微生物燃料電池（Microbialfuelcell，MFC）是以微生物為催化劑，將有機物中的化學能轉化為電能的生物電化學混合系統，具有原料來源廣、清潔環保等優點。在MFC系統完整的生物電化學過程中，有機底物（電子供體）在微生物代謝過程中氧化降解，產生電子和質子，電子首先經呼吸鏈傳遞到細胞膜，再由胞外電子轉移機制轉移到陽極，最終通過外電路傳遞到陰極，質子通過交換膜傳遞到陰極室，電子、質子與電子受體（O2、鐵氰化鉀等）發生還原反應，形成完整的回路。目前，MFC已被應用于廢水處理、環境修復、生物傳感器等領域。
制藥廢水具有成分復雜、有機物含量高、可生化性差等特點，屬于難處理的工業廢水，化學、物理等傳統處理方法難以順應當今綠色、低碳的發展趨勢。利用生物法處理制藥廢水具有經濟高效、不產生二次污染的優點。HongyiZHU等構建雙室MFC同步處理含恩諾沙星、Cu和Zn的合成廢水，該MFC的最大功率密度為（244.2±20.3）mW/m2，恩諾沙星降解率為（67.6±7.1）%，COD去除率為（87.3±1.5）%。嚴偉富等通過構建序批式雙室MFC處理10mg/L的氧四環素人工廢水，氧四環素的最高去除率可達99.0%，MFC的最大輸出電壓為0.55V左右。可見，通過MFC等生物電化學系統處理制藥廢水具有將廢水中蘊藏的能源以電能形式輸出的潛力，對污廢水凈化與能源回收具有重要意義。
生物強化技術通過向污泥、廢水等微生物群落中加入功能性菌株，改善原有系統的效能。生物強化技術應用于污水處理系統的優點：1）優化微生物群落結構；2）改善難降解污染物的降解效果；3）提高系統應對多變沖擊負荷的能力。如何引入功能性菌株，并使其在系統中有效定殖是生物強化技術的關鍵步驟。吳恒等利用污泥掛膜和菌劑掛膜方式處理畜禽養殖廢水，不同生物強化方式形成的生物膜存在差異，菌劑掛膜方式明顯縮短了系統的啟動時間，加大了對COD、NH4+-N、TN的去除率。李婷等在焦化廢水A2O工藝中采用生物強化技術，添加高效降解菌紅球菌后，COD、喹啉、吡啶的去除率明顯增加，系統內有機污染物降解菌成為優勢菌。
本研究以活性污泥為陽極底物，模擬苯酚制藥廢水為陽極基質，構建雙室MFC系統，添加電活性微生物S.oneidensisMR-1對MFC系統進行生物強化，通過向系統直接加入菌懸液（游離細胞）與固定細胞，對比分析功能性菌株投加形式對混合MFC系統產電性能、污染物去除效果、微生物菌群結構的影響。
1、材料與方法
1.1 實驗裝置
MFC系統包括電池裝置和電能采集裝置兩部分，見圖1。
電池裝置為傳統雙室構型，材質為有機玻璃，陰陽兩室有效體積均為118mL，中間隔以陽離子交換膜（CMI7000）。使用預處理后的碳氈（30mm×30mm×2mm）作為電極材料，陰陽電極用鈦絲（直徑為0.6mm）連接并用橡膠塞固定，兩電極以3cm間隔平行相對。用氮氣吹掃兩極室保持厭氧環境，外接1000Ω電阻構成閉合回路。雙室MFC運行溫度為（30±2）℃。
電能采集裝置包括數據采集器與電腦兩部分。數據采集器為藍博電池測試系統（LANBNTS，BT-2018C），通過與電腦連接實時顯示電能數據并記錄。參數設置：電壓范圍0~5V，采集精度1mV，采集頻率5min/次。
1.2 實驗接種物
1.2.1 厭氧污泥
活性污泥取自上海市某污水處理廠二沉池，用蒸餾水淘洗3遍，并經200目篩網過濾雜質，隨后加入適量陽極液，厭氧條件下置于磁力攪拌器室溫下攪拌3~5d，靜置分層去上清液，密封備用。本實驗雙室MFC系統均添加厭氧污泥，厭氧污泥與陽極室的體積比為1∶4。
1.2.2 實驗用水
陽極液組成：20mmol/L乳酸鈉、1.42g/L醋酸鈉、0.31g/LNH4Cl、0.13g/LKCl、2.88g/LKH2PO4、6.57g/LK2HPO4、10mL/L微量元素溶液和10mL/L維生素溶液。用葡萄糖調節進水COD。
模擬制藥廢水組成：苯酚質量濃度100mg/L，另外加入20mmol/L乳酸鈉、0.31g/LNH4Cl、0.13g/LKCl、2.88g/LKH2PO4、6.57g/LK2HPO4、10mL/L微量元素溶液和10mL/L維生素溶液。用葡萄糖調節進水COD。
陰極溶液：0.1mol/L鐵氰化鉀溶液
1.2.3 產電菌種
S.oneidensisMR-1購于中國典型培養物保藏中心（CCTCC）。
S.oneidensisMR-1菌液培養：無菌條件下，用接種環挑取活化后的S.oneidensisMR-1單菌落，接入滅菌冷卻后的LB培養基中，在30℃、120r/min條件下培養至對數生長末期。LB液體培養基由10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物和10g/LNaCl組成。
S.oneidensisMR-1菌懸液制備：先將菌液在4000r/min條件下離心15min，再用無菌緩沖液洗滌并重懸。
1.3 MFC系統的接種與運行
實驗涉及的3組MFC系統包括不添加產電菌的雙室MFC、游離態細胞雙室MFC和固定化細胞雙室MFC，依次標記為MFC1、MFC2和MFC3。
本實驗選用的陰陽電極材料均為碳氈，使用之前需經酸性重鉻酸鉀浸泡（60℃水浴加熱30min）與馬弗爐預處理（450℃加熱30min），預處理后的碳氈可直接作為電極。其中，MFC3的碳氈陽極需進一步處理，制備方法為將預處理后的碳氈連接鈦絲，與3mLS.oneidensisMR-1液體菌液共同加入滅菌后的LB培養基，在35℃、120r/min條件下培養7d。MFC2加入產電菌的方式為向陽極室添加S.oneidensisMR-1菌懸液5mL。MFC1的接種物僅為厭氧污泥。通過調整OD600將3組MFC裝置的陽極液生物量保持一致。3組MFC裝置的陰極液均為0.1mol/L鐵氰化鉀溶液，為保證充足的電子受體，當陰極液由黃色變為淺綠色時更換陰極液。
在啟動階段，將陽極液加入MFC陽極室，陽極室初始COD在（2000±100）mg/L，連續兩個周期最大電壓相近視為啟動成功。在正式運行階段，將陽極液更換為模擬制藥廢水，電壓降至50mV以下視為一個周期結束，需更換陰陽電極液持續運行，每周期陽極初始COD保持在（3000±100）mg/L，連續運行3個周期。
1.4 數據測定與分析
1.4.1 產電性能
電化學性能：電壓U通過電能采集裝置采集；電流I根據式（1）歐姆定律計算；電流密度IA根據式（2）計算；功率密度（PA）根據式（3）計算；極化曲線與功率密度由外電阻法測定，外接電阻箱由高到低改變電阻值，依次為10000、8000、6000、4000、2000、1000、800、600、400、200、100Ω，每個阻值下運行15~20min并記錄；電池內阻r由極化曲線斜率求得；陽極生物膜的循環伏安曲線（CV）通過三電極體系測得，掃描速度為10mV/s，掃描電壓為-0.8~0.4V，其中對電極為鉑絲電極，參比電極為Ag/AgCl電極，工作電極為陽極碳氈。
式中：I——電流，mA；U——電壓，mV；R——電阻，Ω；IA——電流密度，mA/m2；A——陽極面積，m2；PA——功率密度，mW/m2。
1.4.2 污染物去除效果
苯酚采用四氨基安替比林法測定；COD與NH4+-N根據國標法測定；庫侖效率（CE）根據式（4）計算。
式中：CE——庫侖效率；M——O2的摩爾質量，32g/mol；t——周期運行時間，s；I——t時刻的電流，mA；V——陽極室體積，mL；F——法拉第常數，96485C/mol；ΔCOD——運行始末的COD變化量，g/L。
1.4.3 陽極生物膜形貌表征
陽極碳氈經戊二醇溶液固定、磷酸鹽緩沖液沖洗、梯度乙醇溶液脫水、冷凍干燥、噴金處理后，使用掃描電子顯微鏡（ZEISSGeminiSEM300）觀測陽極生物膜形貌。
1.4.4 陽極生物膜微生物群落結構分析
運行結束后，將陽極碳氈放入PBS無菌緩沖液中搖床振蕩30~60min，將陽極碳氈取出，先用兩層無菌紗布過濾去除雜質，再用0.22µm硝酸纖維素濾膜過濾，將濾膜送檢16SrRNA測序。
2、結果與討論
2.1 產電性能分析
各MFC系統的啟動電壓、正式運行輸出電壓、極化曲線與功率密度、CV曲線對比情況見圖2。
各MFC系統啟動過程分為兩個階段，各階段電壓變化如圖2（a）所示。在第Ⅰ階段，MFC1、MFC2、MFC3達到最大電壓所需時間分別為108、93、82h，對應的最大電壓分別為325、452、517mV。為進一步在陽極上富集優勢產電菌群及提升各裝置產電性能，在電壓下降階段向各裝置陽極分別加入1g葡萄糖以補充碳源。在第Ⅱ階段，電壓迅速上升，MFC1、MFC2、MFC3的最大電壓分別升高至402、528、618mV，且最大電壓持續時間明顯增加，視為各MFC系統啟動成功。待電壓降至100mV以下，將陽極液更換為模擬制藥廢水持續運行3周期。
在正式運行階段，各實驗組輸出電壓隨時間變化過程如圖2（b）所示。可觀察到，由于3組裝置的陽極中首次加入制藥廢水，3組MFC裝置處于適應階段，在第Ⅰ周期MFC1、MFC2、MFC3的最大輸出電壓均低于啟動過程的第Ⅱ階段，分別為351、512、572mV。在第Ⅱ、Ⅲ周期，隨陽極表面生物膜逐漸成熟，微生物傳遞到陽極的電子數量增加，系統趨于穩定，各實驗組最高輸出電壓持續增加，均在第Ⅲ周期取得最大電壓，且在較高電壓下持續時間增長，MFC1、MFC2、MFC3輸出電壓分別為384、535、633mV。由此可以看出，在本研究制備的3組MFC裝置中，以制藥廢水為陽極液用于發電是可行的。
在第Ⅲ周期測得各裝置極化曲線與功率密度曲線，如圖2（c）所示。MFC1、MFC2、MFC3的最大功率密度分別為280.9、477.9、582.7mW/m2，內阻分別為516.7、459.2、398.8Ω，開路電壓分別為674、808、836mV。另外，可觀察到在改變外電阻過程中，當外接電阻由萬歐、千歐級降低到百歐級時，由于陽極微生物對底物的利用存在阻力以及電子傳遞過程存在阻力，微生物無法提供足夠的電子以供產電，導致產電量迅速減少，功率密度曲線與極化曲線中出現回折。
為進一步探究陽極生物膜的電活性，對比分析各實驗組碳氈陽極的循環伏安曲線（CV），如圖2（d）所示。相比MFC1，MFC2、MFC3陽極生物膜的氧化還原峰較明顯，峰值電流分別為3.2、3.7mA。其中，MFC3的峰值電流最高，CV曲線積分面積最大且對稱性較好，說明固定細胞MFC陽極生物膜活性較高，電子轉移效果及對稱性更佳。
上述結果表明，添加產電菌的兩組MFC的產電性能較僅添加污泥的雙室MFC產電性能明顯提升，且啟動時間縮短，MFC3產電性能最佳，其最大功率密度較MFC1、MFC2分別提高了107.4%、21.9%。在陽極室中添加產電菌S.oneidensisMR-1提升了MFC的產電性能，其促進系統產電的原理為S.oneidensisMR-1內膜、外膜和周質空間存在的多種氧化還原蛋白能通過直接和間接電子傳遞過程進行有氧/無氧呼吸，并分泌核黃素作為參與胞外電子轉移過程的氧化還原介體，提升胞外電子轉移能力，促進陽極氧化反應，進而提升系統的氧化還原反應速率。
2.2 污染物去除效果分析
為測定不同MFC系統陽極室污染物降解效果及間接掌握微生物菌群的代謝情況，在正式啟動后對3組MFC裝置陽極室COD、NH4+-N、苯酚、庫侖效率進行3周期監測，各周期污染物去除率見表1，3周期內污染物平均去除效果及各周期庫侖效率見圖3。
COD能夠反映MFC中有機物降解情況。由圖3（a）可見，3周期內MFC1、MFC2、MFC3平均進水COD分別為3055.3、3019.3、3028.7mg/L，平均出水COD分別為1078.0、772.3、530.7mg/L，平均COD去除率分別為64.7%、74.4%、82.5%，MFC3的平均COD去除率明顯高于MFC1和MFC2，說明固定細胞MFC對有機底物的代謝能力最強。
由圖3（b）可見，3周期內MFC1、MFC2、MFC3的平均NH4+-N去除率相差不大，分別為70.0%、72.7%、74.1%，NH4+-N能否在生物電化學系統中直接作為電子受體尚無定論，陽極室的NH4+-N主要通過厭氧氨氧化作用、厭氧反硝化作用、氨氮遷移作用去除。
由圖3（c）可見，3周期內MFC1的平均苯酚去除率最低，為74.6%，而MFC2和MFC3的平均苯酚去除率相近，分別為80.5%、82.0%。通過MFC降解含苯酚廢水是可行的，相關研究表明與單一苯酚燃料相比，以苯酚和葡萄糖混合物為燃料更易促進MFC系統的產電性能。
庫侖效率（CE）能夠反映各周期底物基質轉移到陽極的實際電子數量與理論電子數量之間的關系，是評價MFC對廢水處理效果的重要指標之一。由圖3（d）和表1可見，MFC1的庫侖效率先升高后下降，而MFC2與MFC3的庫侖效率在第Ⅱ、Ⅲ周期內均升高，MFC1、MFC2、MFC3在3周期內的平均庫侖效率分別為16.3%、23.2%、26.6%。MFC2、MFC3的底物有效產電利用率較高，產電菌S.oneiden⁃sisMR-1對MFC系統起到了生物強化作用，加強了系統產電性能與污染物去除能力。
在第Ⅲ周期，MFC系統中各污染物Ct/C0隨時間變化的趨勢見圖4。
相較于MFC1，MFC2和MFC3的各污染物去除速率均有明顯提升，MFC3的各污染物去除速率最高。經一級反應動力學擬合，MFC3去除COD、NH4+-N、苯酚的一級反應動力學速率常數分別為0.18（R2=0.99）、0.13（R2=0.97）、0.16d-（1R2=0.98）。
通過對比污染物去除率與去除速率得出，固定化細胞MFC對污染物去除效果最佳。ZhuangzhuangLIU等從豬糞中分離出1株新型四環素脫除菌，該菌株在游離態對四環素最高去除率為71.62%，使用羧甲基纖維素和聚多巴胺固定活細胞后，四環素去除率達到91.16%。游離態菌株易與原有菌群競爭，導致存活率較低，影響污染物去除效果，而固定化細胞技術能有效提高細胞密度及活性，更適用于降解復雜污染物。在本實驗3周期的測試中，固定化細胞MFC的產電性能與污染物去除能力最佳，與其他相關研究（表2）對比，固定化細胞技術應用于MFC系統中具有在去除復雜污染物同時產生電能的潛力。
2.3 陽極生物膜形貌表征
為進一步掌握陽極微生物附著情況，對陽極生物膜進行SEM形貌表征，見圖5。
圖5（a）為僅經重鉻酸鉀溶液與馬弗爐加熱預處理的空白碳氈，其表面光滑、縫隙大，為微生物的附著提供了條件。隨MFC成功啟動與運行，微生物在陽極表面富集成膜，圖5（b）、圖5（c）和圖5（d）分別為MFC1、MFC2和MFC3的陽極形貌圖，MFC2、MFC3的陽極比表面積與粗糙度較大，有利于微生物的附著，附著微生物的種類更為豐富。
2.4 陽極生物膜微生物群落結構分析
陽極生物膜菌群結構是影響污染物去除和電能產生的重要因素，陽極微生物群落之間存在協同作用，具有不同功能的微生物（如產電菌、水解細菌與發酵細菌）在系統中共存，降解污染物并獲得電能。陽極生物膜在門水平和屬水平下的微生物結構組成見圖6。
由圖6可知，與不添加產電菌的MFC1相比，添加游離態細胞的MFC2、固定化細胞的MFC3的陽極生物膜細菌群落結構發生了一定變化。在門水平下，3組裝置陽極生物膜的前4種優勢菌門均包括Proteobacteria（變形菌門）、Bacteroidota（擬桿菌門）、Desulfobacterota（脫硫桿菌門）和Firmicutes（厚壁菌門），是常見于MFC系統的電活性菌門，可進行厭氧消化并增強系統產電性能，這4種優勢菌門在MFC1、MFC2、MFC3中的總相對豐度分別為69.63%、78.13%、83.23%，且各MFC系統4種優勢菌門構成比例有所不同。
在屬水平下，變形菌門中典型的電活性微生物Geobacter（地桿菌屬）、Desulfovibrio（脫硫弧菌屬）、Citrobacter（檸檬酸桿菌屬）、Shewanellaceae（希瓦氏菌屬）在陽極生物膜上得到了富集。其中，Geobacter在MFC1、MFC2、MFC3中的相對豐度分別為7.40%、8.92%、10.74%；Desulfovibrio在MFC1、MFC2、MFC3中的相對豐度分別為6.36%、7.91%、11.66%；Citrobacter在MFC1、MFC2、MFC3中的相對豐度分別為3.53%、1.84%、5.29%；MFC3中She⁃wanellaceae的相對豐度最高，為9.72%，說明固定化技術有效提高了MFC中Shewanellaceae的密度及活性。發酵細菌Clostridium_sensu_stricto_1（梭狀芽胞桿菌）、Bacteroides（擬桿菌）在各實驗組的陽極生物膜上得到富集，其作用是降解有機物質，為電活性微生物提供碳源。在陽極生物膜上還檢測到Magneto⁃spirillum（α-變形菌綱磁螺菌屬），Magnetospirillum的特點是合成磁小體和進行趨磁運動，具有多樣化的生理代謝過程，但其在MFC系統扮演的角色尚且不明。Brevundimonas（短波單胞菌屬）具有反硝化能力，在MFC1、MFC2、MFC3中的相對豐度分別為2.10%、2.53%、4.36%，證明了反硝化是陽極氮源去除的途徑之一。
3、結論
1）將產電菌S.oneidensisMR-1以游離態與固定化形式加入雙室MFC同步處理模擬苯酚制藥廢水，S.oneidensisMR-1加快了電子傳遞與氧化還原反應速率，提升了對污染物的處理效果與發電性能，對MFC系統起到了生物強化作用，為廢水中污染物的去除和能源轉化提供了新思路。
2）固定化細胞雙室MFC產電性能與污染物去除效果均優于游離態細胞雙室MFC。在3周期的連續運行下，固定化細胞雙室MFC系統的最大輸出電壓、最大功率密度、平均COD去除率、平均庫侖效率分別為633mV、582.7mW/m2、82.5%、26.6%，與游離態細胞雙室MFC相比分別提升了18.7%、21.9%、10.9%、14.7%，固定化細胞技術具有在MFC中實際應用的潛力。
3）固定在雙室MFC陽極的S.oneidensisMR-1與系統中原有菌群起到了協同作用，陽極生物膜上富集到促進發電與底物利用的混合菌群。微生物群落結構結果顯示，固定化細胞雙室MFC的陽極生物膜上電活性細菌與發酵細菌得到富集，優勢菌門為Proteobacteria、Bacteroidota、Firmicutes、Desulfobacterota，優勢菌屬為Desulfovibrio、Bacteroides、Clostridium_sensu_stricto_1、Geobacter。（來源：上海應用技術大學化學與環境工程學院）
