1 引言

　　木質(zhì)素及其降解物是造紙廢水的重要成分, 占總CODCr的50%左右.由于木質(zhì)素具有復(fù)雜的苯環(huán)結(jié)構(gòu), 因此, 傳統(tǒng)生物處理對(duì)其降解耗時(shí)長(zhǎng)、去除率低.目前, 已經(jīng)篩選到的降解木質(zhì)素的細(xì)菌大多是好氧細(xì)菌, 主要集中在放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)等, 部分能在厭氧情況下生長(zhǎng).純培養(yǎng)功能菌則對(duì)菌種培養(yǎng)條件的要求較高、重復(fù)性較差, 降解過(guò)程非常緩慢.

　　研究表明, 外加直流電場(chǎng)能有效提高微生物強(qiáng)化難降解物質(zhì)(苯酚、對(duì)氯硝基苯、茜素黃R、2, 4-二氯苯酚等)的處理效率, 其影響因素主要包括環(huán)境條件(如溫度、pH、氧氣等)、電場(chǎng)作用方式(如電流密度和持續(xù)時(shí)間)和反應(yīng)器構(gòu)型等.不同功能菌適宜的溶解氧條件不同, 較高的溶解氧可以提高好氧微生物活性和促進(jìn)有機(jī)物循環(huán)功能菌群的增殖)利用生物電化學(xué)系統(tǒng)(BET)處理實(shí)際制漿造紙廢水, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在pH=7時(shí), 與厭氧處理(AnT)相比, BET系統(tǒng)的COD(BET/AnT, 55%/51%)、硝酸鹽(33.5%/19.1%)、磷酸鹽(33%/19%)和硫酸鹽(58%/41%)去除率更高.利用電-活性污泥耦合技術(shù)處理酸性大紅GR, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在15 mA微電流條件下電-生物技術(shù)能克服50 mg·L-1酸性大紅GR對(duì)好氧生物處理的抑制作用.目前采用BET系統(tǒng)處理木質(zhì)素廢水的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道.已有研究為L(zhǎng)iu等利用活性污泥反應(yīng)器處理木質(zhì)素模擬廢水, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 木質(zhì)素去除率低于20%, 并且好氧微生物無(wú)法完全降解木質(zhì)素.因此, 是否可采用電-活性污泥法有效強(qiáng)化木質(zhì)素降解仍有待研究.

　　直流電場(chǎng)會(huì)導(dǎo)致微生物生理特性、細(xì)胞膜磷脂組成和群落結(jié)構(gòu)的差異.She等研究發(fā)現(xiàn), 陰極產(chǎn)生的H2可能作為質(zhì)子供體可提高脫氫酶系統(tǒng)活性, 從而導(dǎo)致NAD/NADH平衡的轉(zhuǎn)化.Velasco-Alvarez等的研究表明, 低電流(0.42 mA·cm-2, 24 h)能促進(jìn)Aspergillus niger的分解代謝, 減少生物量的產(chǎn)生, 總ATP含量瞬間升高, 從而導(dǎo)致十六烷的生物降解率提高約15%.Wick等利用PLFA技術(shù)研究了暴露于恒定電場(chǎng)(1.4 V·cm-1、1.0 mA·cm-2)中的土壤微生物群落的變化, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 外加電場(chǎng)8 d后, 飽和脂肪酸含量受到顯著影響(p < 0.05), 電極附近的樣品與中心土壤樣品相比, 飽和直鏈脂肪酸的含量更高, 這可能是由于電場(chǎng)對(duì)流動(dòng)細(xì)胞膜的脅迫作用.目前, 有關(guān)電場(chǎng)脅迫條件下微生物群落結(jié)構(gòu)的研究主要集中在極板上附著的生物膜方面, 而在懸浮的活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)的電場(chǎng)影響方面較少涉及.陽(yáng)極生物膜中Shewanella(Kim et al., 1999)、Geobacter(Bond et al., 2003)、Pseudomonas、Desulfovibrio等菌屬都曾被報(bào)道具有很高的電子傳遞能力.Ailijiang等利用生物電化學(xué)反應(yīng)器處理模擬苯酚廢水, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在間歇直流電場(chǎng)運(yùn)行方式下, 生物膜中Zoogloea和Desulfovibrio等菌屬的相對(duì)豐度顯著提高.電極生物膜功能微生物包括能夠進(jìn)行細(xì)胞外電子傳遞的功能菌和其他協(xié)作的功能菌.與生物膜法相比, 活性污泥法群落結(jié)構(gòu)具有明顯的差異性, 且活性污泥處于曝氣攪動(dòng)之中, 特定功能微生物難以富集, 因此, 直流電場(chǎng)對(duì)懸浮的活性污泥微生物的影響與電極-生物膜法不同.

　　基于此, 本研究以溶解態(tài)木質(zhì)素模擬廢水為研究對(duì)象, 考察活性污泥反應(yīng)器、電極生物膜反應(yīng)器及電極生物膜-活性污泥反應(yīng)器中木質(zhì)素廢水的處理效能, 探究不同電流強(qiáng)度對(duì)懸浮污泥生理特性的影響, 并利用磷脂脂肪酸(PLFA)及16S rRNA基因高通量測(cè)序研究不同電流強(qiáng)度下微生物細(xì)胞膜磷脂組成和群落結(jié)構(gòu)的差異, 以期為電場(chǎng)強(qiáng)化技術(shù)處理木質(zhì)素廢水的工程應(yīng)用提供理論依據(jù).

　　2 材料與方法

　　2.1 反應(yīng)器的啟動(dòng)與運(yùn)行

　　實(shí)驗(yàn)包括3個(gè)平行運(yùn)行的SBR反應(yīng)器, 反應(yīng)器有效體積為2 L, 其中, R1為常規(guī)SBR反應(yīng)器(對(duì)照組, 無(wú)電流); R2、R3反應(yīng)器內(nèi)設(shè)固定在壁上的卡槽以固定電極, 所用電極為一對(duì)石墨電極, 有效面積為60 cm2(長(zhǎng)20 cm、寬5 cm、厚6 mm), 極板距離7 cm, 兩電極分別與直流穩(wěn)壓電源的正、負(fù)極連接, R2內(nèi)無(wú)接種污泥, R3內(nèi)含接種污泥.R1、R3接種污泥取自南京某污水處理廠(chǎng), 污泥濃度控制在3000 mg·L-1.R2每天換水時(shí)清理懸浮污泥(污泥濃度 < 30 mg·L-1).為了強(qiáng)化難降解有機(jī)物木質(zhì)素的降解, 加入易降解的葡萄糖為共基質(zhì).實(shí)驗(yàn)室配制的模擬廢水的進(jìn)水COD為530 mg·L-1(COD(木質(zhì)素磺酸鈉): COD(葡萄糖)=1: 1.2), 由300 mg·L-1的C6H12O6及200 mg·L-1木質(zhì)素磺酸鈉組成, 此外每升廢水包含117.2 mg NH4Cl、26.9 mg KH2PO4、55 mg MgSO4·7H2O、25 mg CaCl2·2H2O和0.6 mL微量元素混合液.其中, 每升微量元素混合液包含1.5 g FeCl3·6H2O、0.18 g KI、0.12 g ZnSO4·7H2O、0.15 g H3BO3、0.12 g MnCl2·4H2O、0.15 g CoCl2·6H2O、0.03 g CuSO4·5H2O、0.06 g Na2MoO4·2H2O和10 g EDTA-4Na.反應(yīng)器運(yùn)行周期為24 h(包括進(jìn)水0.5 h, 曝氣22 h, 沉淀1 h, 出水0.5 h), 排水比為1/2, 污泥負(fù)荷為0.12 kg·kg-1·d-1(以每kg MLSS中的COD(kg)計(jì)), 污泥停留時(shí)間為10 d, 進(jìn)水pH為7.6±0.1, 溶解氧控制在3~5 mg·L-1, 溫度維持在(25±2) ℃.

　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法

　　R1為不加電流的對(duì)照反應(yīng)器, R2、R3反應(yīng)器兩電極分別與直流穩(wěn)壓電源的正、負(fù)極連接且以10 mA的弱電流進(jìn)行馴化, 具體運(yùn)行方式如下：1~41 d(第1階段), R2、R3外加電流10 mA; 42~53 d(第2階段), 外加電流20 mA; 54~65 d(第3階段), 外加電流30 mA; 66~77 d(第4階段), 外加電流40 mA; 78~89 d(第5階段), 外加電流50 mA; 90~101 d(第6階段), 外加電流60 mA.同時(shí)在每個(gè)階段對(duì)R1、R3反應(yīng)器中懸浮污泥進(jìn)行微生物活菌比、三磷酸腺苷(ATP)、比耗氧速率(SOUR)、酶活、PLFA、微生物群落結(jié)構(gòu)等的測(cè)定.

　　2.3 分析項(xiàng)目和方法 2.3.1 常規(guī)指標(biāo)測(cè)定

　　污泥濃度(MLSS)、COD、NH3-N、TN的測(cè)定均參照國(guó)標(biāo)法.微生物活菌比采用LIVE/DEAD© Bacteria Viability Kit (BacLightTM, MolecuLar Probes, Invitrogen L7012)染色法測(cè)定, 結(jié)果用活菌百分比表示.ATP采用熒光素-熒光素酶法測(cè)定.比耗氧速率(SOUR)的測(cè)定參照Hao等的方法.

　　2.3.2 木質(zhì)素磺酸鈉濃度測(cè)定

　　紫外分光光度法(UV)是用來(lái)測(cè)定木質(zhì)素及其衍生物的常用方法, 木質(zhì)素及木材提取物中的酚羥基離子在280 nm處存在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的吸收峰.因此, 在制漿造紙行業(yè)中該吸收峰通常被用來(lái)指示木質(zhì)素及大部分木材提取物的濃度.通過(guò)實(shí)驗(yàn)室分析, 本實(shí)驗(yàn)中所用的木質(zhì)素磺酸鈉溶液在紫外276 nm(UV276)處存在一個(gè)穩(wěn)定的吸收峰.當(dāng)木質(zhì)素濃度低于0.2 g·L-1時(shí), 其濃度與吸光度呈現(xiàn)出明顯的線(xiàn)性關(guān)系.

　　2.3.3 木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(LiP)測(cè)定

　　采用黃丹蓮等報(bào)道的方法, 取0.6 mL黎蘆醇溶液(10 mmol·L-1)、1.2 mL酒石酸緩沖液(250 mmol·L-1, pH=3.0)與1.2 mL粗酶液混勻, 在30 ℃下, 于反應(yīng)液中加入60 μL H2O2溶液(20 mmol·L-1)啟動(dòng)酶促反應(yīng), 并在310 nm波長(zhǎng)下測(cè)定30 min前后反應(yīng)液吸光度的變化.一個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘氧化黎蘆醇產(chǎn)生1 μmol黎蘆醛所需的酶量.

　　2.3.4 細(xì)胞膜磷脂脂肪酸分析

　　PLFA的提取方法根據(jù)Balser等報(bào)道的方法進(jìn)行了適當(dāng)修正, 通過(guò)對(duì)活性污泥樣品的提取、分離及皂化、甲基化、萃取等一系列前處理后, 將提取出的PLFA采用安捷倫7800A氣相色譜進(jìn)行測(cè)定.氣相色譜各參數(shù)由MIDI Sherlock程序設(shè)置調(diào)用.

　　2.3.5 微生物群落結(jié)構(gòu)檢測(cè)

　　采用16S rRNA基因高通量測(cè)序進(jìn)行檢測(cè).污泥樣品DNA的提取及PCR擴(kuò)增采用周莉娜等報(bào)道的方法.經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物后, 采用純化試劑盒(Cycle-Pure Kit, OMEGA Bio-tek, Inc.)純化后送至江蘇中宜金大分析檢測(cè)有限公司進(jìn)行Miseq測(cè)序.

　　2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

　　常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)的數(shù)據(jù)處理采用Origin 9.2軟件, 微生物活菌比結(jié)果采用ImageJ軟件進(jìn)行分析, Miseq數(shù)據(jù)經(jīng)Sickle及Mothur降噪后, 通過(guò)RDP分類(lèi)處理.采用SPSS statistics 22.0.0分析軟件進(jìn)行單因素方差分析(AVONA), 用于檢驗(yàn)不同物種對(duì)于各項(xiàng)環(huán)境因素是否具有顯著性差異, 當(dāng)p < 0.05時(shí), 認(rèn)為具有顯著性差異.PCA與RDA分析采用Canoco軟件.

　　3 結(jié)果與討論 3.1 電流強(qiáng)度對(duì)反應(yīng)器運(yùn)行效能的影響

　　反應(yīng)器運(yùn)行情況如圖 1所示.圖 1a反映了反應(yīng)器進(jìn)、出水COD情況, 進(jìn)水COD為(530.0±7.9) mg·L-1, 第1~41 d(第1階段)時(shí), R1、R3的平均COD去除率分別為73.71%±2.39%和78.88%±1.75%(p < 0.05).第1 d時(shí), R2反應(yīng)器的COD去除率僅為25.16%, 此時(shí)由于反應(yīng)器中無(wú)接種污泥, 因此, COD的去除僅為10 mA電流的作用.第5 d開(kāi)始, R2反應(yīng)器的COD去除率升到65.16%, 此時(shí)觀察到R2反應(yīng)器的極板上已有少量微生物附著.第42~53 d(第2階段)與54~65 d(第3階段)時(shí), 電流由20 mA升高到30 mA, 與R1相比, R2、R3的COD去除率分別提高了2%(p < 0.05)和7%(p < 0.05), 出水COD分別為(139.72±5.75)和(112.47±6.06) mg·L-1; 第66 d電流再次升高后, R2與R3的COD去除率開(kāi)始下降, 最終與R1的COD去除率基本一致.

 　　反應(yīng)器木質(zhì)素磺酸鈉進(jìn)出水濃度如圖 1b所示.1~20 d時(shí), 由于R1、R3中活性污泥對(duì)木質(zhì)素的去除存在污泥吸附作用, 第1 d木質(zhì)素去除率分別快速地達(dá)到44.37%和72.51%. 10 mA條件下R3具有更高的木質(zhì)素去除率, 可能是由于電場(chǎng)使污泥吸附性能提高.隨著污泥吸附量逐漸達(dá)到飽和及微生物的降解, 第20 d木質(zhì)素去除率分別達(dá)到12.59%和23.99%.據(jù)報(bào)道, 以葡萄糖為碳源, 不同溶解氧的活性污泥工藝啟動(dòng)初期(1~10 d), COD去除率由75%上升到90% , 由此推測(cè), R1、R3啟動(dòng)期(1~20 d)共基質(zhì)葡萄糖與木質(zhì)素的去除呈相反趨勢(shì).由于R2無(wú)接種污泥, 因此, 1~5 d的情況與電解反應(yīng)器相近, 木質(zhì)素平均去除率為3.73%±2.66%.靳培培研究了進(jìn)水苯酚濃度為100 mg·L-1, 電場(chǎng)強(qiáng)度分別為0、1.0、2.0、3.0、4.0、7.5 V·cm-1時(shí)的電化學(xué)反應(yīng)器(無(wú)活性污泥、無(wú)電極生物膜)對(duì)苯酚的降解率, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 降解率分別為2.71%、3.88%、4.84%、7.46%、9.33%、12.79%.可見(jiàn)電化學(xué)反應(yīng)對(duì)污染物的降解具有一定的作用, 但降解效率較低.對(duì)照組R1的木質(zhì)素平均去除率(第31~101 d的平均值)為15.02%±0.80%. R3的木質(zhì)素去除率始終高于R2, 且均隨外加電流的增大呈先升后降趨勢(shì), 在30 mA時(shí)木質(zhì)素去除率均最大.10 mA時(shí), R3穩(wěn)定后木質(zhì)素的去除率為26.71%±0.39%, 是R1的1.78倍(p < 0.05);而R2(13.44%±1.32%)低于對(duì)照組R1 (p < 0.05).30 mA時(shí), R3、R2反應(yīng)器的木質(zhì)素去除率達(dá)到最大, 分別為30.19%±0.47%和20.69%±0.54%, 分別為R1的2.01倍(p < 0.05)和1.38倍(p < 0.05).電流增加到40 mA時(shí), 木質(zhì)素去除率開(kāi)始下降, 分別為22.81%±1.76%(R3)和14.16%±0.85%(R2); 60 mA時(shí)兩個(gè)反應(yīng)器的木質(zhì)素去除率均低于R1.因此, 一定的外加電流可以提高活性污泥對(duì)木質(zhì)素的去除率, 30 mA為降解木質(zhì)素的最佳電流取值.

　　圖 1c所示為電流作用對(duì)NH3-N去除的影響.R1、R3的NH3-N去除率隨時(shí)間變化趨勢(shì)一致, 第1~5 d均在68.70%~99.93%范圍內(nèi)小幅波動(dòng), 隨后階段反應(yīng)器的NH3-N去除率均高于99%, 說(shuō)明活性污泥存在條件下氨氮快速氧化, 不受電流影響.R2反應(yīng)器在第1階段NH3-N去除率波動(dòng)較大, 平均為43.03%±17.32%, 其出水氨氮濃度由第1 d的26.72 mg·L-1快速降低到第5 d的14.66 mg·L-1.這是由于前5 d未采用緩沖溶液控制反應(yīng)器pH, 反應(yīng)器水質(zhì)偏酸(pH≈5), 同時(shí)R2極板生物膜量較少, 推測(cè)氨氮在陽(yáng)極上發(fā)生電化學(xué)氧化反應(yīng)形成氮?dú)馊コ?6·OH+2NH3→N2+6H2O (Marselli et al., 2003)).周明明等報(bào)道酸性條件下氨氮的去除率比中性條件高.第5 d后, 調(diào)控溶液pH值為中性, 氨氮的去除率下降.隨著第1階段R2電極生物膜掛膜完成, 第41 d, R2反應(yīng)器(10 mA)的NH3-N去除率達(dá)到99%以上, 隨后階段均維持在該水平, 出水氨氮濃度為(0.20±0.13) mg·L-1.龐朝暉等利用短程電極生物膜處理養(yǎng)殖廢水中的高氨氮, 進(jìn)水氨氮濃度為400 mg·L-1時(shí), 在100 mA以?xún)?nèi)氨氮的去除率隨電流的增加而明顯提高, 且氨氮去除率均高于90%.

　　圖 1d所示為T(mén)N進(jìn)、出水濃度隨時(shí)間的變化.整個(gè)過(guò)程中, R1與R3的TN去除率變化趨勢(shì)基本一致(除第6階段顯著差異), 說(shuō)明R3的TN去除在50 mA范圍內(nèi)不受電流影響, 主要由活性污泥脫氮微生物去除.第1~41 d(第1階段)時(shí), R1與R3的出水TN濃度先快速降低到第20 d的9.91和7.01 mg·L-1, 隨后逐步升高到25.50和23.50 mg·L-1(第40 d).第1~20 d的TN去除率上升是由于R1與R3硝化反硝化微生物活性逐步升高, 該階段木質(zhì)素主要為污泥遞減吸附過(guò)程, 而從第20 d開(kāi)始, 由于降解木質(zhì)素的微生物活性逐步升高, 推測(cè)R1、R3系統(tǒng)中一定濃度的難降解的木質(zhì)素及其中間代謝產(chǎn)物抑制微生物的脫氮作用, 導(dǎo)致TN去除率降低并在第1階段結(jié)束時(shí)達(dá)到穩(wěn)定; R2的出水TN濃度在1~40 d與其出水氨氮濃度的變化趨勢(shì)相近.由圖 1c中R2在第1階段的氨氮出水濃度可以計(jì)算得出, 第1~40 d出水TN濃度中82.58%~97.88%是由氨氮構(gòu)成, 因此, 推測(cè)該階段R2的TN去除率(< 56%)主要是由于氨氮氧化受到限制引起.第2~4階段, R1與R3的出水TN濃度均穩(wěn)定在14.18~19.58 mg·L-1; 值得注意的是, 此時(shí)R2的TN去除率隨電流升高而顯著增強(qiáng), 為71.96%±5.79%, 出水TN濃度為(8.46±1.73) mg·L-1. R2的電極生物膜反硝化是一個(gè)電化學(xué)作用和生物反硝化作用相結(jié)合的過(guò)程, 即部分反硝化菌利用廢水中的有機(jī)物或者電解產(chǎn)生的H2為電子供體, 將NO3--N還原為N2.本研究中, 40 mA電流處理后期(75 d之后)及第5階段, 電流升高到50 mA以后, R2的TN去除率逐步降低并穩(wěn)定在50.77%±1.98%.這可能是高電流下, 反硝化菌的活性受到抑制, 也可能是超過(guò)最佳電流后, 陰極產(chǎn)生的氫過(guò)多, 在生物膜內(nèi)形成“氫抑制”現(xiàn)象, 抑制反硝化進(jìn)行.由于電極生物膜-活性污泥系統(tǒng)中, 影響脫氮的因素復(fù)雜, 包括環(huán)境條件(pH、溫度、溶解氧)、操作條件(碳源、C/N比、氮負(fù)荷、污泥量、運(yùn)行時(shí)間)、電極電化學(xué)參數(shù)、反應(yīng)器結(jié)構(gòu)、群落結(jié)構(gòu)等因素, 因此, R2的TN去除率高于R3的原因及機(jī)理差異有待進(jìn)一步探討.

　　綜上, 30 mA電流條件下, 在污泥負(fù)荷為0.12 kg·kg-1·d-1時(shí), 電極生物膜-活性污泥反應(yīng)器(R3)木質(zhì)素去除率最高, 為活性污泥反應(yīng)器(R1)的2.01倍(p < 0.05);20~40 mA時(shí)電極生物膜反應(yīng)器(R2)總氮去除率最大, 為71.96%±5.79%.

　　3.2 電流強(qiáng)度對(duì)活性污泥微生物活性的影響

　　漆酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(LiP)和錳過(guò)氧化物酶(MnP)是最常見(jiàn)的木質(zhì)素降解酶.目前, 關(guān)于細(xì)菌降解木質(zhì)素產(chǎn)MnP的報(bào)道非常少.LiP主要來(lái)源于真菌, 但最近有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌也可分泌LiP.在本研究中, 未檢出漆酶和錳過(guò)氧化物酶, 僅測(cè)出木質(zhì)素過(guò)氧化物酶.R1、R3反應(yīng)器的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(LiP)酶活變化情況如圖 2a所示.穩(wěn)定期R1(0 mA)活性污泥平均LiP酶活為(149.13 ±12.05) U·g-1(以protein計(jì), 下同)(第31~101 d平均值).隨著電流增加, R3活性污泥中的LiP酶活呈先增后降趨勢(shì), 酶活峰值出現(xiàn)在20 mA時(shí).10 mA時(shí), R3活性污泥LiP酶活平均為(175.16±0.01) U·g-1, 略高于對(duì)照組R1, 但其木質(zhì)素去除率為R1的1.69倍; 電流升高到20 mA時(shí), LiP酶活高達(dá)(435.82±3.09) U·g-1, 但此時(shí)木質(zhì)素去除率僅提高2%;30 mA時(shí)LiP酶活降為(358.07±11.37) U·g-1, 木質(zhì)素去除率卻升高到最大值30.19%±0.47%;相比于10 mA電流條件下, 40 mA和50 mA時(shí)的LiP平均酶活雖較高(p < 0.05), 但其木質(zhì)素去除率卻較低.由此可見(jiàn), 木質(zhì)素去除率受LiP酶活影響較弱.

 　　微生物活菌比可以用來(lái)判定活性污泥在受到電流脅迫下細(xì)胞膜的損傷程度(圖 2a).R3各電流下的活性污泥活菌比(70.80%±2.67%、73.92%±3.15%、72.80%±2.70%、74.32%±2.28%、70.08%±3.89%、74.95%±0.37%)相比于R1(66.85%±2.12%)有所上升, 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明, 不同電流強(qiáng)度下并無(wú)顯著性差異(p > 0.05).這表明在10~60 mA的外加電流下, 反應(yīng)器里面的大部分細(xì)菌的細(xì)胞膜都很完整, 未出現(xiàn)大量細(xì)菌的凋亡.

　　在直流電場(chǎng)的處理過(guò)程中, ATP含量可以作為評(píng)價(jià)微生物代謝活性的生物指標(biāo)(.R1、R3反應(yīng)器的ATP含量變化情況如圖 2b所示, 穩(wěn)定期R1(0 mA)活性污泥ATP含量為(5.74±0.14) μg·g-1(以MLSS計(jì), 下同)(第31~101 d平均值); 10 mA時(shí), R3活性污泥的ATP含量最高, 為(7.81±0.04) μg·g-1; 其次是20 mA與30 mA時(shí), 分別為(5.84±0.01)和(5.58±0.18) μg·g-1; 而40、50、60 mA時(shí)ATP含量分別為(3.50±0.19)、(4.02±0.34)和(3.77±0.1) μg·g-1, 顯著低于R1 (p < 0.05).說(shuō)明30 mA以?xún)?nèi)不會(huì)影響微生物代謝活性, 而過(guò)高的電流強(qiáng)度則會(huì)抑制微生物代謝活性.Wang等的研究表明, 利用微生物電解池(MEC)處理高硫酸鹽廢水時(shí), 與控制組相比, 0.5 mA時(shí)ATP含量增加, 2.5 mA和3.5 mA時(shí), ATP含量急劇下降, 與本研究結(jié)論類(lèi)似.

　　比耗氧速率(SOUR)可作為表征污泥活性的重要指標(biāo), 從微生物呼吸速率角度反映活性污泥生理狀態(tài)和基質(zhì)代謝狀況.R1、R3反應(yīng)器的SOUR變化情況如圖 2b所示, 穩(wěn)定期R1(0 mA)活性污泥SOUR為(1.26±0.05) mg·g-1·min-1(以每g MLSS每分鐘消耗的O2量(mg)計(jì), 下同) (第31~101 d平均值), 10 mA時(shí), R3活性污泥的SOUR升高, 為(1.38±0.01) mg·g-1·min-1, 20 mA與30 mA時(shí)SOUR繼續(xù)升高, 分別為(1.75±0.02)和(1.85±0.06) mg·g-1·min-1, 40、50、60 mA時(shí)R3活性污泥SOUR降低, 分別為(1.31±0.01)、(1.2±0.03)、(1.33±0.04) mg·g-1·min-1.由此可見(jiàn), 不同電流下, 活性污泥SOUR變化趨勢(shì)與木質(zhì)素去除率基本一致.

　　綜上, 在懸浮污泥中, 隨著外加電流的增加(0~60 mA), LiP酶活、ATP、SOUR等活性指標(biāo)均呈先升后降趨勢(shì), 而活菌比則不受影響(p > 0.05).

　　3.3 電流強(qiáng)度對(duì)活性污泥微生物細(xì)胞膜磷脂脂肪酸的影響

　　不同電流強(qiáng)度下各組樣品的PLFA組成情況如表 1所示, 其中, 在各組樣品中PLFA組成成分含量均低于0.5%的因其含量過(guò)低而不具體列出, 磷脂脂肪酸的碳鏈長(zhǎng)度主要分布在C11~C20之間, 共檢測(cè)到20種類(lèi)型的磷脂脂肪酸, 其中, 占主要比重的磷脂脂肪酸為C15: 0 ANTEISO、C16: 00和C18: 00.R1(0 mA)活性污泥C15: 0 ANTEISO含量為23.12%.總體而言, 高電流下C15: 0 ANTEISO的含量(16.52%(40 mA)、24.06%(50 mA)、13.86%(60 mA))較低電流下含量低(24.55%(10 mA)、26.77%(20 mA)、25.62%(30 mA)).由于C15: 0 ANTEISO相比于其它支鏈脂肪酸具有較低的相變溫度(23 ℃, 因此, 微生物可以更好地維持其流動(dòng)性.另外, 60 mA條件下檢測(cè)出的磷脂脂肪酸的碳鏈長(zhǎng)度變長(zhǎng)(C19、C20).Ma等的研究表明, 當(dāng)反應(yīng)器達(dá)到穩(wěn)定運(yùn)行階段時(shí), 長(zhǎng)鏈脂肪酸的含量增加(C原子數(shù)> 18).

　　表 1 不同電流下活性污泥整體PLFA情況

　　據(jù)Fang等報(bào)道, 外界環(huán)境條件影響微生物細(xì)胞膜不飽和脂肪酸的含量.圖 3反映了不同電流下活性污泥微生物細(xì)胞膜磷脂的組成情況.如圖 3a所示(其中, SFA、AFA、IFA、UFA、OFA分別代表飽和、反式異構(gòu)、異構(gòu)、不飽和和其他脂肪酸), R1活性污泥不飽和脂肪酸的含量為2.22%.高電流(40~60 mA)下不飽和脂肪酸的含量(2.21%~4.17%)較低電流(10~30 mA)下不飽和脂肪酸的含量高(0.37%~1.78%).相反, 低電流(10~30 mA)下支鏈脂肪酸的含量(38.66%~41.53%)高于高電流(40~60 mA)下支鏈脂肪酸的含量(24.56%~39.95%).據(jù)報(bào)道, 支鏈脂肪酸含量的降低可能是一種防止細(xì)胞膜流動(dòng)過(guò)快的防御機(jī)制, 從而實(shí)現(xiàn)最優(yōu)生長(zhǎng). Nenninger等的研究表明, 主要長(zhǎng)鏈脂肪與主要短鏈脂肪酸的比值增大, 代表著細(xì)胞膜磷脂流動(dòng)性降低.如圖 3b所示, 本研究中, 主要長(zhǎng)鏈脂肪酸與主要短鏈脂肪酸分別為C18和C15, 總體而言, 高電流下C18/C15值(0.68~1.45)較低電流(0.66~0.69)高, 因此, 推測(cè)高電流下細(xì)胞膜磷脂流動(dòng)性可能降低.

 　　圖 4為不同電流強(qiáng)度下活性污泥PLFA組成主成分分析結(jié)果.PC1和PC2分別代表了63.9%和26.9%的差異, 結(jié)果主要分布在4個(gè)區(qū)域.主成分分析顯示, S1、S2、S3與空白之間的差異度較小, 其微生物細(xì)胞膜PLFA組成具有一定的相似性, 且以C14~C16支鏈脂肪酸為主; 另外3個(gè)區(qū)域分別代表了S4、S5、S6樣品, 其與空白組差異度相對(duì)較大.S4與其它樣品之間差異度最大, 其PLFA組成以C16和C18飽和脂肪酸為主; S5的PLFA組成以C15飽和脂肪酸與C17支鏈脂肪酸為主; S6的PLFA組成則以C18~C20為主.可見(jiàn)隨著電流的升高, 檢測(cè)出的磷脂脂肪酸的碳鏈長(zhǎng)度變長(zhǎng).

　　3.4 電流強(qiáng)度對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

　　通過(guò)16S rRNA基因高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)活性污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析, 結(jié)果如圖 5所示.由圖 5可知, R1(0 mA)活性污泥以變形菌門(mén)(Proteobacteria, 42.24%)為主, 其次為放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria, 27.24%).另外, 相對(duì)豐度低于10%的門(mén)類(lèi)微生物包括擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes, 9.22%)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria, 3.90%)、TM7(3.78%)、硝化螺菌(Nitrospira, 2.85%)等14個(gè)門(mén).高電流下放線(xiàn)菌門(mén)的相對(duì)豐度(20.74%(40 mA)、21.13%(50 mA)、23.13%(60 mA))低于低電流下的相對(duì)豐度(30.25%(10 mA)、39.39%(20 mA)、33.79%(30 mA)), 而變形菌門(mén)的相對(duì)豐度在高電流下增加(51.93%(40 mA)、51.21%(50 mA)、52.51%(60 mA)).據(jù)報(bào)道, 能夠降解木質(zhì)素的好氧細(xì)菌種類(lèi)較多, 目前主要集中在放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)等.本研究的結(jié)果表明, 低電流能夠促進(jìn)放線(xiàn)菌門(mén)豐度的增加, 而變形菌門(mén)則具有更高的電流耐受力.變形菌門(mén)是石油精煉、丙烯酸類(lèi)高聚物、制藥、乳清粉加工、鋼鐵和寵物食品加工等污水處理廠(chǎng)中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén).

 　　陰極和陽(yáng)極微生物群落結(jié)構(gòu)在門(mén)水平上差異較大.R2陰極微生物以變形菌門(mén)(Proteobacteria, 84.32%)為主, 除變形菌門(mén)占主體外, 其次是放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria, 11.89%)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes, 2.86%).而陽(yáng)極微生物則以放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria, 57.20%)為主, 其次是變形菌門(mén)(Proteobacteria, 30.81%)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes, 3.29%)和TM7(1.09%).R3陰極微生物以變形菌門(mén)(Proteobacteria, 90.55%)為主, 其次是放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria, 8.18%).陽(yáng)極微生物以放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria, 54.90%)為主, 其次是變形菌門(mén)(Proteobacteria, 29.83%)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes, 2.99%)和酸桿菌門(mén)(Acidobacteria, 1.20%).可見(jiàn)R2、R3反應(yīng)器電極微生物在門(mén)水平上相似度較高.陰極微生物群落結(jié)構(gòu)均較單一, 且以變形菌門(mén)為主, 而陽(yáng)極則以放線(xiàn)菌門(mén)為主.目前, 在微生物燃料電池研究中發(fā)現(xiàn)的大部分具有細(xì)胞外電子傳遞功能的微生物都屬于變形菌門(mén).已有研究表明, 由于陰極反應(yīng)將造成電極表層的氧氣濃度降低甚至變成厭氧區(qū), 因此, 會(huì)造成電極表面持菌量下降, 這可能是陰極表面微生物群落結(jié)構(gòu)單一的原因.

　　如圖 6所示, 在屬水平上, R1(0 mA)的優(yōu)勢(shì)微生物(相對(duì)豐度> 0.20%)包括Micropruina(17.88%, 放線(xiàn)菌門(mén))、TM7_genera_incertae_sedis(3.78%, TM7門(mén))、Nakamurella(2.90%, 放線(xiàn)菌門(mén))、Nitrospira(2.85%, 硝化螺菌)、Microlunatus(1.44%, 放線(xiàn)菌門(mén))、Amaricoccus(1.37%, 變形菌門(mén)).總體而言, R3活性污泥在高電流下的Micropruina相對(duì)豐度(12.24%(40 mA)、13.23%(50 mA)、12.76%(60 mA))較低電流下的相對(duì)豐度低(23.11%(10 mA)、33.76%(20 mA)、27.57%(30 mA)).而高電流下Nakamurella的相對(duì)豐度(4.28%(40 mA)、3.35%(50 mA)、4.86%(60 mA))則高于低電流下的相對(duì)豐度(2.05%(10 mA)、2.19%(20 mA)、2.77%(30 mA)).已有研究表明, 在以葡萄糖為碳源時(shí), Nakamurella和Micropruina能在細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存大量的糖類(lèi)聚合物, 進(jìn)而成為優(yōu)勢(shì)菌.Amaricoccus相對(duì)豐度隨著外加電流的增加大致呈上升趨勢(shì)(1.75%(10 mA)、3.09%(20 mA)、3.92%(30 mA)、3.80%(40 mA)、5.45%(50 mA)、6.12%(60 mA)).在適當(dāng)?shù)碾娏鲝?qiáng)度下, Nitrospira相對(duì)豐度增加, 20、30 mA時(shí)其相對(duì)豐度較高, 分別為3.44%和3.47%.Nitrospira屬于亞硝酸氧化菌, 與處理裝置的硝化功能直接有關(guān).Nitrospira相對(duì)豐度的增加體現(xiàn)了反應(yīng)器硝化能力的提高.TM7相對(duì)豐度在外加電流下降低, 各電流下其相對(duì)豐度均低于1%.在10 mA電流下, Flavobacterium(6.16%)、Pseudomonas(13.89%)和Janthinobacterium(5.93%)相對(duì)豐度顯著高于R1(0.17%、0.11%、0.05%).Flavobacterium為革蘭氏陰性菌, 屬擬桿菌門(mén), 是一類(lèi)能夠降解木質(zhì)素的非絲狀細(xì)菌.該菌屬被認(rèn)為具有電化學(xué)活性, 相關(guān)報(bào)道較少, 目前用于燃料電池氧化還原酶活性指示菌.Pseudomonas為革蘭氏陰性菌, 屬Gamma變形菌, 據(jù)李海濤等的研究, Pseudomonas菌屬可降解低分子量木質(zhì)素, 曾被報(bào)道具有很高的電子傳遞能力, 是目前微生物燃料電池(MFC)中研究最多的功能菌屬之一.Janthinobacterium是一種革蘭氏陰性土壤細(xì)菌, 具有不同的能量代謝能力, 耐寒、耐紫外線(xiàn)及其他的環(huán)境壓力.

 　　陰極和陽(yáng)極微生物群落結(jié)構(gòu)在屬水平上差異較大.R2陰極優(yōu)勢(shì)微生物(相對(duì)豐度 > 0.20%)包括Methyloversatilis(37.07%, 變形菌門(mén))、Micropruina(9.16%, 放線(xiàn)菌門(mén))、Aquimonas(9.12%, 變形菌門(mén))、Haliscomenobacter(1.16%, 擬桿菌門(mén)); 陽(yáng)極優(yōu)勢(shì)微生物(相對(duì)豐度 > 0.20%)包括Micropruina(27.69%, 放線(xiàn)菌門(mén))、Nakamurella(14.42%, 放線(xiàn)菌門(mén))、Pseudomonas(8.24%, 變形菌門(mén))、Thauera(1.99%, 變形菌門(mén))、Mycobacterium(1.73%, 放線(xiàn)菌門(mén))、Ralstonia(1.28%, 變形菌門(mén))、Pseudonocardia(1.12%, 放線(xiàn)菌門(mén))、TM7_genera_incertae_sedis(1.09%, TM7門(mén)).R3陰極優(yōu)勢(shì)微生物(相對(duì)豐度 > 0.20%)包括Micropruina(5.66%, 放線(xiàn)菌門(mén))、Nakamurella(1.15%, 放線(xiàn)菌門(mén)); 陽(yáng)極優(yōu)勢(shì)微生物(相對(duì)豐度 > 0.20%)包括Micropruina(24.32%, 放線(xiàn)菌門(mén))、Nakamurella(19.14%, 放線(xiàn)菌門(mén))、Amaricoccus(4.44%, 變形菌門(mén))、Mycobacterium(3.04%, 放線(xiàn)菌門(mén))、Microlunatus(2.60%, 放線(xiàn)菌門(mén))、Bradyrhizobium(1.41%, 變形菌門(mén)).R2、R3反應(yīng)器陰極微生物在屬水平上差異較大.Methyloversatilis是專(zhuān)性甲基利用型微生物, Zhang等(研究發(fā)現(xiàn), 在混合營(yíng)養(yǎng)的反硝化生物反應(yīng)器中, 異養(yǎng)的Methyloversatilis和Thauera菌成為優(yōu)勢(shì)菌屬.R2陰極微生物中Methyloversatilis是優(yōu)勢(shì)菌屬, 這可能是R2反應(yīng)器第2~4階段脫氮效率高的原因.R2、R3陽(yáng)極微生物在屬水平上差異較小, 其中, R2反應(yīng)器中Pseudomonas和Ralstonia菌屬成為優(yōu)勢(shì)菌屬, 且均被報(bào)道具有很高的電子傳遞能力.可見(jiàn)與R3相比, R2陽(yáng)極微生物中存在更多具有電子傳遞能力的菌屬.

　　3.5 微生物群落與PLFA組成和電流強(qiáng)度的相關(guān)性分析

　　冗余分析(RDA)被用來(lái)研究微生物群落與PLFA組成和電流強(qiáng)度之間的關(guān)系(圖 7).RDA1和RDA2分別可以代表 61.5%和32.6%的總差異.電流I與Gemmatimonas、Methylotenera、Gp4、Mycobacterium、Amaricoccus、Nakamurella和Bradyrhizobium顯著正相關(guān)(p < 0.05);飽和脂肪酸(SFA)與Zoogloea顯著正相關(guān)(p < 0.05);不飽和脂肪酸(UFA)與Mycobacterium、Nakamurella顯著正相關(guān)(p < 0.05), 與Micropruina顯著負(fù)相關(guān)(p < 0.05);反式異構(gòu)脂肪酸(AFA)與Micropruina顯著正相關(guān)(p < 0.05), 與Nakamurella顯著負(fù)相關(guān)(p < 0.05).這些菌屬隨著電流強(qiáng)度的不同, 其相對(duì)豐度均發(fā)生了較大的變化.且已有研究表明, Mycobacterium是一類(lèi)能夠降解木質(zhì)素的好氧細(xì)菌, 而其相對(duì)豐度與電流大小顯著正相關(guān)(p < 0.05), 可見(jiàn)隨著外加電流的增大, 其相對(duì)豐度增加.綜上可以看出, 不同電流馴化出不同的微生物群落, 進(jìn)而對(duì)微生物細(xì)胞膜PLFA組成產(chǎn)生了影響, 二者的變化是影響出水水質(zhì)的重要原因.RDA分析顯示, 各樣品間有較明顯的差異, S1與各樣品間差異均較大, S2與S3樣品間差異較小, S4、S5、S6間差異較小, 空白與S1~S6之間的差異度均較大.

 　　4 結(jié)論

　　1) 30 mA電流條件下, 電極生物膜-活性污泥反應(yīng)器(R3)木質(zhì)素去除率最高, 為活性污泥反應(yīng)器(R1)的2.01倍(p < 0.05).

　　2) 外加電流會(huì)影響活性污泥微生物的細(xì)胞膜磷脂組成, 高電流(40~60 mA)與低電流(10~30 mA)相比, 微生物細(xì)胞膜磷脂流動(dòng)性可能降低.

　　3) 外加電流會(huì)改變活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu), R3的懸浮污泥中Flavobacterium、Pseudomonas、Janthinobacterium等可降解木質(zhì)素的菌屬在外加電流的刺激下, 其相對(duì)豐度均有所上升.無(wú)接種污泥的R2反應(yīng)器陽(yáng)極微生物中存在更多具有電子傳遞能力的菌屬.具體聯(lián)系污水寶或參見(jiàn)http://www.dongaorq.cn更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　4) Mycobacterium是一類(lèi)能夠降解木質(zhì)素的好氧細(xì)菌, 其相對(duì)豐度與電流大小顯著正相關(guān)(p < 0.05), 與不飽和脂肪酸(UFA)顯著負(fù)相關(guān)(p < 0.05).