇區(qū)微生物數(shù)量在增多，主反應(yīng)區(qū)的則先降低后升高，與沿程COD變化相似，原因是污水廠中大部分細(xì)菌群落與COD呈正相關(guān)關(guān)系。
Simpson、Shannon和Chao1指數(shù)分別反映微生物群落的多樣性、均一性和物種總數(shù)。Simpson指數(shù)顯示污泥選擇區(qū)沿程的微生物多樣性先升高后降低，主反應(yīng)區(qū)的先降低后升高，結(jié)合沿程污染物變化特征和工藝設(shè)計(jì)推測，該結(jié)果是由于選擇區(qū)微生物前期吸附較多碳源，促進(jìn)異養(yǎng)菌的生長使多樣性升高，后期自養(yǎng)菌占比大多樣性降低，主反應(yīng)區(qū)進(jìn)水階段曝氣充氧硝化細(xì)菌占比大多樣性降低，停止曝氣后該類菌豐度降低多樣性升高。根據(jù)Shannon指數(shù)，污泥選擇區(qū)沿程微生物均一性先降低后升高，主反應(yīng)區(qū)的先升高后降低，表明污泥選擇區(qū)某些功能性微生物數(shù)量在運(yùn)行初期增多，后期減少，主反應(yīng)區(qū)則相反。進(jìn)水1h時(shí)主反應(yīng)區(qū)Shannon指數(shù)最低，可能是由于硝化菌在此時(shí)數(shù)量最多造成的。Chao1指數(shù)對(duì)稀有物種比較敏感，污泥選擇區(qū)的Chao1指數(shù)比主反應(yīng)區(qū)高，2個(gè)區(qū)域沿程Chao1指數(shù)在升高，說明選擇區(qū)的稀有物種數(shù)目更豐富，沿程稀有物種增多。
2)門水平微生物分析。由圖5可知生化池的優(yōu)勢菌門(平均相對(duì)豐度>1%)有：Proteobacteria(變形菌門，58.47%)、Bacteroidetes(擬桿菌門，21.6%)、Chloroflexi(綠彎菌門，7.06%)、Planctomycetes(浮霉菌門，2.91%)、Patescibacteria(髕骨菌門，1.44%)、Elusimicrobia(迷蹤菌門，1.15%)、Cyanobacteria(藍(lán)藻菌門，1.07%)和Firmicutes(厚壁菌門，1.02%)。變形菌門是生化池中相對(duì)豐度最高的菌門(54.68%~61.87%)，在污泥選擇區(qū)豐度先上升后下降，主反應(yīng)區(qū)則相反，該變化與微生物多樣性的變化一致，通常變形菌的生長速度快，代謝途徑廣，含有大多數(shù)反硝化菌，表明變形菌門是影響微生物多樣性變化的關(guān)鍵菌門，更易在低濃度污水中生存。主反應(yīng)區(qū)的擬桿菌門平均相對(duì)豐度(22.69%)比污泥選擇區(qū)(20.51%)高，擬桿菌門主要參與有機(jī)物的降解，表明污泥選擇區(qū)吸附的有機(jī)物一部分在主反應(yīng)區(qū)被降解。污泥選擇區(qū)的綠彎菌門平均相對(duì)豐度(7.51%)比主反應(yīng)區(qū)(6.61%)高，綠彎菌門具有良好的除磷功能，表明磷的去除主要發(fā)生在選擇區(qū)，該結(jié)果也與沿程總磷變化特征相吻合。迷蹤菌門為兼養(yǎng)型微生物，可利用O2、NO3−-N或NO2−-N進(jìn)行呼吸，其在主反應(yīng)區(qū)的平均相對(duì)豐度(1.2%)較選擇區(qū)(1.11%)高。藍(lán)藻菌門能積累外源性磷，具有超量吸磷的作用，其在污泥選擇區(qū)的沿程相對(duì)豐度持續(xù)降低(1.11%~0.97%)，而在主反應(yīng)區(qū)則持續(xù)升高(0.99%~1.26%)，其豐度變化與NO3−-N質(zhì)量濃度沿程變化趨勢一致(見圖3c)，推測是由于兩個(gè)區(qū)域沿程的NO3−-N質(zhì)量濃度變化影響藍(lán)藻菌的豐度變化。
3)屬水平微生物分析。為直觀地展現(xiàn)低進(jìn)水濃度生化池不同功能區(qū)域的微生物菌屬沿程變化特征，在屬水平上對(duì)活性污泥樣品中豐度前30的菌屬繪制熱圖并進(jìn)行聚類分析，如圖6所示。其中有6個(gè)優(yōu)勢菌屬(最大相對(duì)豐度>1%)，分別為Zoogloea(動(dòng)膠菌屬)、Sulfuritalea(硫針菌屬)、Thauera(陶厄氏菌屬)、OM27_clade、UTCFX和Haliangium。污泥選擇區(qū)運(yùn)行前期Zoogloea豐度最高(進(jìn)水1h，57.18%)，沿程持續(xù)降低，而在主反應(yīng)區(qū)運(yùn)行末期其豐度最高(閑置結(jié)束，59.11%)，Zoogloea能分泌胞外聚合物形成微生物絮狀體，提高污泥沉降性能，同時(shí)其能通過在細(xì)胞內(nèi)形成多聚偏磷酸鹽的方式吸收磷，表明選擇區(qū)在進(jìn)水階段除磷能力較強(qiáng)，主反應(yīng)區(qū)運(yùn)行后期依靠該菌屬維持較低TP質(zhì)量濃度，與總磷沿程變化特征一致。Sulfuritalea在有氧條件下能降解有機(jī)酸，污泥選擇區(qū)進(jìn)水階段Sulfuritalea相對(duì)豐度最高(進(jìn)水結(jié)束，2.8%)，主反應(yīng)區(qū)進(jìn)水階段其豐度逐漸降低(進(jìn)水結(jié)束，2.56%)，隨后沿程豐度逐漸升高，在閑置結(jié)束達(dá)到最高(3.99%)，該結(jié)果進(jìn)一步表明部分有機(jī)物的降解發(fā)生在主反應(yīng)區(qū)。Thauera是一種反硝化聚磷菌，在低有機(jī)碳源條件具有競爭優(yōu)勢，其能夠使用硝酸鹽作為電子受體降解各種芳香族化合物和鹵代衍生物，同時(shí)可通過代謝羥基丁酸鹽積累磷酸鹽，該菌在去除有機(jī)物和脫氮除磷等方面均發(fā)揮作用，污泥選擇區(qū)進(jìn)水1h時(shí)該菌屬豐度較高(1.55%)，促進(jìn)選擇區(qū)進(jìn)行反硝化除磷。Haliangium是一種典型的反硝化細(xì)菌，與水和土壤環(huán)境的氮循環(huán)相關(guān)，在污泥選擇區(qū)中不是優(yōu)勢菌屬，沿程豐度先降低后升高，在主反應(yīng)區(qū)中則持續(xù)升高(閑置階段，1.42%)，表明其主要參與主反應(yīng)區(qū)的脫氮。
在污泥選擇區(qū)沿程中，進(jìn)水1h時(shí)Zoogloea、Aeromonas(氣單胞菌屬)、Fluviicoccus和Thauera豐度較高，其中Zoogloea具有除磷功能，Aeromonas與氨氧化、好氧反硝化有關(guān)，Thauera具有降解有機(jī)物與反硝化除磷功能，該階段主要發(fā)生有機(jī)物的降解，反硝化除磷和氨氧化；進(jìn)水結(jié)束時(shí)SM1A02和Nitrospira(硝化螺旋菌屬)豐度較高，其中Nitrospira主導(dǎo)NO2−-N氧化，該階段NO2−-N氧化性能提高；沉淀1h時(shí)Flavobacterium、JdFR-76和Paludibacter豐度較高，Thauera的豐度進(jìn)一步提高，表明該階段反硝化性能進(jìn)一步提升；閑置結(jié)束時(shí)Polyangium、Prevotella_9(普雷沃氏菌屬)、Macellibacteroides、Candidatus_Accumulibacter、Bacteroides(擬桿菌屬)、Arcobacter(弓形菌屬)、Lactobacillus和Turneriella豐度較高，其中Prevotella_9是一類能強(qiáng)化人工濕地反硝化性能的菌屬，Bacteroides通常存在于厭氧環(huán)境中，是一種氫氧化型自養(yǎng)反硝化細(xì)菌，Arcobacter在低C/N比和低溫下具有較高的脫氮效率，Candidatus_Accumulibacter是典型的聚磷菌，Macellibacteroides可將蛋白質(zhì)和多糖降解為各種有機(jī)酸。綜上表明，該階段脫氮菌類型多豐度高，脫氮性能進(jìn)一步增強(qiáng)，同時(shí)存在聚磷菌厭氧釋磷和大分子有機(jī)物的降解，與沿程耗氧有機(jī)物、氮和磷的變化趨勢相對(duì)應(yīng)。
在主反應(yīng)區(qū)沿程中，進(jìn)水1hNitrospira豐度較高，該階段主要發(fā)生NO2−-N氧化；進(jìn)水結(jié)束時(shí)Terrimonas、Phaselicystis和Lactobacillus豐度較高，Terrimonas適宜在低負(fù)荷條件下進(jìn)行反硝化脫氮，Lactobacillus可以降解碳水化合物，產(chǎn)生醋酸、乳酸和乙醇，表明該階段主要發(fā)生有機(jī)物的降解和反硝化脫氮；沉淀1h時(shí)Pirellula、Nitrosomonas(亞硝化單胞菌屬)和Leptospira豐度較高，Nitrosomonas主導(dǎo)氨氧化，說明該階段氨氧化性能提高，與此時(shí)NH4+-N質(zhì)量濃度升高有關(guān)；閑置結(jié)束時(shí)Plasticicumulans、Pajaroellobacter、Sulfuritalea、Haliangium、Haliscomenobacter、OM27_clade、Polyangium、Flavobacterium、Crocinitomix和Zoogloea豐度較高，其中Sulfuritalea降解有機(jī)酸，Haliangium主要進(jìn)行反硝化，Zoogloea具有除磷功能，故該階段進(jìn)一步降解有機(jī)物和脫氮除磷。
為探究不同功能區(qū)域的顯著差異微生物菌屬，將2個(gè)區(qū)域豐度前30的微生物菌屬信息導(dǎo)入STAMP軟件，設(shè)置P=0.05過濾條件，輸出顯著差異菌屬，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，與主反應(yīng)區(qū)相比，污泥選擇區(qū)的顯著優(yōu)勢菌屬為Aeromonas、Bacteroides、Paludibacter、Prevotella_9和Arcobacter，其中Paludibacter可以分解各種糖類，產(chǎn)生醋酸和丙酸作為反硝化的碳源，其余菌屬也均與脫氮相關(guān)，表明與主反應(yīng)區(qū)相比，污泥選擇區(qū)主要依賴這5種菌屬進(jìn)行脫氮。在主反應(yīng)區(qū)中，顯著優(yōu)勢菌屬為Pajaroellobacter、Plasticicumulans和Sulfuritalea，Sulfuritalea主要降解有機(jī)酸，進(jìn)一步表明部分有機(jī)物在主反應(yīng)區(qū)被降解。
2.3 微生物群落與環(huán)境因子的相關(guān)性分析
環(huán)境因素是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因素，本研究選取COD、NH4+-N、NO3−-N、TN和TP作為環(huán)境因子，結(jié)合沿程微生物群落結(jié)構(gòu)變化，利用冗余分析(RDA)研究環(huán)境因子與微生物菌屬之間的相關(guān)性，如圖8所示。主軸1和主軸2的特征值分別為52.14%和23.46%，解釋了總方差的75.6%。在這些環(huán)境變量中NO3−-N的解釋度最高(38.92%)，對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的塑造影響最顯著，NO3−-N是污水處理廠生物脫氮的重要環(huán)境因素，結(jié)合NO3−-N沿程變化可知，其主要在污泥選擇區(qū)被去除，在主反應(yīng)區(qū)的降解效率低、殘留質(zhì)量濃度高，低濃度生化池主要反硝化菌為Thauera、Haliangium、Bacteroides、Arcobacter、Aeromonas和Prevotella_9，但其豐度占比低，平均豐度分別為1.45%、0.82%、0.48%、0.37%、0.3%和0.32%，反硝化菌數(shù)量占比低是限制污水廠脫氮的主要因素，其中Haliangium與TN呈負(fù)相關(guān)，Thauera、Bacteroides、Arcobacter、Aeromonas和Prevotella_9與NO3−-N呈負(fù)相關(guān)。NH4+-N和TP的貢獻(xiàn)率僅次于NO3−-N，分別位居第2和第3(17.51%和7.76%)。在低進(jìn)水濃度CASS生化池中，觀察到NH4+-N與TP呈正相關(guān)，主要是由于好氧時(shí)硝化與聚磷同步發(fā)生，厭氧時(shí)含氮物質(zhì)分解釋放NH4+-N同步聚磷菌釋磷的結(jié)果。Plasticicumulans和Sulfuritalea與COD呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；Candidatus_Accumulibacter與TP呈正相關(guān)，受COD影響較大；Nitrospira與TN呈正相關(guān)。上述結(jié)果進(jìn)一步佐證沿程功能性微生物具有降解有機(jī)物和脫氮除磷的能力，同時(shí)可為優(yōu)化調(diào)整工藝參數(shù)、富集各功能性微生物類群提供依據(jù)。
2.4 功能基因預(yù)測分析
為了獲得不同生化區(qū)域細(xì)菌的功能，采用PICRUSt軟件，根據(jù)KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫預(yù)測細(xì)菌群落的功能。如圖9所示，有6個(gè)功能基因組別，包括新陳代謝、人類疾病、細(xì)胞工程、生物體系統(tǒng)、遺傳信息加工和環(huán)境信息加工。根據(jù)KEGG功能分類，碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔因子和維生素代謝、萜類和聚酮化合物代謝、異生素降解和代謝、脂質(zhì)代謝、能量代謝、細(xì)胞運(yùn)輸以及遺傳信息復(fù)制和修飾為低濃度生化池中的主要功能基因，其相對(duì)豐度之和在污泥選擇區(qū)和主反應(yīng)區(qū)分別為81.65%和81.57%，除其他次生代謝物的生物合成外，其余的基因豐度均是選擇區(qū)大于主反應(yīng)區(qū)。相關(guān)研究表明，有機(jī)物的添加可顯著提高反硝化功能基因的活性，增加反硝化過程相關(guān)功能基因的數(shù)量，結(jié)合微生物多樣性分析，污泥選擇區(qū)大部分基因豐度比主反應(yīng)區(qū)高的原因主要是選擇區(qū)的耗氧有機(jī)物(以COD計(jì))濃度高，微生物數(shù)量多。
由RDA分析可知NO3−-N的解釋度最高，為了進(jìn)一步研究氮代謝途徑，選擇了硝化代謝基因(pmoA/B/C-moA/B/C、hao、nxrA/B)和反硝化代謝基因(narG/H/I、napA/B、nirS/K、norB/C、nosZ)，污泥選擇區(qū)和主反應(yīng)區(qū)分別標(biāo)記為I和II(圖10)。在硝化途徑中，沉淀1h時(shí)主反應(yīng)區(qū)氨和羥胺氧化功能基因豐度較高(pmoA/B/C-moA/B/C、hao)，表明此時(shí)硝化性能增強(qiáng)，結(jié)合沿程污染物的變化主要是由于NH4+-N質(zhì)量濃度的升高促進(jìn)了硝化反應(yīng)，使該類功能基因豐度上升。主反應(yīng)區(qū)沿程NO2−-N氧化功能基因豐度(nxrA/B)明顯比污泥選擇區(qū)高，短程硝化適宜的溶解氧質(zhì)量濃度為0.5mg·L−1，當(dāng)溶解氧為1~2mg·L−1時(shí)，NO2−-N積累率下降，主要進(jìn)行全程硝化，生化池主反應(yīng)區(qū)進(jìn)水曝氣時(shí)溶解氧為1~2mg·L−1，主要以全程硝化為主，而污泥選擇區(qū)始終處于厭氧或缺氧狀態(tài)，主要以短程硝化為主，基因nxrA/B豐度低，結(jié)合沿程菌屬豐度變化可知兩個(gè)區(qū)域的Nitrospira(NOB)豐度差別并不大，說明溶解氧對(duì)NOB的豐度影響不大，主要是限制NOB對(duì)NO2−-N的氧化功能，該結(jié)果與先前的研究報(bào)道一致。從反硝化途徑看，污泥選擇區(qū)和主反應(yīng)區(qū)沿程均在進(jìn)行反硝化，除進(jìn)水1h外，其余階段選擇區(qū)反硝化基因豐度均比主反應(yīng)區(qū)高，佐證污泥選擇區(qū)具有較高的脫氮效率。
3、結(jié)論
1)根據(jù)低進(jìn)水濃度CASS生化池沿程污染物變化特征，可知耗氧有機(jī)物(以COD計(jì))、TN、NO3−-N、TP主要在污泥選擇區(qū)被吸附降解，NH4+-N主要在主反應(yīng)區(qū)被降解。污泥選擇區(qū)進(jìn)水1hCOD和TP值降至最低，由于進(jìn)水補(bǔ)充、厭氧大分子有機(jī)物分解釋放和聚磷菌釋磷，隨后其沿程均有所上升，進(jìn)水階段NO3−-N質(zhì)量濃度始終低于主反應(yīng)區(qū)，進(jìn)水結(jié)束后沿程NO3−-N質(zhì)量濃度持續(xù)下降；主反應(yīng)區(qū)進(jìn)水階段NH4+-N質(zhì)量濃度顯著降低。表明污泥選擇區(qū)主要去除有機(jī)物和完成反硝化脫氮和除磷，主反應(yīng)區(qū)主要進(jìn)行硝化脫氨。總體而言，生化池可去除低濃度污水中56.42%的耗氧有機(jī)物(以COD計(jì))、41.71%的TN、77.78%的NH4+-N、99.59%的TP。
2)沿程微生物變化特征結(jié)果表明，生化池的優(yōu)勢菌門有變形菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、浮霉菌門、髕骨菌門、迷蹤菌門、藍(lán)藻菌門和厚壁菌門，污泥選擇區(qū)微生物總量較主反應(yīng)區(qū)多，變形菌門是影響微生物多樣性變化的關(guān)鍵菌門。屬水平上，污泥選擇區(qū)進(jìn)水1hZoogloea、Aeromonas和Thauera豐度較高，除磷、氨氧化和反硝化性能較強(qiáng)；進(jìn)水結(jié)束Nitrospira豐度較高；沉淀1hThauera的豐度提高，反硝化性能提升；閑置結(jié)束Prevotella_9、Bacteroides、Arcobacter、Macellibacteroides和Candidatus_Accumulibacter豐度較高，脫氮菌類型多豐度高，脫氮性能提高，同時(shí)存在大分子有機(jī)物的分解釋放和聚磷菌厭氧釋磷。主反應(yīng)區(qū)進(jìn)水1hNitrospira豐度較高，主要發(fā)生硝化NO3−-N質(zhì)量濃度上升；進(jìn)水結(jié)束Terrimonas和Lactobacillus豐度較高，該過程以反硝化和有機(jī)物降解為主；沉淀1hNitrosomonas豐度較高，主要發(fā)生氨氧化；閑置結(jié)束Sulfuritalea、Haliangium、Zoogloea豐度較高，該階段同步進(jìn)行有機(jī)物降解、反硝化脫氮和除磷。
3)沿程功能性微生物豐度變化與污染物濃度變化相對(duì)應(yīng)，NO3−-N對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的塑造影響最顯著(解釋度為38.92%)。整體功能基因豐度污泥選擇區(qū)大于主反應(yīng)區(qū)，氮代謝途徑表明沿程主反應(yīng)區(qū)均發(fā)生全程硝化反硝化，選擇區(qū)均發(fā)生短程硝化和全程反硝化。除進(jìn)水1h外，其余階段選擇區(qū)的反硝化功能基因豐度均比主反應(yīng)區(qū)高。（來源：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村污染治理與環(huán)境安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）
