在污水生化處理單元，硝化細菌在生物脫氮中發揮著核心作用，并且在整體的污水脫氮處理流程中占據著重要的地位。因此，硝化細菌的活性及其群落密度直接決定了污水處理脫氮效率的高低。然而，硝化菌是一類具有硝化作用的自養化能細菌，世代周期較長，細胞產率較低，對溫度、pH、溶解氧(dissolvedoxygen,DO)等環境因子敏感，因此在常見的污水處理系統中，硝化菌含量較低，不利于維持高脫氮速率。在垂直潛流人工濕地(verticalsubsurfaceflowconstructedwetland,VSSFCW)中反硝化過程較為徹底，但硝化過程則相反，其主要限制因素是DO和硝化菌數量，同時人工濕地在實際應用中還存在啟動速度慢等問題。因此研究有效的方法富集培養硝化細菌，以及探索提高人工濕地脫氮效能和啟動速度的技術，對于環境保護和可持續發展具有重要意義。
目前硝化菌的富集方式主要有純菌擴大培養法、活性污泥富集法以及載體固定法。培養工藝上，主要包括序批式活性污泥法(sequencingbatchreactor,SBR)、厭氧好氧法(anaerobic-oxicprocess,A/O)、周期循環活性污泥法(cyclicactivatedsludgesystem,CASS)、膜生物反應器(membranebio-reactor,MBR)。在培養方式上，主要分為含有有機碳源的高氨氮培養和無機碳源的高氨氮培養。當前硝化菌的富集培養研究中表現較好的是活性污泥法配合無機碳源高氨氮培養模式，孫金鳳、李紅巖等通過小試的MBR工藝采用無機碳源培養高硝化活性的污泥，并對其進行鑒定和保存，結果表明，MBR工藝富集的硝化菌的硝化活性明顯高于SBR和CASS工藝。目前在人工濕地啟動過程中，通常會在人工濕地中投加外源微生物，以達到提升人工濕地在特定條件下的運行效果或者對某種污染物的去除效果，減少人工濕地啟動時間的目的。楊明輝等人在人工濕地中投加耐低溫復合菌劑，提升了人工濕地在低溫條件下對污染物的去除效果；林梓楊等人在人工濕地中投加電活性菌藻膜生物膜，以微生物燃料電池的形式強化人工濕地，明顯的提升了人工濕地對污染物去除效果。在實驗小試條件下，徐麗娟等將回流污泥訓化后并用于小試人工濕地的啟動，實現了20d成功掛膜，FU等采用人工濕地堵塞物進行濕地掛膜，實現了比未添加堵塞物濕地更快啟動和更高的污染物去除效果，相對的全爽等、岳琛等采用自然掛膜方法啟動人工濕地啟動時間均默認為30d，但啟動時間過后，系統并未穩定。由此可以看出在人工濕地中投加外源微生物，可以有效的減少啟動時間，并提升人工濕地在特定條件下的運行效果或者對某種污染物的去除效果。但迄今為止，在VFSSCW中投加高硝化活性污泥，提升VFSSCW的硝化能力并提升啟動速率的研究尚未報道，提升效果及機理尚不清晰。
本研究中，我們采用MBR裝置富集硝化菌，并根據硝化菌的好氧自養特性采用純無機碳源高氨氮培養富集，以期在短時間內迅速提高活性污泥的硝化活性，然后將高硝化活性污泥和異養錳氧化菌投加進中試人工濕地，其中錳氧化菌為好氧異養型微生物，并作為參與濕地內錳循環的功能菌加入人工濕地，模擬人工濕地啟動階段多種且有競爭的功能菌加入的情況，最后在人工濕地中單獨加入錳氧化菌，模擬人工濕地面對外界微生物沖擊的不利條件，研究人工濕的快速啟動和脫氮能力的變化，為實際人工濕地工程的快速啟動和高效脫氮提供理論依據。
1、材料與方法
1.1 實驗裝置
硝化菌富集采用MBR工藝，MBR裝置的有效容積為250L(L=750cm，W=620cm，H=100cm)，亞克力材質，內置中空纖維膜，底部安裝曝氣裝置（圖1）。中空纖維膜面積為30m2(南昌拓延科技有限公司HPR-MBR-1-30、改性聚偏氟乙烯、膜過濾孔徑為0.1μm、膜通量為10~20L·(m2·h)−1、跨膜壓差為2~5kPa)。曝氣通過穿孔曝氣管和曝氣盤等設備，以維持足夠的DO濃度。MBR裝置主要由進水稀釋、間歇式出水控制、培養池、曝氣裝置和pH控制5部分模塊組成。通過空氣泵對培養池進行充分曝氣，使反應器內DO的質量濃度大于2mg·L−1。以pH控制器作為pH的監測響應裝置，協同堿泵及時補充碳酸氫鈉，將培養池內的pH控制在7~8之間。以液位控制器作為監測響應裝置，控制出水泵將MBR裝置中的水通過中空纖維膜排出，以控制水力停留時間（hydraulicretentiontime,HRT），并保持污泥留在培養池內。試驗的活性污泥源自北京某污水處理廠MBR池污泥。
1.2 實驗方法
1）裝置運行工況控制。
以連續式進水、間歇式出水、不排泥的培養方式對硝化菌進行快速富集培養。設置HRT為20h，DO質量濃度大于2mg·L−1，pH控制在7~8。進水采用純無機培養基，不添加任何有機碳源；通過提高進水中硫酸銨的濃度來提高系統氨氮負荷，以達到刺激硝化菌生長，獲取高濃度硝化菌的目的。磷酸二氫鉀用于提供硝化菌生長所必需的磷元素，碳酸氫鈉用于維持反應器pH和碳源補充，同時為確保硝化菌富集生長的需要，加入適當微量元素。實驗整體分為3個階段。第1階段為適應階段，進水氨氮質量濃度從50mg·L−1逐漸提升到200mg·L−1。第2階段為快速富集階段，進水氨氮質量濃度從200mg·L−1逐漸提升到800mg·L−1。第3階段為穩定階段。進水氨氮質量濃度維持在500~600mg·L−1。培養液進水配置：硫酸銨質量濃度236~7550mg·L−1，磷酸二氫鉀質量濃度87.8mg·L−1，二水氯化鈣質量濃度5mg·L−1，六水氯化鐵質量濃度2mg·L−1，硼酸質量濃度0.072mg·L−1，硫酸銅質量濃度0.025mg·L−1，七水硫酸鋅質量濃度0.74mg·L−1，鉬酸質量濃度0.0037mg·L−1。
2）硝化活性測試實驗。
硝化活性的測量采用氨氮的降解速率（Ammonia-UtilizationRate,AUR）來表示，根據式(1)進行計算。取培養池中的泥水混合體2L，通過抽濾將泥水分離，將分離的污泥倒入5L量杯中，加入2L的蒸餾水混合均勻，在水浴加熱中控制水溫維持在20~25℃。然后，對混勻泥水進行曝氣15min，充分消耗污泥內殘留的氨氮，并控制DO在2mg·L−1以上。隨后加入硫酸銨控制氨氮質量濃度在200mg·L−1左右，以及磷酸二氫鉀和微量元素。曝氣2~3min后，開始每隔30min的采樣和測試氨氮濃度。實驗期間，實時監測pH，并加入碳酸氫鈉維持pH在7~8。
式中：R為單位時間內氨氮的去除量(AUR)，mg·(L·h)−1(以NH4+計)；C1和C2分別為反應時間內氨氮進、出水的質量濃度，mg·L−1；t1和t2分別為反應起始和結束時間，min。
1.3 人工濕地氨氮去除效率測試實驗
本研究搭建了2組垂直潛流人工濕地系統，長寬高分別為50、50和80cm，HRT設置為2d。兩組人工濕地系統從上到下分別為以下3層：1）植物生長層，種植植物為蘆葦，填充火山巖和水廠熟料（無煙煤或石英沙），粒徑分別為0.5~1cm和0.2~0.4cm，填充高度10cm；2）功能填料層，分別為火山巖（火山巖-CW）和鐵錳礦石（礦石-CW），粒徑為1~2cm，高度為50cm；3）襯底層高度為10cm，填充2~3cm的礫石(圖2)。人工濕地進水是模擬污水處理廠一級B標準水質的配置污水。濕地正常運行后進行功能菌接種，包含本研究富集培養的高硝化活性硝化菌，以及異養微生物錳氧化菌；接種方式為直接添加硝化污泥的泥水混合液300mL以及含錳氧化菌的培養液200mL，每3d接種1次。人工濕地進水水質：COD質量濃度60mg·L−1，氨氮質量濃度8mg·L−1，硝酸鹽氮質量濃度14mg·L−1，總磷1mg·L−1。
1.4 微生物組成分析
為研究富集后污泥和人工濕地內接種后的微生物種群結構組成以及硝化菌的種類，取經過沉降后活性污泥樣品以及實驗結束后人工濕地上層功能填料的樣品，保存在−80℃的冰箱里中，高通量測序委托上海美吉生物科技公司完成。1.5水質檢測方法根據相關國家標準和行業標準對常規水質指標進行測定，進出水氨氮濃度采用納氏試劑分光光度法（HJ535-2009）進行檢測；出水亞硝酸鹽氮濃度采用N-1-萘基-乙二胺分光光度法（GB7493-87）進行檢測；硝酸鹽氮采用紫外分光光度法檢測（HJ/T346-2007）進行檢測；pH采用米科pH在線控制器進行監測；溫度采用電子溫度數顯計測定；DO采用ODEON便攜式水質分析進行檢測。
2、結果與討論
2.1 MBR裝置性能
不同階段MBR裝置的進出水氨氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽的濃度、水溫以及DO的變化情況如圖3所示。在裝置的整個運行期間，氨氮去除率穩定在90%以上，出水基本不存在亞硝酸鹽氮積累問題。第2階段進水氨氮質量濃度由200mg·L−1提升到800mg·L−1，DO質量濃度從初期的5mg·L−1左右逐漸下降到1~2mg·L−1，表明硝化菌快速富集加速了對DO的利用。在DO質量濃度下降到2mg·L−1以下時，出水的硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮均出現了波動。通過調整曝氣參數，使DO質量濃度維持在2mg·L−1左右。相比之下，尹子華采用小試MBR裝置富集硝化菌，進水中含有一定濃度的有機碳源以及較短的HRT（4h），出現出水氨氮不穩定以及亞硝酸鹽氮波動等問題。DO的下降反映出該培養池內污泥對DO的需求變化，結合進出水氨氮和亞硝酸鹽氮的指標分析，培養池內的DO降低反映出硝化菌在培養池內的濃度逐漸增加。
2.2 MBR裝置硝化活性監測
MBR裝置中硝化污泥的硝化活性如圖4所示。接種后培養第20d，硝化活性為28mg·(L·h)−1(以NH4+計)。隨著進水氨氮濃度的增加，硝化活性也逐漸增加。進入快速富集階段后，進水氨氮濃度接近800mg·L−1時，硝化活性顯著提高到最大值，為122mg·(L·h)−1(以NH4+計)，達到普通活性污泥的27倍，之后裝置運行進入穩定階段，硝化活性逐漸穩定在85mg·(L·h)−1(以NH4+計)。崔燦燦的中試MBR裝置富集培養硝化菌的過程中采用實際細格柵水質與培養液混合為進水，硝化菌最高硝化活性達到98.41mg·(L·h)−1(以NH4+計)左右，穩定的硝化活性在72.39mg·(L·h)−1(以NH4+計)。尹子華使用小試MBR裝置富集硝化菌，采用有機碳源的高氨氮模式培養硝化菌，進水氨氮質量濃度最高達到500mg·L−1左右，HRT為4h，硝化活性最高為108mg·(L·h)−1(以NH4+計)。相比之下，本研究進水氨氮質量濃度增至約800mg·L−1，HRT相應的增加到20h，進一步提升了水體中硝化菌的濃度，使得本研究富集的污泥的硝化活性相比于尹子華的結果提升近20%左右。這表明采用無機碳源的高氨氮培養模式，對于提升硝化菌的硝化活性具有極為重要的意義。
2.3 高硝化活性污泥微生物鑒定
高硝化活性污泥中的不同種類的硝化菌含量如圖5所示。污泥的鑒定結果表明，污泥中主要是Nitrosomonas屬的氨氧化菌（ammonia-oxidizingbacteria,AOB），鑒定出的細菌種為Nitrosomonasnitrosa、Nitrosomonassp.LT-4和Nitrosomonassp.ENI-11，其在Nitrosomonas屬的硝化菌中的占比分別為39.9%、31.2%和28.9%。有研究發現，AOB的主要菌屬Nitrosomonas是屬于r-策略細菌，具有增長迅速、生長周期長、耐變性高和競爭性強的特點。而亞硝酸鹽氧化菌（nitrite-oxidizingbacteria,NOB）的主要菌屬Nitrospira是屬于k-策略細菌，具有增長慢、生長周期長、耐變性低和競爭性弱的特點。此外，有研究表明，Nitrosomonas有著相對較高的基質半飽和常數以及較弱的基質親和力，同時其擁有較高的氧親和力，因此，Nitrosomonas更容易成為富集系統內優勢AOB。
2.4 硝化污泥強化人工濕地
人工濕地微生物接種分為3個階段：第1階段為高硝化活性硝化菌和錳氧化菌共同接種階段，模擬人工濕地啟動過程中投加多種且相互存在競爭的功能菌群的情況；第2階段為錳氧化菌強化接種階段，模擬人工濕地功能菌接種完成后，面對外界具有競爭性的微生物沖擊情況；第3階段為穩定運行階段。2組人工濕地從接種到運行穩定進出水氨氮濃度變化情況如圖6所示。可見，2組不同填料的人工濕地均表現出對氨氮的高效去除能力。第1階段接種了高硝化活性硝化菌和錳氧化菌后35d，出水平均氨氮濃度達到0.5mg·L−1，氨氮去除率達到93.8%。在第2階段，硝化菌停止接種，繼續接種錳氧化菌，接種45d，增大錳氧化菌與濕地內好氧菌群之間的氧氣競爭，在此階段出水氨氮出現明顯提高，平均氨氮質量濃度從0.2mg·L−1增加到最高2.5mg·L−1。但此時氨氮去除率最低仍然在67.5%以上，在此階段火山巖-CW具有67.5%-79.5%的氨氮去除率，礦石-CW的氨氮去除率持續降低到49.2%。火山巖-CW相比于礦石-CW在第二階段表現出更低的出水氨氮濃度，在第2階段末期，火山巖-CW的出水氨氮質量濃度從2.5mg·L−1降低到1.6mg·L−1，而礦石-CW出水氨氮質量濃度則持續升高，最高達到了3.8mg·L−1。進入第3階段，硝化菌的高硝化活性影響逐漸凸顯，人工濕地在10d內明顯恢復了對氨氮的去除效率。穩定階段后出水氨氮迅速降低，出水氨氮平均去除率從68.8%增加到98%以上。鄒銘等在含有鐵錳礦石填料的小試人工濕地中接種了二沉池污泥，HRT為1d，對于低污染水質氨氮的去除率只有67.1%。于越等在不同填料的人工濕地處理污水處理廠尾水的小試實驗中，水力負荷0.4m·d−1，采用自然接種微生物的方法，人工濕地系統在曝氣的情況下氨氮的去除率最高達到80%。由此可見，相比于未接種高硝化活性硝化菌的人工濕地，接種了高硝化活性硝化菌的人工濕地能實現脫氮的快速啟動，實現對氨氮的高效去除，并具有一定的抗沖擊的能力。
2.5 人工濕地中硝化菌微生物群落分析
根據接種了高硝化活性污泥的人工濕地中上層填料的微生物測序，測序結果中硝化菌含量如圖7所示。檢測出與硝化菌有關的菌屬有兩類，分別為與AOB有關的Nitrosomonas屬和與NOB有關的Nitrospira菌屬。這兩類菌屬在火山巖-CW中的占比分別為5.5%和2.5%，在礦石-CW中的占比分別為2.1%和1.4%。對比而言，NOB在人工濕地系統中的含量低于AOB，與接種的活性污泥相比，NOB在人工濕地中上層填料中的含量占比有所提升。Nitrospira作為一種常見的k-策略菌，有著較強的基質親和力和較低的基質半飽和常數，同時有著較強的DO親和力，因此對低濃度NO2−和DO都有著較強的適應。根據人工濕地中硝化菌群的占比發現，在火山巖-CW中硝化菌群占微生物總群落的8.1%，在礦石-CW中硝化菌群占微生物總群落的3.5%。沈寶進采用自然掛膜的方法為人工濕地掛膜，在不同填料的濕地中硝化菌群落豐度最高為2.1%；李超予采用稀釋的厭氧污泥為人工濕地掛膜，在不同功能填料的人工濕地中硝化菌群落豐度最高為2.2%。相比于沈寶進、李超予的人工濕地實驗，本研究在人工濕地中接種高硝化活性污泥，濕地中的硝化菌群落豐度有明顯增加，從提升硝化菌在濕地中群落豐度的途徑進一步提升了人工濕地的硝化能力。
3、結論
1）本研究采用MBR裝置，通過無機碳源以及逐級提高氨氮濃度實現了高活性硝化菌的快速富集。進水氨氮濃度為800mg·L−1，HRT=20h時，能有效去除氨氮和亞硝酸鹽氮。在DO降低的限制下，最高硝化活性仍然能達到122mg·(L·h)−1(以NH4+計)，是普通活性污泥的27倍，穩定期污泥的硝化活性能達到85mg·(L·h)−1(以NH4+計)左右，證明無機碳源高氨氮培養模式在提高硝化菌的硝化活性方面具有重要意義。
2）對硝化污泥的菌種鑒定結果可知，在硝化污泥里，優勢種群是與AOB存在關聯且屬于Nitrosomonas屬的硝化細菌，其中Nitrosomonasnitros占比39.9%，Nitrosomonassp.LT-4占比31.15%，Nitrosomonassp.ENI-11占比28.87%。
3）在人工濕地啟動階段接種高硝化活性的硝化菌和其他具有競爭性的功能微生物，短期(35d)就能夠實現出水氨氮質量濃度降低到0.5mg·L−1，氨氮去除率達到93.8%，在面對不良條件沖擊結束后，10d內兩組人工濕地均恢復了對氨氮的高效去除，去除效率達到98%以上。硝化菌在火山巖填料和礦石填料中的占比分別為8.1%和3.5%，在人工濕地的啟動階段，投加具有高硝化活性的污泥，有助于提升系統內部硝化菌群落的豐度，強化系統對氨氮的去除以及整體的脫氮能力，特別是在遭遇外界沖擊時，能夠迅速恢復脫氮功能。（來源：桂林理工大學環境科學與工程學院，清華大學環境學院，清華大學水質與水生態研究中心）
