城市污水處理廠二級出水水量大、C/N低，是導致污水處理廠尾水氮含量高，進而引起水體富營養化、水環境質量退化、威脅人體健康的重要因素之一。目前城鎮污水排放標準日益嚴格，如何降低污水廠尾水氮含量成為城市污水處理領域關注的重點。

生物反硝化效率高、成本低，被廣泛地應用于深度脫氮工藝中。異養反硝化相較于自養反硝化效率更快，然而當碳源不足時會有NO2--N積累，碳源過量時會導致出水COD不能達標排放；而自養反硝化不需要外加碳源，因此運行成本低、產生污泥量少，在污水深度脫氮工藝中得到廣泛應用。目前自養反硝化的主要電子供體包括氫氣、硫和鐵等基質。相較于氫自養和鐵自養工藝，硫自養工藝在污水處理廠的深度脫氮工藝中應用得最為廣泛。硫自養反硝化過程是硫細菌利用無機碳源，如硫化物、單質硫、和硫代硫酸鹽等作為電子供體。但硫自養反硝化過程中存在出水SO42-濃度高、pH低等問題。

近年來自養-異養反硝化協同工藝深度脫氮日漸形成一種新的發展趨勢。有研究發現自養-異養反硝化協同作用下可有效促進體系的脫氮效果。在硫自養反硝化體系中加入有機物后，一部分NO3--N通過異養反硝化被降解，同時產生的堿度會被自養反硝化產生的酸度所消耗，不僅控制了出水SO42-濃度，同時也解決了出水pH低的問題，實現了在低C/N條件下NO3--N的深度去除。然而，目前的研究多采用自制廢水進行實驗，采用實際污水處理廠尾水的研究相對較少，自養-異養反硝化協同工藝中微生物的代謝機制也缺乏深入了解。

本研究以污水廠尾水為處理對象，通過改善水力負荷條件及有機質投加量，優化異養-硫自養反硝化協同工藝運行參數，考察異養-硫自養反硝化協同工藝中污水處理廠尾水NO3--N的降解性能，探究異養-硫自養反硝化協同工藝中微生物群落結構變化情況，解析硫異養-硫自養反硝化協同工藝深度脫氮的機理。

1、材料與方法

1.1 尾水來源

本研究反應器進水來自華北某污水處理廠尾水，該廠采用A2O工藝，二沉池出水水質：COD為23mg/L，NH3-N為0.80mg/L，NO3--N為8.10mg/L，TN為9.50mg/L，SO42-為98mg/L。

1.2 實驗裝置

實驗所用反應容器內徑為40cm，高50cm，填料填充高度約為40cm，填料容積為50L。反應器底部設1個布水板，反應器側壁設置4個出水口，間隔10cm。反應器內填充硫顆粒和石英砂粒徑均為2~3mm，硫顆粒與石英砂的體積比為2∶1，實驗裝置示意如圖1所示。

1.3 實驗設計

本研究分別設置對照組和實驗組，均接種污水處理廠二沉池活性污泥，污泥質量濃度約為6000mg/L（以MLSS計），MLVSS/MLSS為0.75，污泥體積指數為115。將污水廠尾水接入反應器靜置至反應器內NO3--N低于檢測限時啟動反應器。實驗組進水中通過添加乙酸鈉增加進水COD，通過調整進水COD及水力負荷優化異養-硫自養反硝化協同工藝運行參數，考察異養-硫自養反硝化協同工藝中污水處理廠尾水NO3--N降解性能，具體實驗組運行工況如表1所示。對照組進水不添加有機物，其余運行條件與實驗組相同。對照組中主要發生的生物過程為硫自養反硝化，如式（1）所示。

1.4 分析方法

DO和ORP采用便攜式多功能水質儀測定。pH采用便攜式pH計測定。TN、NH3-N、NO3--N、NO2--N、SO42-等指標在測定前需要在8000r/min下離心10min，上清液通過0.45μm濾膜過濾。采用離子色譜法（Dionex1100）測定NO3--N、SO42-；采用紫外分光光度法測定NO2--N濃度；采用重鉻酸鉀氧化法測定COD；采用酸堿滴定法測定進出水的堿度。

通過擴增子測序技術對研究中涉及的底泥樣品進行16SrDNA的V3-V4區高通量測序。引物序列分別為341F（CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCTACGGGNGGCWGCAG）和805R（GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC）。利用R語言對數據進行生物信息學分析，利用Gephi等數據分析軟件分析微生物之間的相互關系。

1.5 統計分析

為估計測量的隨機誤差，所有樣品均設置3組平行實驗進行分析。使用SPSS22.0確定實驗數據平均值、標準偏差和方差分析（ANOVA）。使用單因素方差分析比較平均值，顯著性水平P<0.05。

2、結果與討論

2.1 反硝化脫氮性能

不同階段實驗組和對照組NO3--N變化如圖2（a）所示，不同階段實驗組和對照組NO2--N變化如圖2（b）所示。

由圖2（a）可知，對照組NO3--N的去除率分別達到了50.3%（Ⅰ階段，HRT=4h）、98.6%（Ⅱ階段，HRT=4h）、84.7%（Ⅲ階段，HRT=3h）和78.4%（Ⅳ階段，HRT=2h）；實驗組NO3--N的去除率分別達到了98.8%（Ⅰ階段，HRT=4h）、99.9%（Ⅱ階段，HRT=4h）、99.9%（Ⅲ階段，HRT=3h）和94.5%（Ⅳ階段，HRT=2h）。結果表明，添加碳源可有效提升NO3--N去除率。研究表明，添加碳源部分NO3--N可以通過異養反硝化作用被降解，有效促進反硝化效率。而當降低HRT時，受水流沖擊及NO3--N負荷增加的影響，部分NO3--N沒來得及參與反應就隨水流沖出。此外，值得注意的是，從第Ⅰ階段（COD為40mg/L）和第Ⅱ階段（COD為30mg/L）NO3--N的變化發現，當減少外加碳源含量時，反硝化作用明顯受到抑制，且COD減少10mg/L，出水NO3--N增加了3.3mg/L，根據異養反硝化反應可知，出水NO3--N應為5.3mg/L，結果表明在異養-硫自養協同反硝化過程中，優先發生異養反硝化反應，符合熱力學定理。

由圖2（b）可知，對照組NO2--N質量濃度分別達到了2.86mg/L（Ⅰ階段，HRT=4h）、0.18mg/L（Ⅱ階段，HRT=4h）、0.36mg/L（Ⅲ階段，HRT=3h）和1.64mg/L（Ⅳ階段，HRT=2h）；實驗組有外加碳源，NO2--N質量濃度分別達到了2.50mg/L（Ⅰ階段，HRT=4h）、0.10mg/L（Ⅱ階段，HRT=4h）、0.05mg/L（Ⅲ階段，HRT=3h）和0.72mg/L（Ⅳ階段，HRT=2h）。同時，在階段Ⅰ中實驗組的NO2--N最高積累質量濃度為4.5mg/L，在階段Ⅱ中實驗組的NO2--N最高積累質量濃度為5.8mg/L，明顯高于對照組中NO2--N最高積累質量濃度。結果可知，實驗組最終的NO2--N積累質量濃度低于對照組，然而在階段Ⅰ和Ⅱ過程中出現了實驗組NO2--N積累質量濃度高于對照組的現象。根據物料守恒定律，在反應器運行的第20天（階段Ⅰ），對照組和實驗組的NO3--N去除率分別為50.3%和98.8%，說明實驗組中添加了有機物促進了NO3--N的還原，然而由于NO2--N的還原是反硝化過程中的限速步驟，因此出現了短暫的NO2--N積累。在運行的第Ⅱ階段，由于實驗組中進水COD的減少，導致了C/N的降低，研究表明，碳源不足時反硝化反應不充分，會出現NO2--N積累的情況。因此，在運行第Ⅱ階段出現了比第Ⅰ階段更為嚴重的NO2--N積累情況，但隨著實驗組中微生物群落結構的不斷調整，NO2--N的積累情況逐漸消失。

2.2 出水SO42-質量濃度變化情況

不同階段實驗組和對照組出水SO42-的變化如圖3所示。

由圖3可知，對照組出水SO42-質量濃度分別達到了135.5mg/L（Ⅰ階段，HRT=4h）、192.3mg/L（Ⅱ階段，HRT=4h）、188.6mg/L（Ⅲ階段，HRT=3h）和160.9mg/L（Ⅳ階段，HRT=2h）；實驗組出水SO42-質量濃度分別為157.1mg/L（Ⅰ階段，HRT=4h）、168.7mg/L（Ⅱ階段，HRT=4h），154.8mg/L（Ⅲ階段，HRT=3h）和137.5mg/L（Ⅳ階段，HRT=2h）。結果可知，實驗組和對照組SO42-濃度變化均呈現隨著HRT的減少，出水SO42-質量濃度呈遞減的趨勢，且在第Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ階段添加碳源的條件下會減少出水SO42-質量濃度，而第Ⅰ階段中對照組出水SO42-質量濃度高于實驗組，其原因主要是第Ⅰ階段中實驗組中NO3--N的去除率明顯高于對照組，導致產生了更多的SO42-。根據硫自養反硝化反應可知，降解1mol/LNO3-需要生成1.05mol/LSO42-，根據圖2（a）可知，隨著HRT的降低，NO3--N去除率呈遞減的趨勢，因此出現隨著HRT的降低，出水SO42-質量濃度減少的現象。此外，還發現SO42-實際減少的質量濃度高于理論SO42-減少的質量濃度，有研究發現，硫自養反應器中多為厭氧菌，減少HRT會對反應器細菌產生沖擊，從而抑制了如硫歧化細菌、反硝化細菌等的活性，導致出水SO42-降低。

2.3 出水pH和堿度變化情況

對照組和實驗組出水pH和堿度（以CaCO3計）的變化如圖4所示。

由圖4可知，在運行期間，進水pH為7.48~7.62，對照組出水pH分別為7.4（Ⅰ階段，HRT=4h）、6.8（Ⅱ階段，HRT=4h）、6.8（Ⅲ階段，HRT=3h）和6.8mg/L（Ⅳ階段，HRT=2h）；實驗組添加碳源出水pH分別為7.4（Ⅰ階段，HRT=4h）、7.2（Ⅱ階段，HRT=4h）、7.2（Ⅲ階段，HRT=3h）和7.3mg/L（Ⅳ階段，HRT=2h），結果表明，添加碳源的實驗組出水pH高于對照組，根據異養反硝化反應可知，異養反硝化過程產生堿度，而根據硫自養反硝化反應可知，自養反硝化是消耗堿度的過程。對比實驗組第Ⅰ階段和第Ⅱ階段可知，在降低進水COD后，堿度的消耗量從29mg/L增加至38mg/L，進一步說明了自養反硝化是消耗堿度的過程，異養-硫自養協同工藝深度脫氮可實現酸堿的平衡。隨著HRT的降低，實驗組和對照組的堿度消耗均呈現先降低后升高的趨勢，NO3--N的去除率隨著HRT的降低而降低，理論上堿度的消耗也應該降低，然而在對照組中，分別為44mg/L（Ⅰ階段，HRT=4h）、62mg/L（Ⅱ階段，HRT=4h）、60mg/L（Ⅲ階段，HRT=3h）和61mg/L（Ⅳ階段，HRT=2h），結果表明對照組中總體堿度消耗量并沒有隨著HRT的降低而減少，說明該反應體系中存在其他消耗堿度的反應，如硫歧化反應。

2.4 微生物群落結構分析

為進一步解析異養-硫自養反硝化協同工藝深度脫氮的機理，分別在初始和4個階段對對照組和實驗組進行微生物群落結構分析。底泥的Alpha多樣性指數統計如表2所示。

由表2可知，每個樣品平均檢測了10754序列，覆蓋度都超過了98%，表明樣品中大部分序列被檢測到。Shannon指數代表物種多樣性，對照組Shan⁃non指數分別為8.214（Ⅰ階段，HRT=4h）、8.314（Ⅱ階段，HRT=4h）、8.324（Ⅲ階段，HRT=3h）和8.334（Ⅳ階段，HRT=2h）；實驗組Shannon指數分別為8.492（Ⅰ階段，HRT=4h）、8.529（Ⅱ階段，HRT=4h）、8.709（Ⅲ階段，HRT=3h）和8.705（Ⅳ階段，HRT=2h）。結果表明，添加碳源的實驗組物種豐富度比對照組更高，且隨反應器運行時間的增加，對照組和實驗組中物種豐富度逐漸增加，且在第Ⅳ階段趨于穩定。

Beta多樣性可以更加直觀地分析底泥中微生物群落結構變化，分別對對照組和實驗組在不同運行階段中的門、屬分類進行分析，結果如圖5所示。

由圖5（a）可知，檢測出6種主要細菌（門）分別為：Proteobacteria、Bacteroidetes、Spirochaetes、Chloro⁃flexi、Firmicutes和Acidobacteria。其中，Proteobacte⁃ria在對照組和實驗組中均為優勢菌門，在實驗組Proteobacteria豐度分別為45.5%（Ⅰ階段）、57.4%（Ⅱ階段）、71.5%（Ⅲ階段）和72.4%（Ⅳ階段）。對照組中Proteobacteria豐度分別為43.0%（Ⅰ階段）、53.5%（Ⅱ階段）、63.3%（Ⅲ階段）和65.3%（Ⅳ階段）。上述結果表明，Proteobacteria中含有大量與反硝化相關的微生物，脫氮的效果與Proteobacteria相關。

由圖5（b）可知，共發現13種優勢菌屬，其中包括異養反硝化菌、兼養反硝化菌、硫自養反硝化菌、硫酸鹽還原菌及硫歧化細菌等5類功能菌。異養反硝化菌包括Thauera、Acinetobacter和Georgfuch⁃sia；兼養反硝化菌包括Pseudomonas、Longi⁃linea、Ignavibacterium和Rhodanobacter；硫自養反硝化菌包括Sulfuritalea、Thiobacillus和Methyloversatilis；硫酸鹽還原菌包括Leptolinea和Syntrophus；硫歧化細菌包括Treponema。其中Longilinea相對豐度最高，在對照組中相對豐度分別為2.01%（Ⅰ階段）、1.51%（Ⅱ階段）、1.41%（Ⅲ階段）和1.39%（Ⅳ階段），在實驗組中相對豐度分別為4.21%（Ⅰ階段）、4.31%（Ⅱ階段）、4.39%（Ⅲ階段）和4.01%（Ⅳ階段），結果可知在實驗組中Longilinea相對豐度明顯高于對照組，Pseudomonas、Ignavibacte⁃rium和Rhodanobacter也表現出相似的變化規律。異養反硝化菌Thauera、Acinetobacter和Georg⁃fuchsia在添加碳源后也得到明顯的富集，其中在實驗組中Acinetobacter的相對豐度最高增加至4.24%（第Ⅰ階段）。總體而言，在不同階段下，對照組反硝化菌的相對豐度范圍為11.6%~13.5%，而實驗組反硝化菌的相對豐度范圍為20.6%~22.6%。結果表明，添加一定的碳源可有效刺激反硝化菌活性，從而提高反硝化效率。

2.5 微生物共現網絡

為深入解析自養-異養反硝化協同工藝中微生物的代謝機制，分別對實驗組和對照組建立了一個包含所有微生物數據的共現網絡（r>|0.4|和P<0.05），計算拓撲特征以描述微生物網絡的復雜交互程度，結果如圖6所示。

由圖6（a）可知，對照組中共生網絡由63個節點組成，由43條邊連接。網絡直徑、平均路徑長度、圖密度、連接部件、平均聚類系數和模塊化值分別為2、1.065、0.022、28、0.758和0.915。

由圖6（b）可知，實驗組中共生網絡由108個節點組成，由122條邊連接。網絡直徑、平均路徑長度、圖密度、連接部件、平均聚類系數和模塊化值分別為7、1.208、0.021、41、0.874和0.827。拓撲特征的結果顯示了細菌之間復雜的相互作用。模塊化程度>0.4，表明網絡具有模塊化結構。對比對照組和實驗組的拓撲特征發現，對照組平均路徑長度、網絡直徑明顯低于實驗組，說明在對照組中微生物間的相互作用更強，較強的微生物間相互作用說明微生物間需要更好地相互作用才能實現共生，有研究表明營養物質減少時微生物間的相互作用關系也會更加強烈。

圖6中每個模塊代表了多個復雜細菌相互作用的集合。在對照組中共現網絡有27個主要模塊。其中模塊Ⅰ、模塊Ⅱ、模塊Ⅲ和模塊Ⅳ的比例分別為7.94%、6.35%、4.76%和4.76%，其余模塊比例均為3.17%。其中模塊Ⅰ中主要是一些硫自養反硝化細菌，模塊Ⅱ主要是兼性反硝化細菌，模塊Ⅲ主要是異養反硝化細菌。在實驗組中共現網絡有12個模塊，其中模塊Ⅰ、模塊Ⅱ、模塊Ⅲ、模塊Ⅳ和模塊Ⅴ的比例分別為12.04%、4.63%、3.70%、3.70%和3.70%，其余模塊占比小于3%。其中模塊Ⅰ中主要是一些兼性反硝化細菌，模塊Ⅱ主要是硫自養反硝化細菌，模塊Ⅲ主要是異養反硝化細菌，模塊Ⅳ主要是硫酸鹽還原細菌。

介數中心性代表了一個OUT的控制潛力對網絡中其他OTUs相互作用的重要性。具有高介數中心性的OTU代表位于網絡核心的細菌，而圓圈的大小表征了介數中心性。在對照組中，Syntrophus（OTU2031）、Sulfuritalea（OTU155）和Thauera（OTU3316）的介數中心性明顯較高。在實驗組中，則主要為Pseudomonas（OTU993）、Longilinea（OTU1571）、Ignavi⁃bacterium（OTU418）和Rhodanobacter（OTU1883）。其中在對照組，介數中心性最高的點出現了硫歧化菌。而在實驗組，介數中心性最高的點則主要是兼性菌屬。

綜上，通過微生物間的互作網絡關系可知，異養-硫自養協同條件下硫歧化菌與其他菌的互作關系減弱，而硫自養反硝化菌與兼養反硝化菌之間的互作關系增強，說明在異養-硫自養協同條件下可有效避免硫歧化反應的發生，從而減少了出水SO42-的濃度。

3、結論

通過改善水力負荷條件及有機質投加量，最終確定HRT=3h，NO3--N負荷為2.70mg/（L·h），添加外源碳源為7mg/L時，出水NO3--N濃度低于最低檢測限，且沒有NO2--N積累。異養反硝化菌、兼養反硝化菌相對豐度的增加是添加碳源后反硝化效率提升的主要原因，同時在添加碳源后硫自養反硝化細菌Sulfuritalea、Thiobacillus和Methyloversatilis及硫歧化細菌Treponema豐度相對減少是出水SO42-減少的主要原因。異養-硫自養協同條件下硫歧化菌與其他菌的互作關系減弱，而硫自養反硝化菌與兼養反硝化菌之間的互作關系增強，進一步解釋了異養硫自養條件下出水SO42-減少的主要原因。本研究為異養-硫自養反硝化協同工藝深度脫氮提供了新的運行策略及理論依據。（來源：中國市政工程華北設計研究總院有限公司，天津市生態環境科學研究院，天津城建大學環境與市政工程學院，中節能（北京）節能環保工程有限公司）